正交試驗對密蒙花總黃酮分離純化工藝的優(yōu)化

潘喬丹++韋沛琦++黃元河++陸海峰++韋仲廣++黎斯敏++黃鎖義

摘要：優(yōu)選密蒙花（Buddleja officinalis Maxim）總黃酮的分離純化工藝條件。以總黃酮含量為指標，通過靜態(tài)和動態(tài)試驗確定較佳樹脂，并通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化密蒙花中總黃酮的分離純化工藝。結果表明，采用AB-8型吸附樹脂純化效果較佳，其優(yōu)化的密蒙花總黃酮分離純化工藝為上樣濃度2.24 mg/mL，用3 BV 50%乙醇洗脫，洗脫流速為1.5 mL/min；處理后所得干膏中總黃酮的純度為71.31%。其優(yōu)選的工藝條件簡單可行，可為工業(yè)化純化密蒙花總黃酮提供參考。

關鍵詞：密蒙花（Buddleja officinalis Maxim）；總黃酮；正交試驗；分離純化

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）22-5894-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.042

The Technology of Separation and Purification of Total Flavones from Buddleja officinalis Maxim by Orthogonal Experiment

PAN Qiao-dan， WEI Pei-qi， HUANG Yuan-he， LU Hai-feng， WEI Zhong-guang， LI Si-min， HUANG Suo-yi

（Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China）

Abstract： To optimize the technology of separation and purification of total flavones from Buddleja officinalis Maxim. With the content of flavones as index， the optimum resin was determined by static experiments and dynamic experiments， and the technology of separation and purification of total flavones from Buddleja officinalis Maxim was investigated by single factors test and orthogonal test. The results showed that AB-8 macroporous adsorption resin had better purification effect than others. The optimized technology of separation and purification of total flavones from Buddleja officinalis Maxim were found to be a sample concentration of 2.24 mg/mL， elution with 3BV 50% ethanol， and flow rate of 1.5 mL/min. After purification， the total flavones of extractum was up to 71.31%. The optimal technology was simple and practicable， which would provide reference for the industrial separation and purification of total flavones from Buddleja officinalis Maxim.

Key words： Buddleja officinalis Maxim； total flavones； orthogonal experiment； separation and purification； optimization

密蒙花（Buddleja officinalis Maxim）又名小錦花、蒙花、黃飯花等，為馬錢科植物密蒙花的干燥花蕾及花序。其味甘，性微寒，有清熱養(yǎng)肝、明目退翳之功，用于治療目赤腫痛、肝虛目昏、視物昏花等病癥[1]。密蒙花中含有的黃酮類化合物主要有刺槐素、木犀草素、芹菜素、蒙花甙、密蒙花新甙、木犀草素-7-O-葡萄糖甙、木犀草素-7-O-蕓香糖甙、秋英甙、芹菜素-7-O-蘆丁糖甙等[2，3]。具有類雄激素作用、抗炎、降血糖、免疫調節(jié)、抗菌、抗氧化和抗腫瘤等作用，目前主要運用于干眼癥、糖尿病和糖尿病視網(wǎng)膜病變以及腫瘤等疾病[4]。本試驗采用靜態(tài)吸附和動態(tài)吸附方法優(yōu)選出較佳樹脂，并通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化密蒙花總黃酮的分離純化工藝，為開發(fā)密蒙花資源及其總黃酮制劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

密蒙花采于廣西百色，干燥粉碎后備用；蘆丁標準品由中國藥品生物制品檢定所提供，批號為100080-200707；AB-8和D-101大孔樹脂由河北滄州寶恩化工有限公司提供，聚酰胺樹脂由上海潤捷化工公司出品提供；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

TU-1800型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；FA1004型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器廠）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇榮華儀器制造有限公司）；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱，KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標準曲線的繪制 將蘆丁標準品配制成不同的濃度，采用硝酸鋁顯色法[5，6]顯色后于分光光度計的510 nm波長處測吸光度，以吸光度A與濃度C進行直線回歸，得回歸方程為A=9.158 1C+0.0031 2，r=0.999 6。

1.3.2 密蒙花總黃酮的提取 稱取密蒙花粉末200 g，用石油醚（60～90 ℃）回流去脂2次，每次1 h，加75%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇至無液滴出現(xiàn)，制得密蒙花總黃酮提取液，冷藏備用。

1.3.3 密蒙花總黃酮含量測定 取樣品液稀釋到一定質量濃度，于510 nm處測定吸光度，按回歸曲線方程計算得樣品液中總黃酮的質量濃度為22.38 mg/mL（原藥材含量為476.19 mg/mL）。

1.3.4 大孔樹脂的預處理[7] 稱取AB-8、D-101和聚酰胺樹脂各200 g，用95%乙醇浸泡24 h，濕法裝柱，用95%乙醇沖洗至流出液不渾濁為止，再用蒸餾水沖洗至無醇味，用體積分數(shù)5%HCI溶液浸泡24 h，然后用蒸餾水沖洗至pH為中性，接著用體積分數(shù)5%的NaOH溶液浸泡24 h，最后用蒸餾水沖洗至pH為中性，晾干，備用。

2 結果與分析

2.1 靜態(tài)吸附行為的考察[8，9]

取已處理好的吸附樹脂各5 g（濕質量），置100 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入上樣液10 mL，振蕩24 h，濾過，濾液適當稀釋后測定吸光度，計算靜態(tài)吸附量和吸附率。在吸附飽和的樹脂中分別加入95%乙醇10 mL于錐形瓶中，振搖24 h，濾過，同法測定吸光度，計算濾液中總黃酮的質量濃度，并得到解吸量和解吸率，結果見表1。從表1可以看出，AB-8吸附樹脂的吸附率和解吸率均為最高，其靜態(tài)吸附密蒙花總黃酮為1.665 mg/g樹脂（濕質量）。

吸附量=（上樣液總黃酮質量-水洗液總黃酮質量）/樹脂質量

吸附率=（上樣液總黃酮質量-水洗液總黃酮質量）/上樣液總黃酮質量×100%

解吸量=醇洗液總黃酮質量/樹脂質量×100%

解吸率=醇洗液總黃酮質量/（上樣液總黃酮質量-水洗液總黃酮質量）×100%。

2.2 動態(tài)吸附行為的考察[10]

稱取吸附樹脂各5 g（濕質量）并濕法裝柱，加入已知濃度的上樣液，用蒸餾水洗至水洗液呈無色，再用95%的乙醇洗脫，收集洗脫液，分別測定水洗液和洗脫液中總黃酮的含量，計算樹脂吸附量、吸附率、解吸量及解吸率，結果見表2。結果表明，AB-8吸附樹脂對密蒙花總黃酮的吸附能力及洗脫能力均為最強，綜合靜態(tài)和動態(tài)的吸附、洗脫，AB-8吸附樹脂更適合分離純化密蒙花的總黃酮。

2.3 AB-8樹脂純化工藝條件的優(yōu)化

2.3.1 上樣液濃度的考察 將不同濃度的上樣液以相同體積分別通過6根AB-8吸附樹脂柱，用水洗至流出液近無色，收集流出液和水洗液，測定總黃酮含量，計算樹脂吸附率，考察上樣液對吸附效果的影響，結果見圖1。由圖1可知，隨著上樣液濃度的增加，總黃酮的吸附率逐漸增加，當上樣液濃度超過2.24 mg/mL后，AB-8吸附樹脂的吸附率變化不大，因此選擇2.24 mg/mL上樣液濃度進行優(yōu)化試驗。

2.3.2 洗脫速率的考察 稱取已處理好的樹脂6份裝柱，取一定的上樣量和上樣體積，考察洗脫液流速對解吸效果的影響，結果見圖2。由圖2可知，隨著洗脫液流速的增加，其解吸率先增加后下降，當洗脫液流速為2.0 mL/min時解吸率達到最大，因此選擇洗脫速率為2.0 mL/min左右進行優(yōu)化試驗。

2.3.3 洗脫劑濃度的選擇 稱取已處理好的樹脂5份，取一定體積的已知濃度的上樣液進行動態(tài)吸附。吸附完成后，先用水洗脫至流出液為無色，再依次用10%、30%、50%、70%、95%乙醇洗脫至流出液為無色。結果密蒙花總黃酮的洗脫量分別為0.273、3.073、3.580、3.696和3.797 mg/g，洗脫率分別為6.23%、70.34%、81.59%、84.57%和86.33%。從經(jīng)濟和安全方面考慮，取50%左右的乙醇為洗脫劑進行優(yōu)化試驗。

2.3.4 上樣量的考察 稱取已處理好的樹脂5.0 g，上樣液質量濃度為2.238 mg/mL，分段收集流出液共30份，每份5 mL，以總黃酮濃度為考察指標，繪制泄漏曲線（圖3）。當流出液中總黃酮濃度達到上樣液濃度的10%（0.223 8 mg/mL）時，稱為泄漏點。當上樣量為20 mL時，密蒙花總黃酮就已經(jīng)明顯泄漏了，因此確定最大上樣量為20 mL。

2.3.5 洗脫劑用量的選擇 將已處理好的樹脂5.0 g裝柱，上樣液質量濃度為2.24 mg/mL上樣液20 mL，用蒸餾水洗至無色，然后用30%乙醇洗脫，洗脫劑速率為2.0 mL/min，每份收集5 mL，共收集10份，以測定密蒙花總黃酮質量濃度為考察指標，繪制曲線，結果見圖4。由圖4可以看出，到第8份后，洗脫液中的總黃酮質量濃度已降得很低，說明總黃酮的洗脫已基本完全，此時洗脫劑用量為40 mL（約為5 BV），因而應取4 BV左右的洗脫劑用量進行優(yōu)化試驗。

2.4 正交試驗對AB-8樹脂純化工藝[11]的優(yōu)化

根據(jù)總黃酮的理化性質與大孔樹脂的吸附特點，再結合上述單因素的試驗結果，選取上樣濃度、洗脫劑濃度、洗脫劑用量、流速為因素，以干膏中的總黃酮含量為指標，設計L9（34）正交試驗，結果見表3。由表3可知，影響AB-8吸附樹脂純化密蒙花總黃酮工藝的因素依次為C>A>D>B。方差分析結果（表4）顯示，A（上樣濃度）、C（洗脫劑用量）和D（洗脫速率）對干膏中總黃酮含量影響極顯著（P<0.01）。其純化的最佳提取條件為A3B2C1D1，即上樣濃度為2.24 mg/mL，用3 BV 50%乙醇洗脫，洗脫流速為1.5 mL/min。按此最佳純化工藝條件重復操作3次，減壓濃縮后真空干燥，測得浸膏中總黃酮純度71.31%。

3 結論

密蒙花黃酮類化合物為密蒙花的主要有效成分，而用大孔吸附樹脂在分離純化中草藥的有效成分中具有富集有效成分、減少雜質和節(jié)約成本等方面的優(yōu)勢。本研究通過靜態(tài)試驗和動態(tài)試驗比較了AB-8、D-101和聚酰胺3種型號樹脂，選取較佳的AB-8大孔吸附樹脂，并通過單因素和正交試驗優(yōu)化密蒙花中總黃酮的分離純化工藝，其優(yōu)化的分離純化工藝為：上樣濃度為2.24 mg/mL，用3 BV 50%乙醇洗脫，洗脫流速為1.5 mL/min；處理后所得干膏中總黃酮的純度為71.31%，該工藝具有操作簡單、成本較低、生產(chǎn)周期短、無污染等優(yōu)點，適合應用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。

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