奧沙利鉑調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87生長(zhǎng)的作用研究①

段友強(qiáng) 劉義鋒 李 巍

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)外科，鄭州450007)

·基礎(chǔ)免疫學(xué)·

奧沙利鉑調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87生長(zhǎng)的作用研究①

段友強(qiáng) 劉義鋒②李 ?、?/p>

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)外科，鄭州450007)

目的：研究奧沙利鉑(Oxaliplatin,Ox)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87生長(zhǎng)的作用。方法：培養(yǎng)U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，分別利用0、20、40、80 μg/ml的奧沙利鉑處理U87細(xì)胞24、36、48、72 h，利用MTT檢測(cè)各處理組細(xì)胞增殖情況；利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)40 μg/ml的奧沙利鉑處理48 h對(duì)U87細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響；Western blot檢測(cè)40 μg/ml 的奧沙利鉑處理48 h對(duì)U87細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：奧沙利鉑處理抑制U87細(xì)胞增殖，與0 μmol/L處理相比，差異顯著(P<0.01)，40 μg/ml的奧沙利鉑處理48 h差異最顯著。40 μg/ml的奧沙利鉑處理48 h后，U87細(xì)胞周期被阻滯在S期，U87細(xì)胞凋亡顯著增加(P<0.01)，抑凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降，促凋亡因子Bax、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，PI3K及p-Akt的表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，Akt表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論：奧沙利鉑可能通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路抑制U87細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

奧沙利鉑；腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞；增殖；細(xì)胞周期；凋亡

腦膠質(zhì)瘤常發(fā)于神經(jīng)外胚層，是神經(jīng)系統(tǒng)常發(fā)惡性腫瘤，發(fā)病率約占顱內(nèi)腫瘤的45%[1]。目前對(duì)膠質(zhì)瘤的治療仍以手術(shù)為主，但是由于膠質(zhì)瘤具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，手術(shù)并不能完全切除癌變組織，手術(shù)后極易復(fù)發(fā)，致死率極高[2，3]，因此迫切的需要尋找新的膠質(zhì)瘤治療手段。奧沙利鉑是第三代鉑類抗癌藥物，具有極好的抗腫瘤效果，藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用較小，與順鉑、卡鉑之間無交叉耐藥的出現(xiàn)[4]。奧沙利鉑在結(jié)腸癌[5]、乳腺癌[6]、非小細(xì)胞肺癌[7]、胃癌[8]等癌癥的治療中取得了較好的效果，但是關(guān)于奧沙利鉑作用于膠質(zhì)瘤的相關(guān)研究還較少。本研究通過體外培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87，并使用奧沙利鉑處理，探究了奧沙利鉑對(duì)U87細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及凋亡的影響，并探討了可能存在的作用機(jī)制，以期為腦膠質(zhì)瘤的治療提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料 膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫提供；奧沙利鉑購自山東鉑源藥業(yè)有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基購自美國(guó)Hyclone；蛋白酶裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Bax單抗、Bcl-2單抗、Cleaved-caspase3單抗、PI3K單抗、Akt單抗、p-Akt單抗購自美國(guó)CTS；蛋白提取試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；MTT試劑盒購自美國(guó)Roche；酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀購自美國(guó)Thermo。

1.2 方法

1.2.1 U87細(xì)胞培養(yǎng) 取凍存的腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株，置于37℃恒溫水浴鍋解凍，解凍完全后離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞放于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至約鋪滿培養(yǎng)皿底80%時(shí)取出，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，使用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次，向細(xì)胞中加入0.25%的胰蛋白酶消化2～3 min，待大部分細(xì)胞脫離皿底時(shí)，向細(xì)胞中加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中離心收集沉淀，向沉淀中加入DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，重懸后細(xì)胞接種至新的含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 四氮唑藍(lán)測(cè)定細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)PBS緩沖液清洗后，加入0.25%胰酶消化，消化完全后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，1 000 r/min離心10 min取沉淀，向細(xì)胞沉淀中加入培養(yǎng)液后重懸，顯微鏡下計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，按每孔200 μl的量將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄去舊培養(yǎng)液，向細(xì)胞中分別加入含奧沙利鉑濃度為0、20、40、80 μg/ml的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，并設(shè)置空白對(duì)照組，空白對(duì)照組不加細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、36、48、72 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h向每孔細(xì)胞中加入20 μl MTT，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)直至結(jié)束，向每孔細(xì)胞中加入200 μl DMSO，混勻后置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)490nm處吸光度，并分析細(xì)胞的增殖情況。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀PI單染色法檢測(cè)細(xì)胞周期將U87細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，加入40 μg/ml的奧沙利鉑處理48 h，另取不做處理的細(xì)胞作為對(duì)照，胰酶消化各組細(xì)胞后，離心收集細(xì)胞沉淀，PBS重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，取1 ml細(xì)胞，向細(xì)胞中加入3 ml預(yù)冷的75%的乙醇4℃過夜，PBS清洗2次，加入500 μl含50 mg/L RNaseA及10 μg/ml PI的PBS緩沖液，室溫避光孵育30 min后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的分布情況。

1.2.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡 將U87細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，向細(xì)胞中加入終濃度為40 μg/ml的奧沙利鉑處理細(xì)胞48 h，另取不做處理的細(xì)胞作為對(duì)照，胰酶消化各組細(xì)胞，離心收集細(xì)胞沉淀，PBS重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，取1 ml細(xì)胞，向細(xì)胞中加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫避光孵育15 min后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的經(jīng)40 μg/ml奧沙利鉑處理48 h的U87細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞沉淀，向沉淀中加入細(xì)胞裂解液后置于冰上孵育30 min，4℃，12 000 r/min離心20 min，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，采用BCA試劑盒檢測(cè)所提取蛋白濃度。向提取的蛋白中加入Loading Buffer，100℃煮沸5 min制備蛋白樣品。配置蛋白膠，蛋白膠凝固后上樣，保證每孔蛋白上樣量一致，80 V電泳30 min后，換用120 V電壓繼續(xù)電泳，直至溴酚藍(lán)跑出玻璃板。冰浴100 V轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫孵育PVDF膜6 h，分別以Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase3、PI3K、Akt、p-Akt單克隆抗體作為一抗，4℃過夜孵育，TBST清洗3次，加入二抗置于37℃孵育1 h，TBST清洗3次，加入ECL發(fā)光劑進(jìn)行顯影，利用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 奧沙利鉑抑制U87細(xì)胞增殖 分別使用0、20、40、80 μg/ml的奧沙利鉑處理對(duì)數(shù)期的U87細(xì)胞24、36、48、72 h后，利用MTT檢測(cè)各組細(xì)胞存活情況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖1所示，奧沙利鉑處理對(duì)U87細(xì)胞的存活具有抑制作用，且具有濃度時(shí)間依賴性，U87細(xì)胞存活率隨著奧沙利鉑處理時(shí)間的增長(zhǎng)、處理濃度的增高而降低，與0 μg/ml處理相比，差異顯著(P<0.01)。40 μg/ml的奧沙利鉑處理48 h對(duì)U87細(xì)胞存活的抑制作用最明顯。

2.2 奧沙利鉑對(duì)U87細(xì)胞周期的影響 利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)40 μg/ml奧沙利鉑處理48 h對(duì)U87細(xì)胞周期的影響，結(jié)果如表1所示，奧沙利鉑處理后，G0/G1期和G2/M期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增多，與 0 μg/ml奧沙利鉑處理相比，差異顯著(P<0.05)，40 μg/ml奧沙利鉑處理誘導(dǎo)U87細(xì)胞被阻滯在S期。

2.3 奧沙利鉑促進(jìn)U87細(xì)胞凋亡 40 μg/ml奧沙利鉑處理U87細(xì)胞48 h后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)U87細(xì)胞凋亡情況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖2所示，40 μg/ml奧沙利鉑處理后，U87細(xì)胞凋亡明顯增多，與0 μg/ml處理相比差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 奧沙利鉑處理對(duì)U87細(xì)胞存活的影響Fig.1 Effect of oxaliplatin treatment on U87 cell survivalNote: **.P<0.01.

GroupsG0/G1phase(%)Sphase(%)G2/Mphase(%)0μg/mloxaliplatin39.40±1.2447.25±2.2013.35±2.5340μg/mloxaliplatin32.75±2.391)56.53±3.501)10.72±1.051)

Note：Compared with 0 μg/ml oxaliplatin group,1)P<0.05.

圖2 奧沙利鉑處理對(duì)U87細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of oxaliplatin treatment on U87 cell apoptosisNote: A.Flow cytometry detected U87 cell apoptosis；B.U87 cell apoptosis rate,**.P<0.01.

2.4 奧沙利鉑對(duì)Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)的影響 收集經(jīng)40 μg/ml奧沙利鉑處理48 h后處于對(duì)數(shù)期的U87細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase3的表達(dá)，結(jié)果如圖3所示，40 μg/ml奧沙利鉑處理后，抑凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)量降低，促凋亡因子Bax、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量升高，與0 μg/ml處理相比具有顯著性差異(P<0.01)。

圖3 奧沙利鉑處理對(duì)U87細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)影響Fig.3 Effect of oxaliplatin on expression of apoptotic protein in U87 cellsNote: A.Western blot detected the protein expression rate；B.The protein relative expression rate,**.P<0.01.

圖4 奧沙利鉑處理對(duì)PI3K/Akt通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)影響Fig.4 Effect of oxaliplatin treatment on protein expression in PI3K/Akt pathwayNote: A.Western blot detected the protein expression rate；B.The protein relative expression rate,**.P<0.01.

2.5 奧沙利鉑對(duì)PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)40 μg/ml奧沙利鉑處理48 h對(duì)PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果如圖4所示，與0 μg/ml處理相比，40 μg/ml奧沙利鉑處理后，PI3K及p-Akt的表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，Akt表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是常發(fā)于人顱內(nèi)的一種原發(fā)性腫瘤，是顱內(nèi)發(fā)病率以及致死率最高的惡性腫瘤。傳統(tǒng)的腦膠質(zhì)瘤治療手段是手術(shù)切除為主，輔以放療、化療、生物治療等多種治療方法。由于腦膠質(zhì)瘤的惡性程度極高，在顱內(nèi)呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與正常腦組織的界限很不明顯，手術(shù)難以完全切除癌變組織，因此術(shù)后腦膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)率極高。

奧沙利鉑是繼順鉑和卡鉑之后開發(fā)的第三代鉑類金屬抗腫瘤藥物，屬于DNA烷化劑。奧沙利鉑不僅具有很高的抗癌活性，而且對(duì)順鉑耐藥的細(xì)胞也具有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，通過與DNA結(jié)合形成鉑類-DNA復(fù)合物，引起DNA的損傷，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡；引起腫瘤細(xì)胞凋亡是鉑類抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的主要方式[9]。為了探究奧沙利鉑對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用，分別使用0、20、40、80 μg/ml的奧沙利鉑處理U87細(xì)胞24、36、48、72 h，檢測(cè)U87細(xì)胞的存活情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑能顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的存活，且呈濃度時(shí)間依賴性，其中40 μg/ml的奧沙利鉑處理48 h對(duì)U87細(xì)胞存活的抑制作用最明顯。膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程十分復(fù)雜，除了與細(xì)胞活性的升高有關(guān)之外，與細(xì)胞周期調(diào)控的失常也具有密切的關(guān)系。細(xì)胞周期進(jìn)程中，細(xì)胞周期蛋白通過與相關(guān)的激酶結(jié)合調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程[10]。腫瘤藥物通常將腫瘤細(xì)胞周期阻滯在G1/S或G2/M期，從而修復(fù)受損的DNA[11]。本研究利用40 μg/ml奧沙利鉑處理U87細(xì)胞48 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的分布情況，結(jié)果顯示，奧利沙鉑處理后，處于G0/G1期和G2/M期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增多，說明奧利沙鉑處理誘導(dǎo)U87細(xì)胞被阻滯在S期。Bcl-2和Bax屬于Bcl-2家族，Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡過程中具有重要的作用[12]。Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，Bax對(duì)細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，二者在細(xì)胞中常以同源或異源二聚體形式存在[13]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2含量增多時(shí)，Bcl-2/Bax二聚體含量增多，凋亡受到抑制，當(dāng)Bax含量增加時(shí)，Bax自身形成同源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。caspase家族在細(xì)胞凋亡過程中具有重要作用。caspase3位于caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是caspase凋亡依賴途徑的交匯點(diǎn)，caspase3的活化對(duì)細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用[15]。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，40 μg/ml奧沙利鉑處理U87細(xì)胞48 h顯著促進(jìn)U87細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑處理后，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，Bax、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)明顯升高，證實(shí)奧沙利鉑通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)促進(jìn)U87細(xì)胞凋亡。

PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞中廣泛存在，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及細(xì)胞周期進(jìn)程具有調(diào)控作用[16]。有研究證實(shí)，PI3K/Akt通路的活化促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，抑制凋亡的發(fā)生[17]。研究PI3K/Akt對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)活化的Akt通過磷酸化Bcl家族成員BAD，阻斷BAD/Bcl-2復(fù)合體的形成，直接調(diào)控細(xì)胞凋亡[18]，也可以通過磷酸化NF-κB，促進(jìn)NF-κB轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)Bcl-xl的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞存活[19]，Akt還可通過磷酸化mTOR參與細(xì)胞周期進(jìn)程[20]。本研究利用Western blot檢測(cè)奧利沙鉑處理對(duì)PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，奧沙利鉑處理后，PI3K及p-Akt的表達(dá)量明顯降低，Akt表達(dá)量無明顯差異，證實(shí)奧利沙鉑對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路具有抑制作用。奧沙利鉑處理可以顯著抑制U87細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制可能與PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制有關(guān)，為臨床上奧沙利鉑治療腦膠質(zhì)瘤提供了新的研究思路。

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[收稿2016-09-26 修回2016-11-08]

(編輯 倪 鵬)

Research of oxaliplatin inhibit growth in glioma U87 cells by regulating PI3K/Akt signal pathway

DUANYou-Qiang,LIUYi-Feng,LIWei.

DepartmentofNeurosurgery,ZhengzhouCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Zhengzhou450007,China

Objective:To investigate the effect of oxaliplatin inhibit the growth in glioma U87 cells by regulating PI3K/Akt signal pathway.Methods: The glioma U87 cells were cultivated in vitro,using 0,20,40,80 μg/ml oxaliplatin treated U87 cells 24,36,48,72 h respectively,MTT was used to detect cell proliferation.Using 40 μg/ml oxaliplatin treated U87 cells 48 h,flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis.Cells apoptosis protein and PI3K/Akt pathway protein expression after 40 μg/ml oxaliplatin treated U87 cells 48 h was detected by Western blot.Results: MTT assay showed that compared with the 0 μg/ml treatment,oxaliplatin treatment could significantly inhibited U87 cell survival (P<0.01),40 μg/ml oxaliplatin treatment 48 h ,the survival inhibitory was the most obvious.U87 cell cycle was arrested in S phase after 40 μg/ml oxaliplatin treatment 48 h.After 40 μg/ml oxaliplatin treatment 48 h,compared with the 0 μg/ml treatment,U87 cell apoptosis rate significantly increased (P<0.01).Western blot showed that after 40 μg/ml oxaliplatin treatment,anti-apoptotic factor Bcl-2 expression had significant decreased,pro-apoptotic factors Bax,Cleaved-caspase3 protein expression had significantly increased (P<0.01).PI3K,p-Akt expression was significantly decreased (P<0.01),and Akt expression had no significant change in Akt pathway (P>0.05).Conclusion: Oxaliplatin may suppress U87 cell proliferation,arrest cell cycle,and promote apoptosis by inhibit PI3K/Akt signaling pathway.

Oxaliplatin; Glioma cells; Proliferation; Cell cycle; Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.002

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81401097)。

段友強(qiáng)(1967年-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科方面的研究，E-mail：youqiangduan6705@163.com。

R739.4

A

1000-484X(2017)03-0328-05

②鄭州大學(xué)附屬南陽中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南陽473000。

③沈陽軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽110000。