蒿甲虛熱清顆粒的制備及其含量測定方法研究

王遠(yuǎn)蘋，余楚欽 ，楊 怡，林華慶

（廣東藥科大學(xué)·廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006）

·實(shí)驗(yàn)研究·

蒿甲虛熱清顆粒的制備及其含量測定方法研究

王遠(yuǎn)蘋，余楚欽 ，楊 怡，林華慶

（廣東藥科大學(xué)·廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006）

目的建立同時(shí)測定蒿甲虛熱清顆粒中丹皮酚、葛根素含量的高效液相色譜法。方法藥材提取液作為黏合劑，采用流化床一步制粒。采用YMC-Pack ODS-A C18色譜柱(250mm×4．6mm，I．D．S-5 m，12 nm)；柱溫為35℃；流動(dòng)相為甲醇(A)-水(B)-0．2%磷酸溶液(C)，梯度洗脫；流速為1 m L／min；檢測波長為274 nm；進(jìn)樣體積為 10 L。結(jié)果 丹皮酚和葛根素進(jìn)樣量分別在0．418～1．464 g和0．608～2．126 g范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好(r＝0．999 5)；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果的 RSD均不超過3%；加樣回收率分別為98．64% ～103．84%，98．98% ～102．99%，RSD分別為1．93%，1．74%（n＝6）。結(jié)論 該制備工藝簡單可行，含量測定方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于蒿甲虛熱清顆粒的質(zhì)量控制。

蒿甲虛熱清顆粒；一步制粒；高效液相色譜法；丹皮酚；葛根素；含量測定

蒿甲虛熱清顆粒由青蒿、醋鱉甲、葛根、丹皮等8味藥材組方，源于《溫病條辨·卷三下焦篇》中青蒿鱉甲湯，經(jīng)劑型改良而得[1]。青蒿鱉甲湯是治療瘟病后期陰虛發(fā)熱的代表方劑[2-4]，主要有解熱、抗炎、鎮(zhèn)靜、抗病原微生物等作用。蒿甲虛熱清顆粒原制備工藝包括提取、濃縮、噴霧干燥、濕法制粒等步驟，以藥材提取液作為黏合劑，采用流化床制粒，將傳統(tǒng)濕法制粒中混合、制粒、干燥3個(gè)步驟一次完成，同時(shí)省略原工藝中噴霧干燥的步驟，提高生產(chǎn)效率。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用2015年版《中國藥典(一部)》中丹皮酚和葛根素的高效液相色譜（HPLC）法分別測定其含量[5]，操作煩瑣，檢測耗時(shí)，且目前暫無同時(shí)測定丹皮酚與葛根素的方法，本研究中建立了同時(shí)測定丹皮酚、葛根素含量的HPLC法，可用于蒿甲虛熱清顆粒的質(zhì)量控制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

OTREA1型流化床（瑞士 Niro-Aeromatic有限公司）；UltiMate 3000型高效液相色譜儀（戴安中國有限公司）；RV8型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA，德國艾卡儀器設(shè)備有限公司）；BS224S型電子分析天平（Sartorius，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；CP2250型電子分析天平（Sartorius，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；SK7200LHC超聲儀（IKA，德國艾卡儀器設(shè)備有限公司）；TGL-20B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；MA35快速水分測定儀(廣州市博勒泰貿(mào)易有限公司)。

1．2 試藥

青蒿、醋鱉甲、葛根、牡丹皮等（廣州至信中藥飲片廠有限公司，批號為150301）；乳糖（德國美劑樂沃斯堡牛奶房兩合公司，批號為L1411）；共聚維酮S630（ISP Technologies INC，批號為ML200083795）；葛根素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110751-201514，純度為95．5%）；丹皮酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110708-200505，純度為98%）。水（屈臣氏蒸餾水），甲醇（Fisher）、磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號為20131217）均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2．1 蒿甲虛熱清顆粒的制備

2．1．1 提取工藝

醋鱉甲粉碎后煎煮2次，煎煮液過濾，濾液合并，備用；按處方工藝量取青蒿、葛根等6味藥材煎煮2次，煎煮液過濾，濾液合并，備用；牡丹皮先采用水蒸汽蒸餾提取，分別收集蒸餾液和煎煮液，藥渣再次提取，煎煮液過濾，濾液合并，備用。合并上述所有水煎濾液，減壓濃縮至密度為 1．1～1．2 g／m L(25℃)，高速離心，取上清液，備用。丹皮蒸餾液加入適量氯化鈉，4℃冷藏24 h，濾過，得丹皮酚結(jié)晶物，晾干，備用。

2．1．2 流化床制粒[6-7]

取丹皮酚結(jié)晶物溶于95%乙醇溶液，配制含4．25%丹皮酚和1%共聚維酮的溶液，備用。取乳糖180 g過80目篩，置流化床物料槽內(nèi)，于50℃流化狀態(tài)下預(yù)熱約10min，頂噴噴入備用藥材提取液248 g，制粒。將含藥顆粒于60℃流化干燥至水分低于4%后，繼續(xù)頂噴噴入備用丹皮酚溶液20g，40℃流化干燥，控制水分在3%～5%，整粒。優(yōu)化后的流化床制粒工藝技術(shù)參數(shù)見表1。

表1 流化床工藝技術(shù)參數(shù)

2．2 含量測定方法的建立

2．2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：YMC-Pack ODS-A C18柱(250 mm× 4．6 mm，I．D．S-5μm，12 nm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-水(B)-0．2%磷酸溶液(C)[8-11]，梯度洗脫，洗脫條件見表2；流速：1 m L／min；柱溫：35℃；檢測波長：274 nm；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按丹皮酚峰計(jì)應(yīng)不少于6 000，按葛根素峰計(jì)應(yīng)不少于3 000，分離度均應(yīng)大于2．5。各成分基線分離良好，色譜圖見圖1。

表2 梯度洗脫條件

圖1 高效液相色譜圖

2．2．2 溶液制備

丹皮酚對照品貯備液：取丹皮酚對照品約10 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加適量甲醇超聲5 min溶解并定容，搖勻，即得。

葛根素對照品貯備液：取葛根素對照品約15 mg，精密稱定，置25 m L容量瓶中，加適量甲醇超聲5 min溶解并定容，搖勻，即得。

混合對照品溶液：分別稱取丹皮酚對照品、葛根素對照品適量，加甲醇溶解，制成每1m L約含丹皮酚、葛根素分別為0．06，0．09mg的混合對照品溶液。

供試品溶液：取適量蒿甲虛熱清顆粒，研細(xì)，取粉末約2 g，精密稱定，置20m L容量瓶中，加入適量甲醇超聲5min溶解并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：取不含葛根、丹皮酚藥材的浸膏提取液依法流化床制粒，取制備好的顆粒，研細(xì)，取粉末約2 g，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲5 min溶解并定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2．2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取上述對照品貯備液1．0，1．5，2．0，2．5，3．0，3．5m L，置20 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，分別以丹皮酚和葛根素的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，用最小二乘法計(jì)算回歸方程。結(jié)果見表3。

表3 線性關(guān)系考察結(jié)果

精密度試驗(yàn)：取混合對照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣6次，測定。結(jié)果丹皮酚和葛根素的 RSD分別為0．48%，0．59%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號為160503）樣品，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h時(shí)，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄丹皮酚和葛根素的色譜圖，記算峰面積。結(jié)果丹皮酚和葛根素的 RSD分別為0．94%，0．70%(n＝8)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一批（批號為160503）樣品適量，依法平行制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果丹皮酚和葛根素的RSD分別為2．75%，2．35%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：分別精密稱取同一批（批號為160503）樣品適量，依法平行制備6份供試品溶液，分別精密量取5m L置10 mL容量瓶中，分別精密加入丹皮酚對照品貯備液0．7mL和葛根素對照品貯備液1．5mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

2．2．4 樣品含量測定

精密稱取3批(批號分別為160503，160505，160506)樣品，依法制備供試品溶液，按2．2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，分別計(jì)算葛根素和丹皮酚的含量。結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果（mg／g，n＝3）

3 討論

青蒿鱉甲湯始見于清代葉天士《臨癥指南案·卷五·溫?zé)帷嵯菅滞醢浮罚瑴夭W(xué)家吳鞠通在葉天士基礎(chǔ)上規(guī)范用量[12]。吳鞠通所著《溫病條辨卷二·中焦篇·濕熱，卷三·下焦篇·風(fēng)熱》中均有記載，兩方略有不同，對于發(fā)熱癥候，只要具備“夜熱早涼，退熱無汗”的癥狀，無論陰虛癥狀輕重，皆可用青蒿鱉甲湯加減用量治療[3，12]。青蒿鱉甲湯廣泛用于臨床各科發(fā)熱癥候的病癥治療，療效良好，但傳統(tǒng)湯劑體積較大，味苦，攜帶服用不方便，且易發(fā)霉發(fā)酵，不易于長期存貯和大量制備。目前，青蒿鱉甲湯的中成藥只有片劑1種，蒿甲虛熱清顆粒在青蒿鱉甲湯基礎(chǔ)上進(jìn)行劑型創(chuàng)新，采用顆粒劑，方便醫(yī)患使用。

本研究中對蒿甲虛熱清顆粒的原工藝上進(jìn)行改進(jìn)，直接用藥材提取液作為黏合劑，采用流化床制粒，將傳統(tǒng)濕法制粒中混合、制粒、烘干的過程一步完成，縮短操作時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，且整個(gè)操作過程在同一密閉容器中完成，減少物料損失和外源污染[13]。流化床制粒所得顆粒與原產(chǎn)品比較，粒度分布更均勻[6]。本研究中所采用方法減少了藥材提取液噴霧干燥的步驟，避免提取物經(jīng)長時(shí)間高溫處理，降低產(chǎn)品中有效成分的損失。原工藝將丹皮酚溶于乙醇后直接噴灑在顆粒表面，在存放過程中丹皮酚部分揮發(fā)，含量下降。在丹皮酚乙醇溶液中加入共聚維酮，增加溶液的黏性，使丹皮酚更易黏附在顆粒表面，同時(shí)共聚維酮在顆粒表面形成一層膜，將丹皮酚包裹其中，更好地保護(hù)丹皮酚，使其不易揮發(fā)，提高丹皮酚在顆粒中的穩(wěn)定性，解決了原工藝制得顆粒丹皮酚含量不穩(wěn)定的問題。

蒿甲虛熱清顆粒中丹皮酚和葛根素同時(shí)測定方法的建立尚屬首次?！吨袊幍?一部)》中丹皮酚、葛根素檢測波長分別為274 nm和360 nm，本研究中考察了丹皮酚、葛根素在274 nm波長處均有較好吸收，故本方法選擇274 nm作為檢測波長，使這2種成分能同法檢測。本研究中選擇甲醇-水-0．2%磷酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，既兼顧了丹皮酚、葛根素定量所需的參數(shù)要求，又確保了前一次進(jìn)樣的樣品能完全洗脫，不會(huì)對后一次進(jìn)樣的樣品產(chǎn)生影響，同時(shí)，使丹皮酚、葛根素分別達(dá)到較好的分離度。同法檢測可減少樣品處理步驟，縮短檢測時(shí)間，提高檢測效率。

綜上所述，蒿甲虛熱清顆粒與原青蒿鱉甲湯相比，藥物穩(wěn)定性顯著提高，方便攜帶和保存，利于患者使用。本研究在原工藝基礎(chǔ)上改良出更簡單可行的制備工藝，同時(shí)通過新輔料和制劑手段增加丹皮酚在制劑中的穩(wěn)定性，該工藝方法可用于工業(yè)化生產(chǎn)。所建立的HPLC法可同時(shí)測定丹皮酚和葛根素的含量，簡便、可靠，提高檢測效率，可用于蒿甲虛熱清顆粒的質(zhì)量控制。

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Preparation and Content Determ ination M ethod of Haojia Xureqing G ranules

Wang Yuanping,Yu Chuqin,Yang Yi,Lin Huaqing
(Guangdong Provincial Key Laboratory of Advanced Drug Delivery,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou,Guangdong,China 510006)

Ob jective To simultaneously determinate the content of paeonol and puerarin in Haojia Xureqing Granules with high performance liquid chromatography method．Improve the efficiency of production and testing．M ethods The fluidized bed was used to make granules with the herbal extract as binder．HPLC was performed on the column of YMC-Pack ODS-A C18(250 mm×4．6 mm, I．D．S-5μm,12 nm)with mobile phase of methanol(A)-water(B)-0．2% phosphoric acid solution(C),at flow rate of 1．0 m L／min, in gradient elution,column temperature was 35℃,the injection volume was 10μL,and determine wavelength was 274 nm．Resu lts Paeonol and pueraria were in good linear relationship(r＝0．999 5)in the range of 0．418μg-1．464μg,0．608μg-2．126μg;the RSD of precision,reproducibility tests and the stabilities were no more than 3%．The scopes of sample recovery rate were 98．64%-103．84%(RSD＝1．93%,n＝6),98．98%-102．99%(RSD＝1．74%,n＝6)．Conclusion The preparation technology is simple and feasible,the content determination method is simple,accurate and reproducible,and can be used for the quality control of the Haojia Xureqing Granules．

Haojia Xureqing Granules;one-step granulating method;HPLC;paeonol;puerarin;content determination

R286.0；R284.1

A

1006-4931(2017)03-0008-04

2016-10-07；

2016-11-08)

10．3969／j．issn．1006-4931．2017．03．003

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目[2013B021800080]。

王遠(yuǎn)蘋（1991-），女，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)橹兴巹┬?，（電子信箱）yuanpingwang＠163．com。

余楚欽，高級工程師，大學(xué)本科，研究方向?yàn)樗幬镄聞┬?，（電子信箱）pn333＠163．com。