青蒿琥酯對人肺腺癌細胞系A549增殖的抑制作用及機制

馬宏境，曾妮，黃少祥(天津市第五中心醫(yī)院，天津300450)

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青蒿琥酯對人肺腺癌細胞系A549增殖的抑制作用及機制

馬宏境，曾妮，黃少祥
(天津市第五中心醫(yī)院，天津300450)

目的 觀察青蒿琥酯對人肺腺癌細胞系A549增殖的抑制作用，并探討其作用機制。方法 常規(guī)培養(yǎng)A549細胞后，不同濃度(0、25、50、75、100 μmol/L)的青蒿琥酯作用A549細胞，采用CCK-8法檢測青蒿琥酯對A549細胞的增殖抑制率，Western blotting法檢測mTOR信號通路關鍵分子和自噬相關蛋白p62、LC3B表達變化。結果 25 μmol/L及以上濃度的青蒿琥酯可抑制A549細胞增殖，并呈時間和濃度依賴性(P均<0.05)。不同濃度(0、25、50、75、100 μmol/L)的青蒿琥酯作用A549細胞48 h可降低p62表達，增加LC3B表達，并降低mTOR信號通路關鍵分子的表達，并呈劑量依賴性。青蒿琥酯聯(lián)合自噬抑制劑3-MA可增加A549細胞的生存率(P<0.05)。結論 青蒿琥酯可能通過下調mTOR信號通路關鍵分子表達、誘導A549細胞發(fā)生自噬從而抑制A549細胞增殖。

肺腫瘤；青蒿琥酯；細胞自噬；細胞增殖；雷帕霉素靶蛋白

青蒿琥酯是從黃花蒿葉中提取的單體成分[1]，能治療瘧疾，具有抗腫瘤的功效。研究表明，青蒿琥酯主要通過促進腫瘤細胞凋亡、產(chǎn)生氧化應激反應、減少局部腫瘤組織的血管形成、誘導細胞發(fā)生自噬反應及增強機體免疫力等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[2～5]。多項研究表明，不同的試驗條件下，自噬能促進細胞存活或抑制細胞生長[6～9]，因此，可通過調節(jié)自噬的發(fā)生及程度來促進人體正常細胞的存活，誘導腫瘤細胞死亡。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是細胞能量代謝研究領域一個重要調節(jié)靶點，位于PI3K/Akt信號通路的下游，在自噬調節(jié)中發(fā)揮重要作用[10]。mTOR能感知細胞內的營養(yǎng)狀況，根據(jù)細胞內氨基酸和ATP含量的變化來調節(jié)細胞本身的自噬水平[11]。核糖體蛋白S6是mTOR復合物1(mTORC1)下游的主要效應分子，通過其表達變化能說明mTOR活性表達水平[12]。目前國內外研究多采用p62及微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)作為自噬發(fā)生的分子標記物[13，14]。2015年6月～2016年6月，本研究觀察了青蒿琥酯對人肺腺癌細胞系A549增殖的抑制作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 青蒿琥酯由廣東新南方青蒿科技有限公司提供，用倍比稀釋法調整藥物濃度。人肺腺癌細胞系A549購于北京協(xié)和基礎醫(yī)學研究所細胞中心。胎牛血清購于Gibco公司；DMEM基礎培養(yǎng)液購于美國Hyclone 公司；自噬抑制劑3-MA購于Sigma公司；β-actin抗體購于北京中杉金橋生物技術有限公司；S6、phospho-S6、LC3B、P62抗體購于Cell Signaling Technology公司，HRP-標記的羊抗鼠/兔購于Santa Cruz公司，Cell counting kit-8(CCK-8試劑盒)購于日本同仁化學研究所。

1.2 細胞培養(yǎng) A549細胞于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，飽和濕度。間隔48～72 h傳代。

1.3 A549細胞增殖抑制率檢測 采用CCK-8法。制備A549細胞懸液，調整細胞為3×107/L，置于96孔板，每孔100 μL。于培養(yǎng)24 h細胞完全貼壁后隨機分為兩部分。一部分隨機分為5組，分別加入0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯100 μL；另一部分隨機分為5組，分別加入0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯，同時加入3 mmol/L 3-MA，各組均設置10個復孔。分別作用24、48、72 h，用CCK-8試劑盒檢測A549細胞存活情況。用酶標儀測量波長450 nm的吸光度值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[1-(AX-A)/(A0-A)]×100%。AX為加藥孔OD值，A為未加細胞，單純藥物的OD值；A0為未加藥物的OD值。青蒿琥酯IC50使用SPSS17.0軟件進行計算。

1.4 細胞內mTOR信號蛋白S6、自噬特異性蛋白p62、LC3B蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取指數(shù)生長期的細胞，制成細胞懸液后接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，饑餓處理12 h后分別加入0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯各100 μL，作用48 h提取總蛋白，用BCA法定量，檢測樣品加入5×上樣緩沖液后煮沸10 min，根據(jù)蛋白定量結果調整每份樣品蛋白上樣量，進行上樣。以β-actin為內參，SDS-PAGE電泳分離后，轉膜至PVDF膜。室溫條件下常規(guī)封閉1 h，加入一抗，于4 ℃條件下孵育過夜。用HRP標記二抗，室溫條件下繼續(xù)孵育1 h，經(jīng)TBST洗滌后，ECL化學發(fā)光法檢測蛋白表達。用Imagine J軟件進行檢測。蛋白相對表達量(校正后)=蛋白灰度值/內參灰度值。

2 結果

2.1 青蒿琥酯對A549細胞增殖的影響 經(jīng)0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯單獨作用24 h，A549細胞增殖抑制率分別為7.1%、15.0%、35.7%、46.3%、60.2%；作用48 h，A549細胞增殖抑制率分別為7.7%、20%、46%、53%、70%；作用72 h，A549細胞增殖抑制率分別為8.3%、25.0%、53.0%、55.7%、73.4%。A549細胞增殖抑制率隨藥物濃度的增加而增加、隨作用時間的增加而增加。24、48、72 h青蒿琥酯的IC50分別為(46.2±5.4)、(75.0±6.7)、(124.4±5.6)μmol/L。經(jīng)0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯與3-MA共同作用24 h，A549細胞增殖抑制率分別為7%、14.2%、34.9%、49.3%、62.2%；作用48 h，A549細胞增殖抑制率分別為7.5%、16.1%、40.7%、43.1%、62.0%；作用72 h，A549細胞增殖抑制率分別為8.0%、20.0%、48.9%、50.1%、65.7%。同時點同濃度的青蒿琥酯加入3-MA后，A549細胞增殖抑制率降低(P均<0.05)。

2.2 青蒿琥酯對mTOR信號蛋白S6活性的影響 經(jīng)0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯單獨作用48 h，結果顯示，當藥物作用濃度為25 μmol/L以上時，隨著藥物濃度的增加，p-S6蛋白相對表達量降低，S6蛋白表達水平不變，p-S6蛋白相對于S6蛋白表達量分別為1.41±0.12、1.40±0.09、1.25±0.11、1.02±0.07、0.70±0.06；差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.3 青蒿琥酯對自噬特異性蛋白p62、LC3B表達的影響 經(jīng)0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯單獨作用48 h，p62蛋白相對于內參β-actin的相對表達量分別為0.98±0.10、0.81±0.08、0.70±0.06、0.64±0.04、0.57±0.04，LC3BⅡ/Ⅰ分別為0.43±0.05、0.78±0.09、1.22±0.11、1.59±0.14、1.98±0.17。與未加藥物相比，p62表達隨青蒿琥酯濃度增強而降低(P均<0.05)。LC3B表達增強，LC3BⅡ/Ⅰ值增加，LC3BⅠ向LCBⅡ轉化增多，細胞自噬增強(P<0.01)。

3 討論

研究表明，青蒿琥酯能在體外培養(yǎng)環(huán)境下抑制多種腫瘤細胞生長[15～17]。其機制可能為通過誘導細胞自噬來抑制腫瘤細胞生長[5]。自噬這種可導致細胞死亡的反應方式，在肺部腫瘤的基礎研究領域逐漸受到重視。

本研究選取A549細胞為實驗對象，觀察青蒿琥酯對細胞自噬的誘導作用。自噬主要參與細胞的能量代謝，依賴于生存環(huán)境的不同來發(fā)揮對細胞的雙向調節(jié)功能[7,18]，即促進細胞生存或死亡。PI3K/Akt/mTOR信號通路已經(jīng)被證實在細胞內對自噬發(fā)揮最直接的調控作用[10]，S6是mTOR下游的靶分子，通常通過其磷酸化水平來反映該信號通路的活性。mTOR信號減弱可以導致細胞進一步發(fā)生自噬。本研究結果顯示，經(jīng)不同濃度的青蒿琥酯作用后，p-S6蛋白表達減低，這提示青蒿琥酯可能通過下調mTOR信號通路活性促進細胞自噬體形成。

p62在自噬發(fā)生早期可調節(jié)細胞自噬體的構成，在末期其在細胞內的表達逐漸減少。通常可通過檢測p62在細胞內的表達水平來表示自噬發(fā)生的程度。在自噬反應發(fā)生的初期，LC3參與了自噬反應的主要效應器即自噬溶酶體的構成，LC3(微管相關蛋白1輕鏈3)的表達水平可表示自噬的發(fā)生程度，通過測算LC3BⅡ與LC3BⅠ的比值可表示自噬體的數(shù)量和自噬發(fā)生的程度。即LC3BⅡ/Ⅰ越高，自噬的程度越高。本研究結果顯示，經(jīng)不同濃度的青蒿琥酯作用后，p62蛋白表達減低，LC3B蛋白表達升高，LC3BⅡ/Ⅰ值增加，提示青蒿琥酯誘導A549細胞發(fā)生自噬，而且自噬反應的程度隨藥物作用濃度、作用時間的增加而逐漸加強。本研究加入細胞自噬抑制劑3-MA后細胞增殖抑制率降低，進一步說明細胞自噬能抑制細胞生存。

綜上所述，青蒿琥酯能抑制A549細胞增殖，其機制可能是下調mTOR信號通路的活性，促進細胞發(fā)生自噬。

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2017-04-02)