肉制品致病菌多重PCR快速檢測技術研究

消息熱點

肉制品致病菌多重PCR快速檢測技術研究

肉類工業(yè)是我國第一大食品產業(yè)，關系國計民生。肉制品營養(yǎng)豐富，在加工、包裝、儲藏等過程中極易受致病性微生物的污染，從而引發(fā)肉品安全問題。沙門氏菌、小腸耶爾森氏菌和大腸桿菌O157：H7是常見的引起肉制品污染的重要致病菌。近年來興起的PCR技術以其特異性強、敏感性好，方便、快速等優(yōu)點逐漸應用于食品檢驗領域。但PCR方法每次試驗只能特異性的檢測一種病原菌，而實際樣品中往往存在種類繁多的病原細菌，涉及不同種和型別。多重PCR是在普通PCR基礎上針對這一不足改進并發(fā)展起來的，在同一個反應中同時完成多個基因擴增的一種快捷檢測方法。

中國專利CN201310191453.2公開了一種豬肉中5種主要致病菌五重PCR快速檢測方法。該方法是先提取待測肉樣中總細菌DNA，然后合成SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.12所示引物；進行五重PCR反應，PCR產物用2%瓊脂糖進行電泳分析，根據(jù)電泳結果進行判斷。用該發(fā)明方法檢測豬肉中種食源性致病菌(沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、小腸結腸炎耶爾森菌和大腸桿菌O157:H7)的最低檢測限分別為142、51、9、33 cfu/mL和670 cfu/mL，適合食品行業(yè)對大批量豬肉及豬肉產品在銷售過程中致病菌的日常安全監(jiān)測。CN201410532170.4公開了一種牛肉中3種主要致病菌多重PCR檢測方法，該方法包括：沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌O157：H7的菌株培養(yǎng)；不同增菌液對3種致病菌的增菌效果對比；選擇引物；多重PCR擴增體系；提取待測牛肉樣品中細菌的DNA；建立多重PCR反應體系參數(shù)。該發(fā)明的3種主要致病菌多重PCR檢測方法，不僅保留了常規(guī)PCR的高特異性、敏感性，又減少了操作步驟，實現(xiàn)了一次擴增可同時檢測多種微生物的目的，大大節(jié)省了時間，節(jié)約了經(jīng)費開支。CN201210130290.2公開了同時檢測多種水產品致病菌的熒光定量PCR引物和探針及檢測方法。所述的熒光定量PCR引物和探針共有5組，可以分別檢測沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、福氏志賀氏菌和非O1群霍亂弧菌，除單核細胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌基因2組的引物和探針不能同時使用外，其他任意2組或2組以上組合，均可以同時檢測相應引物和探針對應能檢測出的致病菌。該發(fā)明同時公開了一種利用上述各引物對和探針建立的多重熒光定量PCR擴增體系，可快速準確地檢測出待檢樣品中是否有相應致病菌，操作方便快捷，且特異性高，不會出現(xiàn)假陽性結果，可以做成試劑盒等，在農副產品致病菌檢測中非常適用。李新福等（2017）針對低溫肉制品中較易污染的沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌等有害微生物，利用多重聚合酶鏈式反應(m-PCR)的方法，對3種菌同時快速檢測，從而達到節(jié)省時間，提高效率的目的。使用沙門氏菌的invA基因、金黃色葡萄球菌的Prf4基因和單增李斯特菌nuc基因設計3對特異性引物，在確定特異性引物的基礎上，將3種菌進行培養(yǎng)增菌后接種于低溫肉制品中，過夜富集后收集并進行靈敏度檢測，優(yōu)化多重PCR反應體系并應用于實際樣品的檢測。結果表明：多重PCR方法在同時檢測這3種有害微生物時,m-PCR最佳反應條件如下:25 μL反應體系、10×PCR緩沖液2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、2.5 U/μL 的 DNA 聚合酶 0.5 μL 及上、下游引物各 0.5 μL、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的模板 1.0 μL、沙門氏菌的模板2.0 μL,加ddH2O補足至25 μL,最佳退火溫度為64℃。胡瑞麗等（2015）根據(jù)單核增生李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7的特異性序列分別設計4對特異性引物，建立了一種快速檢測上述4種常見食源性致病菌的多重PCR方法，并對反應體系中的模板、引物、rTaq酶、MgSO4添加量以及退火溫度進行了優(yōu)化。結果顯示：4對引物序列的特異性均較好，利用單重PCR對4種致病菌的靈敏度進行檢測，其檢測限均達到103copies/mL。多重 PCR同時檢測4種致病菌的靈敏度為103copies/mL，對人工污染豬肉中的4種致病菌的靈敏度檢測為103cfu/mL。該檢測方法不與其他菌產生交叉反應，與傳統(tǒng)方法相比大大縮短了檢測時間，并提高了檢測的準確度。

食源性致病菌導致的疾病和食品污染已成為世界衛(wèi)生問題。研究建立高效、精確、特異性強、靈敏度高的檢測技術對于食品安全和人體健康具有重要的作用，具有很好的實用價值和開發(fā)前景，可在食品檢測領域大力推廣。

（江南大學圖書館 張群）