• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基因組編輯技術(shù)及在病毒基因治療的應(yīng)用

    2017-04-09 00:39:01鐘艷君
    生物化工 2017年5期
    關(guān)鍵詞:核酸酶鋅指結(jié)構(gòu)域

    鐘艷君

    (上海泰因生物技術(shù)有限公司,上海 201400)

    基因組編輯技術(shù)及在病毒基因治療的應(yīng)用

    鐘艷君

    (上海泰因生物技術(shù)有限公司,上海 201400)

    基因組編輯技術(shù)是對(duì)基因組進(jìn)行切割、修飾的一種發(fā)展迅速的技術(shù)。隨著鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)、CRISPR-Cas9系統(tǒng)三大基因組編輯技術(shù)的相繼開(kāi)發(fā),基因組編輯技術(shù)得到飛速的發(fā)展,在基因治療方面開(kāi)辟了一條新的道路。本文綜述了基因組編輯技術(shù)及在病毒基因療法的應(yīng)用現(xiàn)狀。

    ZFN;TALEN;CRISPR-Cas9;病毒治療

    基因組編輯是一種精確修飾基因的技術(shù),并在近年發(fā)展迅速,它可以對(duì)基因的多位點(diǎn)及小片段進(jìn)行融合、突變及刪減等,可在基因組水平上進(jìn)行精確的基因修改。在科研領(lǐng)域,對(duì)構(gòu)建模式動(dòng)物,可以節(jié)約大量人力和財(cái)力,在醫(yī)療領(lǐng)域,對(duì)疾病發(fā)病機(jī)理和基因功能的探索,可以通過(guò)基因組編輯技術(shù)更加準(zhǔn)確、深入地了解,并且可以改造基因,達(dá)到基因治療的目的等。因此,基因組編輯技術(shù)的發(fā)展前景及應(yīng)用價(jià)值非常廣泛。隨著鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)、CRISPR-Cas9系統(tǒng)三大基因組編輯技術(shù)的相繼開(kāi)發(fā),基因組編輯技術(shù)得到飛速的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用。

    1 三大基因編輯技術(shù)

    1.1 鋅指核酸酶ZFN

    鋅指蛋白最早在非洲爪蟾中發(fā)現(xiàn),是所有后生動(dòng)物中最常見(jiàn)的DNA序列。鋅指蛋白有-個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域,每個(gè)結(jié)構(gòu)域由30個(gè)氨基酸組成,并具有Cys2-His2,它們通過(guò)Zn2+穩(wěn)定結(jié)合形成手指狀結(jié)構(gòu),因此成為“鋅指蛋白”。鋅指蛋白每個(gè)手指上都有三四個(gè)堿基,幾個(gè)手指串聯(lián)起來(lái)就成為具有高度特異性地識(shí)別DNA序列,因此,改造鋅指蛋白被廣泛引用到靶基因的DNA識(shí)別中。鋅指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)又稱鋅指蛋白核酸酶,是一種經(jīng)過(guò)人工改造的核酸內(nèi)切酶,鋅指蛋白作為DNA識(shí)別域結(jié)合到一個(gè)非特異性內(nèi)切酶上,由一個(gè)DNA識(shí)別域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成,其中DNA識(shí)別域賦予特異性,在DNA特定位點(diǎn)結(jié)合,而非特異性核酸內(nèi)切酶賦剪切功能,兩者結(jié)合就可在DNA特定位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)斷裂。

    根據(jù)不同的靶序列,需要設(shè)計(jì)8~10個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域,將這些鋅結(jié)構(gòu)域連在DNA核酸酶上,便可實(shí)現(xiàn)靶序列的雙鏈斷裂。Kim等利用相對(duì)簡(jiǎn)單的模塊化和結(jié)構(gòu)的調(diào)整,設(shè)計(jì)了第一個(gè)鋅指蛋白核酸酶,該酶使用3個(gè)具有公式序列的鋅指結(jié)構(gòu)域蛋白與鋅指結(jié)構(gòu)域鏈接一個(gè)FokI核酸酶的催化活性功能域,結(jié)構(gòu)表明人工合成的ZFN可以特異性地識(shí)別切割靶位點(diǎn)。

    1.2 TALEN

    TALE(Transcription Activator-like Effector) 由Jens等人在黃單胞菌中發(fā)現(xiàn)。轉(zhuǎn)錄激活因子(TAL)效應(yīng)是一種新的DNA幾何蛋白,它直接調(diào)控宿主的基因表達(dá),在經(jīng)由細(xì)菌遞送到宿主細(xì)胞中,TAL效應(yīng)器進(jìn)入細(xì)胞核,綁定在宿主基因啟動(dòng)子特異性效應(yīng)序列和活化轉(zhuǎn)錄。TALEN由一個(gè)包含核定位信號(hào)(Nuclear localization signal,NLS)N端結(jié)構(gòu)域、一個(gè)包含可識(shí)別特定DNA序列的典型串聯(lián)TALE重復(fù)序列的中央結(jié)構(gòu)域,以及一個(gè)具有FokI核酸內(nèi)切酶功能的C端結(jié)構(gòu)域組成。不同類型的TALEN元件識(shí)別的特異性 DNA序列長(zhǎng)度有很大區(qū)別。一般來(lái)說(shuō),天然的TALEN元件識(shí)別的特異性DNA序列長(zhǎng)度一般為17~18bp,而人工TALEN元件識(shí)別的特異性DNA序列長(zhǎng)度則一般為14~20bp。

    1.3 CRISPR-Cas9系統(tǒng)

    CRISPR系統(tǒng)結(jié)構(gòu)由一個(gè)Cas基因、一個(gè)前導(dǎo)序列、一個(gè)末端重復(fù)序列與CRISPR(捕獲的噬菌體或質(zhì)粒核酸)組成。CRISPR序列能特異性識(shí)別外源核酸序列,作為向?qū)NA;CAS蛋白的非特異性核酸內(nèi)切酶將外源核酸切斷,CAS9蛋白是一個(gè)分子質(zhì)量很大的多功能蛋白,是一條雙鏈DNA酶,有兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域,即HNH和RuvC,在剪切DNA鏈時(shí),分別切割靶DNA的一條鏈。

    在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中,酶Cas9在靶點(diǎn)DNA上進(jìn)行切割。Cas9蛋白催化一種被稱作CRISPR RNA(crRNA)的RNA分子利用它的一部分序列與另一種被稱作tracr RNA的RNA分子通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合在一起,形成嵌合RNA(racrRNA/crRNA),Cas9蛋白在此過(guò)程中,起催化作用,促使crRNA成熟。借助crRNA的另一部分序列與靶DNA位點(diǎn)進(jìn)行堿基配對(duì),以這種形式來(lái)確定靶基因。這種嵌合RNA接著就能夠引導(dǎo)Cas9結(jié)合到這個(gè)靶點(diǎn)上進(jìn)行切割,以降解入侵的噬菌體DNA或是外源質(zhì)粒。

    1.4 三大基因編輯技術(shù)比較

    三大基因編輯技術(shù)工都是由兩部分組成,即DNA特異性識(shí)別結(jié)合域和核酸內(nèi)切酶活性區(qū)域。ZNF和TALENS技術(shù)都是由一個(gè)二聚體與FokI核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域相結(jié)合,而CRISPR-CAS9系統(tǒng)由一個(gè)單一的Cas9蛋白與嵌合RNA組成,序列特異性由RNA決定,裂解介導(dǎo)由Cas9蛋白完成。ZNF和TALEN在執(zhí)行基因編輯前,都需根據(jù)靶序列進(jìn)行設(shè)計(jì),ZFN的設(shè)計(jì)較為困難,因?yàn)殇\指蛋白與DNA之間的相互作用的復(fù)雜性質(zhì),以及特異性序列的進(jìn)一步限制,使得設(shè)計(jì)良好的ZNF非常昂貴;而TALENS更易設(shè)計(jì),因?yàn)橛械鞍踪|(zhì)之間的重復(fù)序列和核苷酸序列的一對(duì)一的識(shí)別規(guī)則,以及他們的結(jié)構(gòu)已經(jīng)能夠通過(guò)有效的。CRISPR-Cas9更為簡(jiǎn)單,只需要修改識(shí)別RNA,便可識(shí)別不同的靶序列。

    理論上,ZFN可以針對(duì)任何序列,但在實(shí)踐中,ZFN對(duì)非特異性位點(diǎn)的切割的這一現(xiàn)象,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性和基因毒性,因此ZFN的廣泛應(yīng)用受到了制約。TALENS需要在第一位置有胸苷殘基,因此會(huì)有所限制,而且有時(shí)不能產(chǎn)生預(yù)期的突變,因此,每個(gè)TALEN都必須經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。有研究表明,CRISPR-Cas9在高效靶向DNA編輯功能上,也會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)配、脫靶切割現(xiàn)象,目前已確認(rèn)15個(gè)脫靶位點(diǎn),并需繼續(xù)分析脫靶位點(diǎn),以減少潛在的脫靶與錯(cuò)配。盡管如此,相對(duì)于CRISPR-Cas9系統(tǒng),ZFN與TALENS有更多的脫靶活動(dòng),由此,CRISPR-Cas9系統(tǒng)還是具有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)。

    TALEN和CRISPR都是高效基因組編輯工具,但各有自身限制。TALEN對(duì)胞嘧啶甲基化敏感,而CRISPR對(duì)甲基化不敏感;TALEN的效率比CRISPR低,但TALEN導(dǎo)致脫靶突變的可能性更低,即使雙切口酶、截短了的guide RNAs和Cas9-Fok1融合體可提高CRISPR的特異性。

    2 基因組編輯技術(shù)在病毒基因治療的應(yīng)用

    2.1 乙型肝炎病毒(HBV)治療

    乙型肝炎病毒(HBV)是一種DNA病毒,可導(dǎo)致肝硬化和肝癌的發(fā)生,給全球的人們帶來(lái)嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān),每年的感染人數(shù)也十分巨大。盡管現(xiàn)在有抗病毒藥物可以控制乙肝病毒,但不能完全清除,需要長(zhǎng)期治療。由此通過(guò)徹底消除所有病毒復(fù)制中間體,特別是共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)成為一個(gè)新的治療方向[1]。2008年,kimberley等人第一個(gè)提出通過(guò)基因編輯方法來(lái)對(duì)付乙肝病毒復(fù)制。他們?cè)O(shè)計(jì)了6種不同的鋅指蛋白(ZFP)鎖定乙肝病毒增強(qiáng)子序列,在每個(gè)ZFP的存在下,病毒RNA被顯著降低,蛋白質(zhì)水平顯著下降,細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒也顯著降低[2]。2013年,Kristie等人設(shè)計(jì)了4種TALEN針對(duì)病毒基因組內(nèi)HBV特異性位點(diǎn),首次證明介導(dǎo)有針對(duì)性的核酸酶可以是HBV中cccDNA中斷,表明,這些工程化核酸酶具有潛在的治療慢性HBV感染的用途[3]。世界各地的研究人員通過(guò)利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)來(lái)治療HBV感染,發(fā)現(xiàn)有非常大的可行性。Christoph Seeger等人發(fā)現(xiàn),90%以上的乙肝病毒DNA都能被Cas9切割,并證實(shí)CRISPR-Cas9系統(tǒng)在功能上讓HBV cccDNA失活,在慢性乙肝治療上是最好途徑[4]。在新研究中,研究人員利用CRISPR-Cas9系統(tǒng),對(duì)感染HBV病毒的哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯,他們靶向切割了HBV病毒cccDNA中的一些特異性位點(diǎn),觀察到HBV總DNA和cccDNA下降了92%[5]。在相關(guān)研究中都表明,CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以有效地去除感染者體內(nèi)的HBV cccDNA,能用于乙肝的治療[6-7],是否能在未來(lái)體現(xiàn)實(shí)際的價(jià)值,還有待研究人員的繼續(xù)探索。

    2.2 HIV病毒治療

    另一種至今讓人無(wú)從下手的病毒就是HIV病毒,作為一種RNA病毒,HIV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒。當(dāng)感染人細(xì)胞時(shí),它會(huì)將自身的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA后插入宿主基因組中以便復(fù)制和合成新的病毒顆粒。CCR5在病毒感染過(guò)程中起到重要的作用,ZFN和TALEN都是通過(guò)下調(diào)CCR5表達(dá)量阻斷病毒的感染。研究人員利用腺病毒載體攜帶針對(duì)人源CCR5的ZFN在體外敲除HIV-1感染所需的供受體CCR5,通過(guò)構(gòu)建新型的重組核酸酶TALEN并將其靶向內(nèi)源性的人類CCR5基因是,也同樣證實(shí)了其可行性[8]。CRISRP/Cas系統(tǒng)則最為直接的切除病毒基因。Ebian等人發(fā)現(xiàn)利用CRISPR-Cas9系統(tǒng),能夠破壞HIV-1原病毒,使HIV-1 LTR表達(dá)休眠,并能夠去除宿主細(xì)胞染色體內(nèi)的病毒基因[9]。利用基因編輯技術(shù)首次成功地從活的動(dòng)物基因組中切除HIV-1 DNA中的一端序列由美國(guó)天普大學(xué)劉易斯-卡茨醫(yī)學(xué)院的研究人員獲得。利用rAAV載體運(yùn)送系統(tǒng)將CRISPR/Cas9分子運(yùn)送到動(dòng)物的血液后,HIV-1的特定DNA片段都被從病毒基因組中切除[10]。這一治療策略給治療HIV感染開(kāi)辟了一條新的道路。

    3 結(jié)語(yǔ)

    基因編輯技術(shù)的應(yīng)用非常廣泛,除了疾病的治療,在建立病毒基因庫(kù)、特異性位點(diǎn)標(biāo)記都可以進(jìn)行基因水平的研究。三大基因編輯技術(shù)都對(duì)生物研究及醫(yī)療領(lǐng)域有潛在的革新意義。為了發(fā)掘出這些技術(shù)的潛力,仍有許多重要的問(wèn)題及挑戰(zhàn),如解決錯(cuò)配、脫靶等現(xiàn)象,更快速、高效地進(jìn)行基因編輯,以及更加深入的了解基因編輯技術(shù)都是未來(lái)需要研究的?;蚪M編輯技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域已占有相當(dāng)重要的地位,在人類疾病研究中也已有出色的表現(xiàn),雖然現(xiàn)在仍在研究階段,但相信通過(guò)研究者們的不懈努力,會(huì)切實(shí)的應(yīng)用到疾病的常規(guī)治療中,尤其是遺傳疾病及病毒治療。同時(shí),對(duì)于現(xiàn)在發(fā)病率很高的癌癥,是否可以敲除人類的致癌基因,使人們遠(yuǎn)離癌癥,都是值得研究和期望的。

    [1]Maepa MB,Roelofse I,Ely A,et al.Progress and Prospects of Anti-HBV Gene Therapy Development[J].Int J Mol Sci,2015,16(8):17589-17610.

    [2]Zimmerman KA,Fischer KP,Joyce MA,et al.Zinc Finger Proteins Designed to Specifically Target Duck Hepatitis B Virus Covalently Closed Circular DNA Inhibit Viral Transcription in Tissue Culture[J].J Virol 2008,82(16):8013-8021.

    [3]Bloom K,Ely A,Mussolino C,et al.Inactivation of Hepatitis B Virus Replication in Cultured Cells and in Vivo with Engineered Transcription Activator-like Effector Nucleases[J].Mol Ther,2013,21(10):1889-1897.

    [4]Seeger C,Sohn JA.Complete Spectrum of CRISPR/Cas9-induced Mutations on HBV cccDNA[J].Mol Ther,2016,24(7):1258-1266.

    [5]Ramanan V,Shlomai A,Cox DB,et al.CRISPR/Cas9 Cleavage of Viral DNA Efficiently Suppresses Hepatitis B Virus[J].Sci Rep,2015,5:10833-10841.

    [6]Zhen S,Hua L,Liu YH,et al.Harnessing the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/CRISPR-associated Cas9 System to Disrupt the Hepatitis B Virus[J].Gene Ther,2015,22(5):404-412.

    [7]Zhu W,Xie K,Xu Y,et al.CRISPR/Cas9 produces anti-hepatitis B virus effect in hepatoma cells and transgenic mouse[J].Virus Res,2016,217:125-132.

    [8]季海艷,夏海濱.基于趨化因子受體CCR5阻斷HIV-1感染的方法[J].生命的化學(xué),2013(1):34-40.

    [9]Ebina H,Misawa N,Kanemura Y,et al.Harnessing the CRISPR/Cas9 System to Disrupt Latent HIV-1 Provirus[J].Sci Rep,2013,3(8):2510-2516.

    [10]Kaminski R,Bella R,Yin C,et al.Excision of HIV-1 DNA by Gene Editing:a Proof-of-Concept in vivo Study[J].Gene Ther,2016,23(8-9):690-695.

    Genome Editing Technology and its Application in Gene Knockout and Viral Gene Therapy

    Zhong Yan-jun
    (Shanghai Taiyin Biotechnology Co.,Ltd ,Shanghai 201400)

    Gene editing technology is a technology of cutting and modifing the genome,which developed in recent years.With the zinc finger nuclease (ZFN),transcriptional activation of effector nucleases (TALEN) and CRISPRCas9 system,three genome editing technology developed in succession,genome editing technology has been rapid development.Open up a new path for gene therapy.

    ZFN;TALEN;CRISPR-Cas9;Gene knockout

    Q789

    A

    2096-0387(2017)05-0095-04

    鐘艷君(1987—),女,上海人,本科,目前在職攻讀上海交通大學(xué)生物工程領(lǐng)域工程碩士專業(yè)學(xué)位,研究方向:生物工程。

    猜你喜歡
    核酸酶鋅指結(jié)構(gòu)域
    粘質(zhì)沙雷氏菌全能核酸酶的研究進(jìn)展
    鋅指蛋白與肝細(xì)胞癌的研究進(jìn)展
    C2H2型鋅指蛋白在腫瘤基因調(diào)控中的研究進(jìn)展
    含季銨鹽的芳酰腙配體的銅 (Ⅱ)配合物的合成和表征:體外DNA鍵合和核酸酶活性
    多種Cas12a蛋白變體能識(shí)別不同的PAM序列(2020.4.27 Plant Biotechnology Journal)
    蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域劃分方法及在線服務(wù)綜述
    用megaTAL 核酸酶對(duì)原代人T 細(xì)胞CCR5 基因座進(jìn)行有效修飾可建立HIV-1 抵抗力
    重組綠豆BBI(6-33)結(jié)構(gòu)域的抗腫瘤作用分析
    組蛋白甲基化酶Set2片段調(diào)控SET結(jié)構(gòu)域催化活性的探討
    Myc結(jié)合的鋅指蛋白1評(píng)估實(shí)驗(yàn)性急性胰腺炎疾病嚴(yán)重程度的價(jià)值
    大型黄色视频在线免费观看| 亚洲精品一区av在线观看| 波多野结衣高清无吗| 亚洲国产精品999在线| 午夜a级毛片| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产三级中文精品| 色在线成人网| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲av.av天堂| 国产成年人精品一区二区| 综合色av麻豆| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日韩av在线大香蕉| 高清毛片免费观看视频网站| 免费在线观看成人毛片| 亚洲美女搞黄在线观看 | 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产一区二区三区视频了| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 日本免费a在线| 精品熟女少妇八av免费久了| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 动漫黄色视频在线观看| 有码 亚洲区| 一本一本综合久久| 日本一本二区三区精品| 悠悠久久av| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 日韩有码中文字幕| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品久久久久久久电影| 熟女电影av网| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 一区二区三区免费毛片| 日韩高清综合在线| 三级毛片av免费| 亚洲男人的天堂狠狠| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲最大成人中文| 亚洲第一区二区三区不卡| 日韩免费av在线播放| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲激情在线av| 午夜福利免费观看在线| 毛片一级片免费看久久久久 | 国产高清视频在线观看网站| 一本久久中文字幕| 免费观看精品视频网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| av在线天堂中文字幕| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲国产精品合色在线| 国产一区二区在线观看日韩| 丝袜美腿在线中文| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲国产精品合色在线| 国产私拍福利视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲中文日韩欧美视频| 嫩草影视91久久| 综合色av麻豆| 欧美极品一区二区三区四区| 麻豆成人av在线观看| 黄色女人牲交| 国产淫片久久久久久久久 | 国内揄拍国产精品人妻在线| 男插女下体视频免费在线播放| 久久人妻av系列| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲最大成人av| 欧美色欧美亚洲另类二区| 中文资源天堂在线| 午夜影院日韩av| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产精品亚洲美女久久久| 日韩欧美精品v在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 观看免费一级毛片| 嫩草影视91久久| 99国产综合亚洲精品| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久久久久久久久成人| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 特级一级黄色大片| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产真实乱freesex| 波多野结衣巨乳人妻| 国产av在哪里看| 制服丝袜大香蕉在线| 99久国产av精品| 一个人看的www免费观看视频| 国产免费av片在线观看野外av| 国产成人影院久久av| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 日本a在线网址| 特大巨黑吊av在线直播| 中文亚洲av片在线观看爽| 波多野结衣高清作品| 精品熟女少妇八av免费久了| 欧美精品啪啪一区二区三区| 黄片小视频在线播放| 久久午夜亚洲精品久久| 成人永久免费在线观看视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲成av人片在线播放无| 91av网一区二区| 免费搜索国产男女视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 此物有八面人人有两片| 夜夜爽天天搞| 淫妇啪啪啪对白视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 综合色av麻豆| 亚洲av电影不卡..在线观看| 全区人妻精品视频| 舔av片在线| 国产精品久久久久久久久免 | 天美传媒精品一区二区| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 国产精品久久久久久人妻精品电影| 久久久久精品国产欧美久久久| 国内精品美女久久久久久| 久久精品综合一区二区三区| 成人亚洲精品av一区二区| 国产视频一区二区在线看| 九色成人免费人妻av| 99久久精品国产亚洲精品| 天天一区二区日本电影三级| 国产欧美日韩精品亚洲av| 老司机午夜十八禁免费视频| .国产精品久久| 亚洲18禁久久av| 51国产日韩欧美| 欧美+日韩+精品| 久久亚洲精品不卡| 可以在线观看的亚洲视频| 亚州av有码| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲av美国av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲经典国产精华液单 | 国产午夜精品论理片| 亚洲片人在线观看| 热99re8久久精品国产| 99国产精品一区二区三区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品日韩av在线免费观看| 美女高潮的动态| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲av成人av| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 深爱激情五月婷婷| 真实男女啪啪啪动态图| 日韩成人在线观看一区二区三区| 在现免费观看毛片| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 99久国产av精品| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美高清性xxxxhd video| 国产极品精品免费视频能看的| 90打野战视频偷拍视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 免费看a级黄色片| 毛片一级片免费看久久久久 | 国产探花极品一区二区| 久久精品影院6| 99久国产av精品| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产av一区在线观看免费| 日本免费一区二区三区高清不卡| 日本a在线网址| 久久久精品大字幕| 国产不卡一卡二| 51午夜福利影视在线观看| 免费在线观看亚洲国产| 动漫黄色视频在线观看| 欧美精品国产亚洲| 99热这里只有是精品在线观看 | 亚洲成人久久爱视频| 成人国产综合亚洲| 俄罗斯特黄特色一大片| 99精品在免费线老司机午夜| 美女免费视频网站| 国产美女午夜福利| 日韩中文字幕欧美一区二区| 精品免费久久久久久久清纯| 中文字幕av在线有码专区| av欧美777| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美区成人在线视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 日本三级黄在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 男插女下体视频免费在线播放| 韩国av一区二区三区四区| 丰满的人妻完整版| 亚洲精品456在线播放app | АⅤ资源中文在线天堂| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 性色avwww在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产伦精品一区二区三区视频9| 午夜精品久久久久久毛片777| 国内精品一区二区在线观看| 舔av片在线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产在线男女| 久久精品影院6| 99热这里只有精品一区| 无遮挡黄片免费观看| 毛片女人毛片| 欧美日韩综合久久久久久 | 夜夜爽天天搞| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 在线观看舔阴道视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 老司机福利观看| 国产乱人视频| 在现免费观看毛片| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 免费观看精品视频网站| 美女黄网站色视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 搡老岳熟女国产| 麻豆国产av国片精品| 国内精品一区二区在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产黄a三级三级三级人| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久欧美精品欧美久久欧美| 好男人在线观看高清免费视频| 伦理电影大哥的女人| 亚洲无线在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| avwww免费| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲 国产 在线| 嫁个100分男人电影在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 香蕉av资源在线| 欧美3d第一页| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲成av人片免费观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 最近中文字幕高清免费大全6 | 久久精品国产亚洲av涩爱 | 激情在线观看视频在线高清| 制服丝袜大香蕉在线| 免费一级毛片在线播放高清视频| 精品乱码久久久久久99久播| 久久久久精品国产欧美久久久| 精品人妻视频免费看| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 91久久精品国产一区二区成人| 在线播放无遮挡| 一二三四社区在线视频社区8| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 精品人妻视频免费看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 成人特级黄色片久久久久久久| 一区二区三区四区激情视频 | 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产精品不卡视频一区二区 | 国产精品乱码一区二三区的特点| 超碰av人人做人人爽久久| 国产伦精品一区二区三区四那| 黄片小视频在线播放| 亚洲久久久久久中文字幕| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久久国产成人免费| av福利片在线观看| 久久午夜福利片| 99国产精品一区二区三区| 久久久精品欧美日韩精品| 色5月婷婷丁香| 99在线人妻在线中文字幕| 在线播放国产精品三级| 久久国产乱子免费精品| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲专区中文字幕在线| 一进一出抽搐动态| 精品人妻偷拍中文字幕| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 免费搜索国产男女视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日本免费a在线| 亚洲午夜理论影院| 国产精品三级大全| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 精品午夜福利在线看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 一进一出好大好爽视频| 级片在线观看| 黄片小视频在线播放| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美bdsm另类| 午夜福利成人在线免费观看| 最新中文字幕久久久久| 亚洲美女搞黄在线观看 | 国产av在哪里看| 成年人黄色毛片网站| 中文字幕av在线有码专区| 无遮挡黄片免费观看| 观看美女的网站| 久久久国产成人免费| 亚洲三级黄色毛片| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美激情在线99| 免费在线观看日本一区| 免费看a级黄色片| 午夜福利在线观看吧| 人人妻人人看人人澡| 亚洲美女视频黄频| bbb黄色大片| 欧美激情久久久久久爽电影| 99热只有精品国产| 国产视频内射| 日韩中文字幕欧美一区二区| 乱人视频在线观看| 九色国产91popny在线| 国产野战对白在线观看| 一本久久中文字幕| 国产免费男女视频| 嫩草影院新地址| 内射极品少妇av片p| av在线天堂中文字幕| 免费av观看视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| av在线老鸭窝| АⅤ资源中文在线天堂| 午夜视频国产福利| 99国产综合亚洲精品| 国产熟女xx| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 91九色精品人成在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 露出奶头的视频| 赤兔流量卡办理| 淫秽高清视频在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 18禁在线播放成人免费| 内射极品少妇av片p| 国产黄色小视频在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 久久6这里有精品| 亚洲国产精品合色在线| 一区二区三区免费毛片| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 此物有八面人人有两片| 性欧美人与动物交配| 丁香欧美五月| 日本三级黄在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 日韩欧美在线二视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲第一电影网av| 久久中文看片网| 亚洲在线自拍视频| 亚洲国产欧美人成| 韩国av一区二区三区四区| 免费观看人在逋| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲av熟女| 亚洲经典国产精华液单 | 精品人妻偷拍中文字幕| 色视频www国产| 国产真实伦视频高清在线观看 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产精品国产高清国产av| 欧美成人a在线观看| 国产视频一区二区在线看| 午夜福利视频1000在线观看| 国产高潮美女av| 51国产日韩欧美| av中文乱码字幕在线| 国产单亲对白刺激| 热99在线观看视频| 亚洲av成人精品一区久久| 九色成人免费人妻av| 中文字幕高清在线视频| 男女之事视频高清在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 99riav亚洲国产免费| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| av女优亚洲男人天堂| 嫩草影视91久久| 美女高潮的动态| 一a级毛片在线观看| 在线播放国产精品三级| АⅤ资源中文在线天堂| 久久久久免费精品人妻一区二区| 一区二区三区四区激情视频 | 久99久视频精品免费| 成人国产一区最新在线观看| 国产成人欧美在线观看| 精品国产三级普通话版| 国产高清三级在线| 九九热线精品视视频播放| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久亚洲真实| 麻豆久久精品国产亚洲av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日本与韩国留学比较| 亚洲av电影不卡..在线观看| 在线免费观看的www视频| 99热精品在线国产| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲黑人精品在线| 欧美三级亚洲精品| 美女 人体艺术 gogo| 美女大奶头视频| 久久伊人香网站| 黄片小视频在线播放| av专区在线播放| 一级毛片久久久久久久久女| 欧美最新免费一区二区三区 | 国语自产精品视频在线第100页| a在线观看视频网站| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲性夜色夜夜综合| 成人永久免费在线观看视频| 最近最新免费中文字幕在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产日本99.免费观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 在现免费观看毛片| 免费看a级黄色片| 亚洲人成网站在线播| 精品乱码久久久久久99久播| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲av第一区精品v没综合| 欧美日韩综合久久久久久 | 99久国产av精品| 久久精品国产清高在天天线| 成人欧美大片| 狠狠狠狠99中文字幕| 在线天堂最新版资源| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲精品成人久久久久久| 天堂影院成人在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 国产毛片a区久久久久| 最后的刺客免费高清国语| 久久久久久九九精品二区国产| 制服丝袜大香蕉在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 可以在线观看的亚洲视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产久久久一区二区三区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产伦在线观看视频一区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| ponron亚洲| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 波多野结衣巨乳人妻| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 动漫黄色视频在线观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 免费人成在线观看视频色| 日韩欧美免费精品| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 51国产日韩欧美| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 午夜亚洲福利在线播放| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产视频内射| 我的女老师完整版在线观看| 在线播放无遮挡| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美日韩黄片免| 99热这里只有是精品在线观看 | 看片在线看免费视频| 90打野战视频偷拍视频| 欧美高清成人免费视频www| 国产伦精品一区二区三区视频9| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲一区高清亚洲精品| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产视频内射| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 成年人黄色毛片网站| 日韩精品中文字幕看吧| 嫩草影院精品99| 看黄色毛片网站| 亚洲18禁久久av| 免费观看精品视频网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 色综合婷婷激情| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 老司机深夜福利视频在线观看| 成人午夜高清在线视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 中文资源天堂在线| 在线观看av片永久免费下载| 欧美成人性av电影在线观看| 国产午夜精品论理片| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产成年人精品一区二区| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲av美国av| 怎么达到女性高潮| 国产一区二区在线av高清观看| 丁香六月欧美| 90打野战视频偷拍视频| 色5月婷婷丁香| 69人妻影院| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产成人影院久久av| 麻豆久久精品国产亚洲av| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 最好的美女福利视频网| 免费看日本二区| 亚洲片人在线观看| 一本精品99久久精品77| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产av麻豆久久久久久久| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 久久香蕉精品热| 1024手机看黄色片| 久久欧美精品欧美久久欧美| 一级av片app| 国产伦精品一区二区三区视频9| 最近最新中文字幕大全电影3| 丰满人妻一区二区三区视频av| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲最大成人av| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 麻豆av噜噜一区二区三区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 日韩精品中文字幕看吧| 国产成人av教育| 欧美午夜高清在线| 搞女人的毛片| 亚洲人成电影免费在线| 精品一区二区免费观看| 国产伦在线观看视频一区| 男人和女人高潮做爰伦理| 男人舔女人下体高潮全视频| 18+在线观看网站| 国产精华一区二区三区| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产av麻豆久久久久久久| 97热精品久久久久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 成人欧美大片| 午夜老司机福利剧场| 午夜影院日韩av| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产精品久久视频播放| 久久国产乱子伦精品免费另类| 欧美最黄视频在线播放免费| 精品久久久久久久末码| 免费看a级黄色片| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 性插视频无遮挡在线免费观看| 最好的美女福利视频网| 99热精品在线国产| 在线观看午夜福利视频| 一级a爱片免费观看的视频| a级一级毛片免费在线观看| a在线观看视频网站| 日韩中字成人| 在线播放无遮挡| 最近在线观看免费完整版| 久久99热这里只有精品18| 国产伦在线观看视频一区| 能在线免费观看的黄片| 宅男免费午夜| 国产毛片a区久久久久| 99热这里只有是精品在线观看 | 久久久久久久亚洲中文字幕 | 亚洲成人久久性| 久久伊人香网站|