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    基因組編輯技術(shù)及在病毒基因治療的應(yīng)用

    2017-04-09 00:39:01鐘艷君
    生物化工 2017年5期
    關(guān)鍵詞:核酸酶鋅指結(jié)構(gòu)域

    鐘艷君

    (上海泰因生物技術(shù)有限公司,上海 201400)

    基因組編輯技術(shù)及在病毒基因治療的應(yīng)用

    鐘艷君

    (上海泰因生物技術(shù)有限公司,上海 201400)

    基因組編輯技術(shù)是對(duì)基因組進(jìn)行切割、修飾的一種發(fā)展迅速的技術(shù)。隨著鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)、CRISPR-Cas9系統(tǒng)三大基因組編輯技術(shù)的相繼開(kāi)發(fā),基因組編輯技術(shù)得到飛速的發(fā)展,在基因治療方面開(kāi)辟了一條新的道路。本文綜述了基因組編輯技術(shù)及在病毒基因療法的應(yīng)用現(xiàn)狀。

    ZFN;TALEN;CRISPR-Cas9;病毒治療

    基因組編輯是一種精確修飾基因的技術(shù),并在近年發(fā)展迅速,它可以對(duì)基因的多位點(diǎn)及小片段進(jìn)行融合、突變及刪減等,可在基因組水平上進(jìn)行精確的基因修改。在科研領(lǐng)域,對(duì)構(gòu)建模式動(dòng)物,可以節(jié)約大量人力和財(cái)力,在醫(yī)療領(lǐng)域,對(duì)疾病發(fā)病機(jī)理和基因功能的探索,可以通過(guò)基因組編輯技術(shù)更加準(zhǔn)確、深入地了解,并且可以改造基因,達(dá)到基因治療的目的等。因此,基因組編輯技術(shù)的發(fā)展前景及應(yīng)用價(jià)值非常廣泛。隨著鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)、CRISPR-Cas9系統(tǒng)三大基因組編輯技術(shù)的相繼開(kāi)發(fā),基因組編輯技術(shù)得到飛速的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用。

    1 三大基因編輯技術(shù)

    1.1 鋅指核酸酶ZFN

    鋅指蛋白最早在非洲爪蟾中發(fā)現(xiàn),是所有后生動(dòng)物中最常見(jiàn)的DNA序列。鋅指蛋白有-個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域,每個(gè)結(jié)構(gòu)域由30個(gè)氨基酸組成,并具有Cys2-His2,它們通過(guò)Zn2+穩(wěn)定結(jié)合形成手指狀結(jié)構(gòu),因此成為“鋅指蛋白”。鋅指蛋白每個(gè)手指上都有三四個(gè)堿基,幾個(gè)手指串聯(lián)起來(lái)就成為具有高度特異性地識(shí)別DNA序列,因此,改造鋅指蛋白被廣泛引用到靶基因的DNA識(shí)別中。鋅指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)又稱鋅指蛋白核酸酶,是一種經(jīng)過(guò)人工改造的核酸內(nèi)切酶,鋅指蛋白作為DNA識(shí)別域結(jié)合到一個(gè)非特異性內(nèi)切酶上,由一個(gè)DNA識(shí)別域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成,其中DNA識(shí)別域賦予特異性,在DNA特定位點(diǎn)結(jié)合,而非特異性核酸內(nèi)切酶賦剪切功能,兩者結(jié)合就可在DNA特定位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)斷裂。

    根據(jù)不同的靶序列,需要設(shè)計(jì)8~10個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域,將這些鋅結(jié)構(gòu)域連在DNA核酸酶上,便可實(shí)現(xiàn)靶序列的雙鏈斷裂。Kim等利用相對(duì)簡(jiǎn)單的模塊化和結(jié)構(gòu)的調(diào)整,設(shè)計(jì)了第一個(gè)鋅指蛋白核酸酶,該酶使用3個(gè)具有公式序列的鋅指結(jié)構(gòu)域蛋白與鋅指結(jié)構(gòu)域鏈接一個(gè)FokI核酸酶的催化活性功能域,結(jié)構(gòu)表明人工合成的ZFN可以特異性地識(shí)別切割靶位點(diǎn)。

    1.2 TALEN

    TALE(Transcription Activator-like Effector) 由Jens等人在黃單胞菌中發(fā)現(xiàn)。轉(zhuǎn)錄激活因子(TAL)效應(yīng)是一種新的DNA幾何蛋白,它直接調(diào)控宿主的基因表達(dá),在經(jīng)由細(xì)菌遞送到宿主細(xì)胞中,TAL效應(yīng)器進(jìn)入細(xì)胞核,綁定在宿主基因啟動(dòng)子特異性效應(yīng)序列和活化轉(zhuǎn)錄。TALEN由一個(gè)包含核定位信號(hào)(Nuclear localization signal,NLS)N端結(jié)構(gòu)域、一個(gè)包含可識(shí)別特定DNA序列的典型串聯(lián)TALE重復(fù)序列的中央結(jié)構(gòu)域,以及一個(gè)具有FokI核酸內(nèi)切酶功能的C端結(jié)構(gòu)域組成。不同類型的TALEN元件識(shí)別的特異性 DNA序列長(zhǎng)度有很大區(qū)別。一般來(lái)說(shuō),天然的TALEN元件識(shí)別的特異性DNA序列長(zhǎng)度一般為17~18bp,而人工TALEN元件識(shí)別的特異性DNA序列長(zhǎng)度則一般為14~20bp。

    1.3 CRISPR-Cas9系統(tǒng)

    CRISPR系統(tǒng)結(jié)構(gòu)由一個(gè)Cas基因、一個(gè)前導(dǎo)序列、一個(gè)末端重復(fù)序列與CRISPR(捕獲的噬菌體或質(zhì)粒核酸)組成。CRISPR序列能特異性識(shí)別外源核酸序列,作為向?qū)NA;CAS蛋白的非特異性核酸內(nèi)切酶將外源核酸切斷,CAS9蛋白是一個(gè)分子質(zhì)量很大的多功能蛋白,是一條雙鏈DNA酶,有兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域,即HNH和RuvC,在剪切DNA鏈時(shí),分別切割靶DNA的一條鏈。

    在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中,酶Cas9在靶點(diǎn)DNA上進(jìn)行切割。Cas9蛋白催化一種被稱作CRISPR RNA(crRNA)的RNA分子利用它的一部分序列與另一種被稱作tracr RNA的RNA分子通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合在一起,形成嵌合RNA(racrRNA/crRNA),Cas9蛋白在此過(guò)程中,起催化作用,促使crRNA成熟。借助crRNA的另一部分序列與靶DNA位點(diǎn)進(jìn)行堿基配對(duì),以這種形式來(lái)確定靶基因。這種嵌合RNA接著就能夠引導(dǎo)Cas9結(jié)合到這個(gè)靶點(diǎn)上進(jìn)行切割,以降解入侵的噬菌體DNA或是外源質(zhì)粒。

    1.4 三大基因編輯技術(shù)比較

    三大基因編輯技術(shù)工都是由兩部分組成,即DNA特異性識(shí)別結(jié)合域和核酸內(nèi)切酶活性區(qū)域。ZNF和TALENS技術(shù)都是由一個(gè)二聚體與FokI核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域相結(jié)合,而CRISPR-CAS9系統(tǒng)由一個(gè)單一的Cas9蛋白與嵌合RNA組成,序列特異性由RNA決定,裂解介導(dǎo)由Cas9蛋白完成。ZNF和TALEN在執(zhí)行基因編輯前,都需根據(jù)靶序列進(jìn)行設(shè)計(jì),ZFN的設(shè)計(jì)較為困難,因?yàn)殇\指蛋白與DNA之間的相互作用的復(fù)雜性質(zhì),以及特異性序列的進(jìn)一步限制,使得設(shè)計(jì)良好的ZNF非常昂貴;而TALENS更易設(shè)計(jì),因?yàn)橛械鞍踪|(zhì)之間的重復(fù)序列和核苷酸序列的一對(duì)一的識(shí)別規(guī)則,以及他們的結(jié)構(gòu)已經(jīng)能夠通過(guò)有效的。CRISPR-Cas9更為簡(jiǎn)單,只需要修改識(shí)別RNA,便可識(shí)別不同的靶序列。

    理論上,ZFN可以針對(duì)任何序列,但在實(shí)踐中,ZFN對(duì)非特異性位點(diǎn)的切割的這一現(xiàn)象,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性和基因毒性,因此ZFN的廣泛應(yīng)用受到了制約。TALENS需要在第一位置有胸苷殘基,因此會(huì)有所限制,而且有時(shí)不能產(chǎn)生預(yù)期的突變,因此,每個(gè)TALEN都必須經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。有研究表明,CRISPR-Cas9在高效靶向DNA編輯功能上,也會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)配、脫靶切割現(xiàn)象,目前已確認(rèn)15個(gè)脫靶位點(diǎn),并需繼續(xù)分析脫靶位點(diǎn),以減少潛在的脫靶與錯(cuò)配。盡管如此,相對(duì)于CRISPR-Cas9系統(tǒng),ZFN與TALENS有更多的脫靶活動(dòng),由此,CRISPR-Cas9系統(tǒng)還是具有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)。

    TALEN和CRISPR都是高效基因組編輯工具,但各有自身限制。TALEN對(duì)胞嘧啶甲基化敏感,而CRISPR對(duì)甲基化不敏感;TALEN的效率比CRISPR低,但TALEN導(dǎo)致脫靶突變的可能性更低,即使雙切口酶、截短了的guide RNAs和Cas9-Fok1融合體可提高CRISPR的特異性。

    2 基因組編輯技術(shù)在病毒基因治療的應(yīng)用

    2.1 乙型肝炎病毒(HBV)治療

    乙型肝炎病毒(HBV)是一種DNA病毒,可導(dǎo)致肝硬化和肝癌的發(fā)生,給全球的人們帶來(lái)嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān),每年的感染人數(shù)也十分巨大。盡管現(xiàn)在有抗病毒藥物可以控制乙肝病毒,但不能完全清除,需要長(zhǎng)期治療。由此通過(guò)徹底消除所有病毒復(fù)制中間體,特別是共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)成為一個(gè)新的治療方向[1]。2008年,kimberley等人第一個(gè)提出通過(guò)基因編輯方法來(lái)對(duì)付乙肝病毒復(fù)制。他們?cè)O(shè)計(jì)了6種不同的鋅指蛋白(ZFP)鎖定乙肝病毒增強(qiáng)子序列,在每個(gè)ZFP的存在下,病毒RNA被顯著降低,蛋白質(zhì)水平顯著下降,細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒也顯著降低[2]。2013年,Kristie等人設(shè)計(jì)了4種TALEN針對(duì)病毒基因組內(nèi)HBV特異性位點(diǎn),首次證明介導(dǎo)有針對(duì)性的核酸酶可以是HBV中cccDNA中斷,表明,這些工程化核酸酶具有潛在的治療慢性HBV感染的用途[3]。世界各地的研究人員通過(guò)利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)來(lái)治療HBV感染,發(fā)現(xiàn)有非常大的可行性。Christoph Seeger等人發(fā)現(xiàn),90%以上的乙肝病毒DNA都能被Cas9切割,并證實(shí)CRISPR-Cas9系統(tǒng)在功能上讓HBV cccDNA失活,在慢性乙肝治療上是最好途徑[4]。在新研究中,研究人員利用CRISPR-Cas9系統(tǒng),對(duì)感染HBV病毒的哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯,他們靶向切割了HBV病毒cccDNA中的一些特異性位點(diǎn),觀察到HBV總DNA和cccDNA下降了92%[5]。在相關(guān)研究中都表明,CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以有效地去除感染者體內(nèi)的HBV cccDNA,能用于乙肝的治療[6-7],是否能在未來(lái)體現(xiàn)實(shí)際的價(jià)值,還有待研究人員的繼續(xù)探索。

    2.2 HIV病毒治療

    另一種至今讓人無(wú)從下手的病毒就是HIV病毒,作為一種RNA病毒,HIV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒。當(dāng)感染人細(xì)胞時(shí),它會(huì)將自身的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA后插入宿主基因組中以便復(fù)制和合成新的病毒顆粒。CCR5在病毒感染過(guò)程中起到重要的作用,ZFN和TALEN都是通過(guò)下調(diào)CCR5表達(dá)量阻斷病毒的感染。研究人員利用腺病毒載體攜帶針對(duì)人源CCR5的ZFN在體外敲除HIV-1感染所需的供受體CCR5,通過(guò)構(gòu)建新型的重組核酸酶TALEN并將其靶向內(nèi)源性的人類CCR5基因是,也同樣證實(shí)了其可行性[8]。CRISRP/Cas系統(tǒng)則最為直接的切除病毒基因。Ebian等人發(fā)現(xiàn)利用CRISPR-Cas9系統(tǒng),能夠破壞HIV-1原病毒,使HIV-1 LTR表達(dá)休眠,并能夠去除宿主細(xì)胞染色體內(nèi)的病毒基因[9]。利用基因編輯技術(shù)首次成功地從活的動(dòng)物基因組中切除HIV-1 DNA中的一端序列由美國(guó)天普大學(xué)劉易斯-卡茨醫(yī)學(xué)院的研究人員獲得。利用rAAV載體運(yùn)送系統(tǒng)將CRISPR/Cas9分子運(yùn)送到動(dòng)物的血液后,HIV-1的特定DNA片段都被從病毒基因組中切除[10]。這一治療策略給治療HIV感染開(kāi)辟了一條新的道路。

    3 結(jié)語(yǔ)

    基因編輯技術(shù)的應(yīng)用非常廣泛,除了疾病的治療,在建立病毒基因庫(kù)、特異性位點(diǎn)標(biāo)記都可以進(jìn)行基因水平的研究。三大基因編輯技術(shù)都對(duì)生物研究及醫(yī)療領(lǐng)域有潛在的革新意義。為了發(fā)掘出這些技術(shù)的潛力,仍有許多重要的問(wèn)題及挑戰(zhàn),如解決錯(cuò)配、脫靶等現(xiàn)象,更快速、高效地進(jìn)行基因編輯,以及更加深入的了解基因編輯技術(shù)都是未來(lái)需要研究的?;蚪M編輯技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域已占有相當(dāng)重要的地位,在人類疾病研究中也已有出色的表現(xiàn),雖然現(xiàn)在仍在研究階段,但相信通過(guò)研究者們的不懈努力,會(huì)切實(shí)的應(yīng)用到疾病的常規(guī)治療中,尤其是遺傳疾病及病毒治療。同時(shí),對(duì)于現(xiàn)在發(fā)病率很高的癌癥,是否可以敲除人類的致癌基因,使人們遠(yuǎn)離癌癥,都是值得研究和期望的。

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    Genome Editing Technology and its Application in Gene Knockout and Viral Gene Therapy

    Zhong Yan-jun
    (Shanghai Taiyin Biotechnology Co.,Ltd ,Shanghai 201400)

    Gene editing technology is a technology of cutting and modifing the genome,which developed in recent years.With the zinc finger nuclease (ZFN),transcriptional activation of effector nucleases (TALEN) and CRISPRCas9 system,three genome editing technology developed in succession,genome editing technology has been rapid development.Open up a new path for gene therapy.

    ZFN;TALEN;CRISPR-Cas9;Gene knockout

    Q789

    A

    2096-0387(2017)05-0095-04

    鐘艷君(1987—),女,上海人,本科,目前在職攻讀上海交通大學(xué)生物工程領(lǐng)域工程碩士專業(yè)學(xué)位,研究方向:生物工程。

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