摻鍶聚磷酸鈣骨修復(fù)材料對成骨細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子蛋白分泌量的影響

俞雷鈞

（浙江省立同德醫(yī)院骨傷科，浙江杭州 310012）

摻鍶聚磷酸鈣骨修復(fù)材料對成骨細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子蛋白分泌量的影響

俞雷鈞

（浙江省立同德醫(yī)院骨傷科，浙江杭州 310012）

目的探討摻鍶聚磷酸鈣骨修復(fù)材料對成骨細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）蛋白分泌量的影響。方法制備不同含鍶量的摻鍶聚磷酸鈣骨修復(fù)材料，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定成骨細(xì)胞的VEGF蛋白分泌量，并采用噻唑藍(lán)(MTT)法考察其對成骨細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果ELISA法結(jié)果表明，培養(yǎng)7 d后，1%，3%，5%，8%，10%含鍶量的摻鍶聚磷酸鈣作用的成骨細(xì)胞VEGF分泌量均高于聚磷酸鈣，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝6.561，11.454，11.256，15.149，9.778，P＜0.05)，其中，8%含鍶量摻鍶聚磷酸鈣作用的成骨細(xì)胞VEGF分泌量最高。MTT法結(jié)果表明，培養(yǎng)3，5，7，9 d后，8%摻鍶聚磷酸鈣、聚磷酸鈣浸提液作用的成骨細(xì)胞的吸光度（A）值高于陰性對照，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝3.960，5.029，5.229，4.808，2.584，2.954，2.657，2.798，P＜0.05)；培養(yǎng)5，7，9 d后，8%摻鍶聚磷酸鈣浸提液作用的成骨細(xì)胞的A值高于聚磷酸鈣，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝2.583，2.930，1.934，P＜0.05)。結(jié)論摻鍶聚磷酸鈣作為一種新型的骨修復(fù)材料，能促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌VEGF，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

摻鍶聚磷酸鈣；骨修復(fù)材料；成骨細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子

生物組織工程材料植入體內(nèi)后，促進(jìn)血管的形成過程復(fù)雜而緩慢，因而將大尺寸骨修復(fù)材料植入體內(nèi)后，周圍血管組織的血管化過程已成為研究熱點(diǎn)。關(guān)鍵是骨修復(fù)材料是否能促進(jìn)成骨細(xì)胞或周圍細(xì)胞大量分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，加速周圍血管組織的血管化過程[1－3]。VEGF在生理與病理?xiàng)l件下能促進(jìn)血管形成和生長，作用機(jī)制主要是加速血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂過程[4]。摻鍶聚磷酸鈣是一種新型的骨修復(fù)材料，有良好的骨源性、生物相容性和生物降解性，植入人體后的安全性良好[5－7]。本研究中，考察了不同含鍶量的摻鍶聚磷酸鈣骨修復(fù)材料對成骨細(xì)胞VEGF蛋白分泌量的影響，旨在為骨科臨床提供新的骨修復(fù)材料。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、儀器與試劑

細(xì)胞：大鼠ROS 17／2.8成骨細(xì)胞株，購于四川大學(xué)華西醫(yī)院移植工程與移植免疫實(shí)驗(yàn)室。

儀器：AG－10TA型電子萬能試驗(yàn)機(jī)（日本島津公司）；MCO－18AIC型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；BIO－RAD608型酶標(biāo)儀（美國BioRad公司）；IX2－SL型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

試劑：碳酸鍶（分析純，成都市科龍化工試劑廠，批號為1405231）；碳酸鈣（分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司，批號為150117）；聚乙烯醇（分析純，重慶北碚精細(xì)化工廠）；DMEM培養(yǎng)基、胰酶（美國GIBCO公司）；胎牛血清（北京圣馬元亨生物制品研究所）；噻唑藍(lán)（MTT，美國Sigma公司）；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒（美國R＆D Systems公司）；二甲亞砜、硬脂酸、磷酸、無水乙醇均為分析純(國藥化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 制備方法

按照一定摩爾百分比的鍶／鈣分別稱取碳酸鍶和碳酸鈣，加入磷酸溶液中反應(yīng)生成相應(yīng)的磷酸二氫鹽，室溫至少放置12 h，用無水乙醇去除剩余的磷酸直至pH為6。將上述混合鹽，置坩堝內(nèi)500℃恒溫下煅燒12 h，再采用15℃／min的速率逐漸升溫至1 200℃，此時混合鹽熔融，保溫1 h，淬火得摻鍶聚磷酸鈣無定型燒料。研磨無定型燒料，過200目篩，另取過60目篩硬脂酸作為致孔劑，聚乙烯醇作為黏合劑，與摻鍶聚磷酸鈣粉末充分混合，壓制成高2 mm、直徑10 mm的胚，800℃恒溫下持續(xù)燒制3 h，得摻鍶聚磷酸鈣多孔支架。

1.3 VEGF 蛋白量測定

成骨細(xì)胞VEGF蛋白分泌量的測定采用ELISA法[8]。將成骨細(xì)胞與不同摻鍶量的摻鍶聚磷酸鈣多孔支架和不加鍶的聚磷酸鈣的復(fù)合恒溫37℃培養(yǎng)至細(xì)胞匯合（n＝8），在培養(yǎng)基中加入1，25－(OH)2VD3，使終濃度為10－7mmol／L，再恒溫37℃培養(yǎng)7 d后離心，取得上清液，遵照ELISA試劑盒的說明書測定上清液中的VEGF蛋白量。

1.4 成骨細(xì)胞增殖影響試驗(yàn)

將摻鍶聚磷酸鈣、聚磷酸鈣在121℃下高壓滅菌20 min，按培養(yǎng)液與試樣表面積之比為100 L／m2，無菌浸提72 h制作材料浸提液。在96孔板的孔中加入100 μL成骨細(xì)胞懸液與100 μL材料浸提液，成骨細(xì)胞接種濃度為4×107／L；陰性對照孔則僅加入200 μL培養(yǎng)液（n＝8）；37℃恒溫培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)1，3，5，7，9 d后加入20 μL MTT，并繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再吸出孔中的培養(yǎng)液，每孔加二甲亞砜150 μL，置振蕩器上振蕩15 min，然后采用酶標(biāo)儀測定各個孔在570 nm波長處的吸光度（A），得成骨細(xì)胞的增殖情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對成骨細(xì)胞VEGF 分泌量的影響

ELISA法結(jié)果表明，培養(yǎng)7 d后，1%，3%，5%，8%，10%含鍶量的摻鍶聚磷酸鈣作用的成骨細(xì)胞VEGF分泌量均高于聚磷酸鈣(t＝6.561，11.454，11.256，15.149，9.778，P＜0.05)，其中8%含鍶量摻鍶聚磷酸鈣作用的成骨細(xì)胞VEGF分泌量最高。結(jié)果見圖1和表1。

圖1 不同含鍶量摻鍶聚磷酸鈣對成骨細(xì)胞分泌VEGF的影響

表1 不同含鍶量摻鍶聚磷酸鈣對成骨細(xì)胞分泌VEGF的影響(±s，n＝8)

表1 不同含鍶量摻鍶聚磷酸鈣對成骨細(xì)胞分泌VEGF的影響(±s，n＝8)

2.2 對成骨細(xì)胞增殖的影響

MTT法結(jié)果表明，培養(yǎng)3，5，7，9 d后，8%摻鍶聚磷酸鈣、聚磷酸鈣浸提液作用的成骨細(xì)胞的A值均高于陰性對照(t＝3.960，5.029，5.229，4.808，2.584，2.954，2.657，2.798，P＜0.05)；培養(yǎng)5，7，9 d后，8%摻鍶聚磷酸鈣浸提液作用的成骨細(xì)胞的A值高于聚磷酸鈣(t＝2.583，2.930，1.934，P＜0.05)。結(jié)果見表2和圖2。

表2 不同材料對成骨細(xì)胞增殖的影響(±s，n＝8)

表2 不同材料對成骨細(xì)胞增殖的影響(±s，n＝8)

注：與陰性對照比較，aP＜0.05；與聚磷酸鈣比較，bP＜0.05。

材料A值8%摻鍶聚磷酸鈣聚磷酸鈣陰性對照1 d 0.21±0.09 0.25±0.10 0.23±0.07 3 d 0.52±0.12a0.42±0.08a0.31±0.09 5 d 0.71±0.17ab0.52±0.12a0.35±0.11 7 d 0.97±0.18ab0.74±0.13a0.58±0.11 9 d 0.94±0.16ab0.79±0.15a0.60±0.12

圖2 不同材料對成骨細(xì)胞增殖的影響

3 討論

鍶是人體中重要的微量元素，主要存在于骨骼與牙齒內(nèi)，而其中的99%均蓄積在骨骼，其質(zhì)量約占骨總質(zhì)量的萬分之一。鍶元素在體內(nèi)可有效降低破骨細(xì)胞來源并抑制其活性，從而抑制骨吸收；可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，加速其分化過程，從而促進(jìn)成骨。但鍶的以上作用與其濃度有關(guān)，應(yīng)在局部達(dá)到有效濃度，鍶元素才能充分發(fā)揮加速成骨細(xì)胞增殖及抑制骨吸收的生物活性，從而加速受損骨組織的修復(fù)，有效提高骨骼的強(qiáng)度與韌性。

血管生成及再生在骨組織傷口的愈合過程中尤為重要，一定程度上決定了患者的預(yù)后[9]。骨科手術(shù)需要植入生物材料與組織工程移植物，聚磷酸鈣是非常重要的組織工程材料，具有良好的生物相容性[10－12]。植入組織工程材料后的局部血管形成過程十分緩慢，想達(dá)到大尺寸移植物及血管組織的有效血管化較為困難。將人VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子與組織工程材料相結(jié)合，或在植入材料中結(jié)合血管生成基因、血管肽或轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的多肽[13]，取得了較理想的效果，但均需要加入其他物質(zhì)對移植物進(jìn)行物理性和化學(xué)性修飾，修飾的方法較為復(fù)雜，因而在臨床中的應(yīng)用受到一定限制。

血管生成過程受到多種旁分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，VEGF為重要的促血管生成因子，同時也構(gòu)成了細(xì)胞外信號分子中的VEGF／血小板生長因子[14]。正常的生理狀態(tài)下和病理狀態(tài)下，VEGF均對機(jī)體的血管形成與發(fā)展有重要的促進(jìn)作用，其作用機(jī)制在于促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，有利于血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透作用，從而延長其生存周期。本研究結(jié)果表明，和聚磷酸鈣相比，以摻鍶聚磷酸鈣支架材料培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的VEGF分泌量更大，且8%含鍶量摻鍶聚磷酸鈣作用的成骨細(xì)胞VEGF分泌量最高，說明鍶對成骨細(xì)胞VEGF的蛋白表達(dá)量具有明顯的促進(jìn)作用。

同時，摻鍶聚磷酸鈣又能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖過程，加速在骨修復(fù)過程中骨組織再生。這是由于在聚磷酸鈣材料中加入鍶能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，這就有更多的細(xì)胞處于生長活躍期，能分泌出更多量的VEGF，繼而表現(xiàn)出VEGF蛋白表達(dá)量提高。此外，鍶可改變聚磷酸鈣骨修復(fù)材料的三維微觀結(jié)構(gòu)，更接近于骨組織的正常結(jié)構(gòu)，可為成骨細(xì)胞提供了更好的生長環(huán)境，從而使VEGF分泌量明顯增加[15]。

綜上所述，8%含鍶量的摻鍶聚磷酸鈣作為一種新型骨修復(fù)材料，能促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌VEGF，促進(jìn)骨修復(fù)過程中周圍血管生成，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

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Effect of Strontium Doped Calcium Phosphate Bone Repair Material on VEGF Protein Secretion in Osteoblasts

Yu Leijun

(Department of Orthopaedics and Traumatology,Zhejiang Tongde Hospital,Hangzhou,Zhejiang,China310012)

Objective To learn the effect of strontium doped calcium phosphate bone repair material on VEGF protein secretion in osteoblasts and to provide a new bone repair material for orthopedics clinic.MethodsThe strontium doped calcium phosphate bone repair materials with different strontium content were prepared.The VEGF protein secretion was measured by ELISA method,and the effect of MTT on the proliferation of osteoblasts was investigated.ResultsThe results of ELISA method after 7 d showed that the secretion of VEGF in osteoblasts of 1%,3%,5%,8%,10%strontium doped calcium phosphate were higher than calcium phosphate,and the differences were statistically significant(t＝6.561,11.454,11.256,15.149,9.778,P＜0.05).Among them,the content of VEGF was the highest in the 8%calcium containing calcium strontium calcium phosphate.The results of MTT method showed that the A values of 3,5,7,9 d was higher than that of the negative control,and the value of the osteoblasts was higher than that of the negative control, and the differences were statistically significant(t＝3.960,5.029,5.229,4.808,2.584,2.954,2.657,2.798,P＜0.05).After culture 5,7,9 d,the A value of the osteoblast of the 8%calcium doped calcium phosphate solution were higher than that of calcium phosphate,and the differences were statistically significant(t＝2.583,2.930,1.934,P＜0.05).ConclusionAs a new bone repair material,strontium doped calcium phosphate can promote the secretion of VEGF,which has a good clinical application prospects.

strontium doped calcium phosphate;bone repair material;osteoblast;vascular endothelial growth factor

R965；R687.3

A

1006－4931(2017)01－0010－04

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.01.003

2016－10－07)

浙江省科學(xué)技術(shù)廳2014年合作研發(fā)和成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目[2014F50005]。

俞雷鈞，男，大學(xué)本科，副主任醫(yī)師，主要從事臨床脊柱外科工作，（電話）0571－89972350。