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    霍亂弧菌新發(fā)菌株中vipA,vipB和clpV對(duì)T6SS轉(zhuǎn)錄調(diào)控

    2022-02-28 12:21:10吳文軒張幸鼎趙文婧
    關(guān)鍵詞:硫胺素霍亂弧菌基因簇

    吳文軒,郭 揚(yáng),張幸鼎,趙文婧

    (中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院,廣東深圳 518107)

    霍亂是一種烈性傳染病,2010 年海地爆發(fā)霍亂疫情,相對(duì)于El Tor 經(jīng)典株海地變種El Tor 霍亂弧菌不僅在臨床上表現(xiàn)出更快的傳播力和更高的死亡率,也在動(dòng)物模型上表現(xiàn)出更強(qiáng)的定植力和毒力[1-2]。已有研究表明,六型分泌系統(tǒng)(Type Ⅵsecretion system,T6SS)對(duì)霍亂弧菌的生存和致病起著關(guān)鍵作用,例如其效應(yīng)因子VgrG-1 靶向真核生物,可以引起巨噬細(xì)胞或捕食性阿米巴細(xì)胞毒性肌動(dòng)蛋白交聯(lián),從而逃避捕食[3-5]。霍亂弧菌T6SS 基因簇由一個(gè)編碼結(jié)構(gòu)蛋白的主基因簇(VC0105-VC0124)和至少3 個(gè)附軸(VCA0017-VCA0021、VCA1415-VCA1419 和 VCA0284-VCA0286)構(gòu)成[6]。有研究報(bào)道通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法,將第七次霍亂流行的El Tor 菌株N16961、C6706 和海地變異菌株H1 的T6SS 轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較,H1 株T6SS有著更高的轉(zhuǎn)錄水平;尤其是T6SS 鞘蛋白(VipA,VipB)和鞘水解蛋白(ClpV)[5]。我們猜測(cè)基因vipA,vipB和clpV中是否存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子調(diào)控T6SS轉(zhuǎn)錄。雖然霍亂弧菌是研究T6SS 調(diào)控的模式菌株,但是霍亂弧菌會(huì)隨著環(huán)境的變化會(huì)快速產(chǎn)生適應(yīng)性突變。在2016 也門爆發(fā)近代史上最大的霍亂疫情,也門霍亂弧菌同樣為El Tor 霍亂弧菌的變種,同樣表現(xiàn)出更強(qiáng)的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度[7-8]。探索新發(fā)疫情細(xì)菌H1 的T6SS 調(diào)控機(jī)制對(duì)于深刻了解T6SS 對(duì)于病原菌致病性,以及在細(xì)菌進(jìn)化中的作用,有著重要意義。為了探索霍亂弧菌新發(fā)菌株H1 的T6SS 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,本研究以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)榛A(chǔ),分析H1 株分別由于vipA敲除(H1ΔvipA),vipB敲除(H1ΔvipB)和clpV敲除(H1ΔclpV)時(shí)T6SS基因簇的轉(zhuǎn)錄水平,并對(duì)其差異基因進(jìn)行了基因本體論(Gene ontology,GO)富集和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集。旨在分析H1 株中結(jié)構(gòu)相關(guān)基因與T6SS 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)性,完善霍亂弧菌T6SS 調(diào)控圖譜;H1 株的T6SS 調(diào)控對(duì)將T6SS 作為靶標(biāo)來(lái)防治霍亂弧菌等病原菌的傳害提供重要理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

    根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將霍亂弧菌H1 株wt 和突變株培養(yǎng)于添加終濃度為100 μg/mL 的鏈霉素的LB 培養(yǎng)基,37 ℃,1.4×g的搖床中培養(yǎng);添加100 μg/mL的鏈霉素和1%瓊脂粉的LB 培養(yǎng)基,37 ℃靜置培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守《生物安全保障承諾書(shū)》中的相關(guān)規(guī)定,按照標(biāo)準(zhǔn)操作展開(kāi)實(shí)驗(yàn)活動(dòng),確保實(shí)驗(yàn)室安全。

    1.2 主要試劑

    載體(pWM91 Vector,實(shí)驗(yàn)室自存);限制性內(nèi)切酶(NotI-HF 和SacI,NEB 公司);連接酶(T4 DNA Ligase,NEB 公司);Taq 酶(PrimeSTAR Max Premix,Takara 公司);感受態(tài)(SM10 和DH5α λ pir,實(shí)驗(yàn)室自存);TRIzol 試劑(TRIzol Reagent,Thermo公司);RNA 提取試劑盒(Pure Link RNA Mini Kit,Invitrogen 公司);DNA 清除試劑盒(Ambionogen-RNA Mini Kit,Invitrogen 公司);RNA-seq 建庫(kù)試劑盒(Next? Ultra Ⅱ?Directional RNA Library Prep Kit for Illumina,NEB 公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Evo MMLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR,艾科瑞公司);熒光定量試劑盒(SYBR? Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit,艾科瑞公司)。

    1.3 突變菌株構(gòu)建

    選取目標(biāo)基因上下游各800 bp 的序列分別進(jìn)行擴(kuò)增,將上下游片段的黏性末端相連組成1 600 bp片段克隆到pWM91自殺質(zhì)粒中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至SM10 感受態(tài)中,并與H1 wt 于37 ℃共培養(yǎng)2 h;保證重組質(zhì)粒整合至H1菌株的基因組中完成第1 次同源重組。將完成第一次同源重組的H1 菌株在含有6%蔗糖的平板上涂布,由于重組質(zhì)粒攜帶sacB基因。迫于蔗糖的選擇壓力,此時(shí)發(fā)生第2 次同源重組,目標(biāo)基因被敲除突變菌株構(gòu)建完成。按照以上方法在H1 wt基礎(chǔ)上構(gòu)建H1ΔvipA,H1ΔvipB和H1ΔclpV。

    1.4 細(xì)菌總RNA提取

    于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,取109CFU 細(xì)菌于1 mL 的TRIzol 中,加入250 mg 的玻璃砂,勻漿2 次每次1 min。加入400 μL 的氯仿于樣品中混勻,在4 ℃預(yù)冷離心機(jī)中13 200 ×g離心30 min。取水相上清,按照Pure Link RNA Mini Kit 說(shuō)明書(shū)提取總RNA,隨后根據(jù)Ambionink RNA Mini Kit 的說(shuō)明書(shū)去除樣品中的DNA,得到純化的總RNA 樣品。利用Nanodrop One,1%瓊脂糖電泳(120V,30 min)和Agilent 4200檢測(cè)RNA 樣品的完整性、純度和總量,合格者進(jìn)行接下來(lái)的測(cè)序分析。每個(gè)菌株重復(fù)3 次,作為3次生物學(xué)重復(fù)。

    1.5 轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)、測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

    將合格的RNA 樣品按照Next? Ultra Ⅱ?Directional RNA Library Prep Kit for Illumina 的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA 雙鏈合成和測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建,利用Agilent 2100 對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估;合格的文庫(kù)通過(guò)llumina Hiseq 平臺(tái)進(jìn)行RNA-seq 測(cè)序得到RNA-seq 原始數(shù)據(jù)。CLC Workbench 12.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和過(guò)濾。將過(guò)濾后的數(shù)據(jù)與從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載H1 wt 菌株的參考基因組文件進(jìn)行比對(duì),得到測(cè)序片段計(jì)數(shù)矩陣并運(yùn)用TMM 的方法進(jìn)行均一化。最后以H1 wt 菌株轉(zhuǎn)錄組作為內(nèi)參獲得差異基因的表達(dá)矩陣,并用BH 方法對(duì)P-value 進(jìn)行矯正;以FDR<0.01 且|log2FC|≥1為標(biāo)準(zhǔn)定義差異基因。

    1.6 逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測(cè)

    利用熒光定量PCR 方法,對(duì)T6SS 基因簇中部分基因的RNA-seq 結(jié)果進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證。RNA 樣品1 μg 按照Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)體系如下:2×SYBR? Green Pro Taq HS Premix 10 μL、cDNA 2 μL、上下游特異性引物(10 μmol/L)各0.4 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、RNase free water 6.8 μL,引物序列均在NCBI 中驗(yàn)證。擴(kuò)增程序:95 ℃運(yùn)行30 s循環(huán)1次,95 ℃運(yùn)行5 s,60 ℃運(yùn)行30 s循環(huán)40次。每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)3次,以gyrB作為管家基因,以H1 wt的CT值作為樣本間標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參,使用log2FC計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    使用Hiplot(https://hiplot.com.cn)對(duì)RNA-seq的差異基因進(jìn)行聚類分析、可視化分析和交叉關(guān)系展示。將H1 wt 基因組序列與eggNOG(http://eggnog-mapper.embl.de/)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),得到有GO和KO功能注釋的差異基因,并使用clusterProfiler R 進(jìn)行GO 和KEGG 富集。采用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示。

    2 結(jié)果

    2.1 H1ΔvipA,H1ΔvipB 和H1ΔclpV 的T6SS 基因簇轉(zhuǎn)錄水平不同

    利用RNA-seq 技術(shù),將H1 wt 轉(zhuǎn)錄組作為樣本間標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi) 參,得 到H1ΔvipA,H1ΔvipB和H1ΔclpV的T6SS 基因簇log2FC 趨勢(shì)圖(圖1)。以|log2FC|≥1 為基準(zhǔn),認(rèn)為有差異。由圖1 可知,H1ΔvipA株T6SS 主 軸vipB(log2FC=4.18)、hsiF(log2FC=4.28)、vasA(log2FC=3.59)、vasB(log2FC=3.71)、vasC(log2FC=3.91)、vasD(log2FC=3.81)、vasE(log2FC=3.41)、vasF(log2FC=3.58)、clpV(log2FC=3.39)、vasH(log2FC=3.38)、vasI(log2FC=3.71)、vasJ(log2FC=3.40)、vasK(log2FC=3.31)、vasL(log2FC=2.60)和vgrG-3(log2FC=1.51),以及T6SS 附軸hcp-1(log2FC=3.59)、vgrG-1(log2FC=1.62)、hcp-2(log2FC=3.45)和vgrG-2(log2FC=2.21)的轉(zhuǎn)錄水平都呈增高趨勢(shì);僅vipA(log2FC=-11.78)轉(zhuǎn)錄水平由于敲除呈降低趨勢(shì)。H1ΔvipB株tsiV-3(log2FC=-1.23)、VC1420(log2FC=-1.06)和vipB(log2FC=-9.02)的轉(zhuǎn)錄水平呈降低趨勢(shì),其余基因|log2FC|均小于1。H1ΔclpV株tsiH(log2FC=1.32)轉(zhuǎn)錄水平呈增高趨勢(shì);僅clpV(log2FC=-8.45)轉(zhuǎn)錄水平由于敲除呈降低趨勢(shì)。

    圖1 H1ΔvipA,H1ΔvipB和H1ΔclpV株的T6SS基因簇轉(zhuǎn)錄水平Fig.1 The expression level of genes of T6SS clusters across H1ΔvipA,H1ΔvipB and H1ΔclpV

    2.2 H1ΔvipA,H1ΔvipB和H1ΔclpV轉(zhuǎn)錄組分析

    以H1 wt 轉(zhuǎn)錄組為樣本間標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參,尋找由于vipA,vipB和clpV基因敲除引起的轉(zhuǎn)錄差異。以FDR<0.01 且|log2FC|≥1 為標(biāo)準(zhǔn)定義差異表達(dá)基因,并且對(duì)差異基因進(jìn)行聚類分析(圖2A)。H1ΔvipA的差異基因共有22 個(gè),其中19 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),3 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)(圖2B);H1ΔvipB的差異基因有44 個(gè),其中17 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),27 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)(圖2C);H1ΔclpV的差異基因有86 個(gè),其中49 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),35 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)(圖2D)。并且H1ΔvipB和H1ΔclpV擁有相同的23 個(gè)差異基因;H1ΔvipB和H1ΔvipA有4 個(gè)相同的差異基因(hapA,hapR,vipB,KW3_RS0115980);H1ΔvipA和H1ΔclpV有4 個(gè)相同的差異基因(hapA,hapR,clpV,KW3_RS0115980);H1ΔvipA,H1ΔvipB和H1ΔclpV共同擁有的差異基因有3 個(gè)(hapA,hapR,KW3_RS0 115980;圖2E)。

    圖2 H1ΔvipA,H1ΔvipB和H1ΔclpV差異基因分析Fig.2 Differentially expressed genes across H1ΔvipA,H1ΔvipB and H1ΔclpV

    2.3 H1ΔvipA,H1ΔvipB 和H1ΔclpV 的差異表達(dá)基因的GO和KEGG分析

    以H1 wt 的GO 注釋作為基因背景,對(duì)H1ΔvipA,H1ΔvipB和H1ΔclpV的差異基因進(jìn)行GO 富集。H1ΔvipA的差異基因GO 富集通路主要涉及細(xì)胞外區(qū)域(extracellular region)、多機(jī)體過(guò)程(multi-organism process)、發(fā)病機(jī)制(pathogenesis)和物種間相互作用(interspecies interaction)等(圖3A)。H1ΔvipB的差異基因GO 富集通路主要涉及二甲基酸運(yùn)輸(dicarboxylic acid transport)、C4-二甲基運(yùn)輸(C4-dicarboxylate transport)、有機(jī)酸運(yùn)輸(organic acid transport)和有機(jī)離子運(yùn)輸(organic anion transport)等(圖3B)。H1ΔclpV的差異基因GO 富集通路主要涉及結(jié)構(gòu)分子活性(structural molecule activity)、核糖體的結(jié)構(gòu)成分(structural constituent of ribosome)、肽代謝過(guò)程(peptide metabolic process)和肽生物合成過(guò)程(peptide biosynthetic process)等(圖3C)。

    圖3 H1ΔvipA,H1ΔvipB和H1ΔclpV差異表達(dá)基因的GO富集Fig.3 GO enrichment of DEGs across H1ΔvipA,H1ΔvipB and H1ΔclpV

    以H1 wt 的KEGG 注釋作為基因背景,對(duì)H1ΔvipA,H1ΔvipB和H1ΔclpV的差異基因進(jìn)行KEGG 富集。H1ΔvipA的差異基因KEGG 富集通路主要涉及霍亂弧菌生物膜形成(biofilm formation-Vibrio cholerae,圖4A)。H1ΔvipB的差異基因KEGG富集通路主要涉及布塔諾酸鹽代謝(butanoate metabolism)、雙組件系統(tǒng)(two-component system)、霍亂弧菌生物膜形成(biofilm formation-Vibrio cholerae)和酮體的合成和降解等(synthesis and degradation of ketone bodies,圖4B)。H1ΔclpV的差異基因KEGG 富集通路主要涉及硫銨代謝(thiamine metabolism)等(圖4C)。

    圖4 H1ΔvipA,H1ΔvipB和H1ΔclpV差異表達(dá)基因的KEGG富集Fig.4 KEGG enrichment of DEGs across H1ΔvipA,H1ΔvipB and H1ΔclpV

    2.4 熒光定量PCR驗(yàn)證

    挑選T6SS 基因簇中部分基因以及hapR對(duì)H1ΔvipA,H1ΔvipB和H1ΔclpV的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行qPCR 驗(yàn) 證。H1ΔvipA的決定性系數(shù)為0.801 3;H1ΔvipB的決定性系數(shù)為0.816 5;H1ΔclpV的決定性系數(shù)為0.800 0,各個(gè)菌株T6SS 部分基因和hapR轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢(shì)與RNA-seq結(jié)果基本一致(圖5)。

    3 討論

    為了探究霍亂弧菌H1 新發(fā)株T6SS 結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因是否調(diào)控T6SS 轉(zhuǎn)錄,我們構(gòu)建了多個(gè)T6SS 敲除株。通過(guò)H1ΔvipA,H1ΔvipB和H1ΔclpV的T6SS 轉(zhuǎn)錄水平比 較,發(fā)現(xiàn) 僅vipA缺 失,H1 株T6SS 下游基因整體轉(zhuǎn)錄水平顯著性增高,包括下游的vipB和clpV;與其共編碼VipA/VipB 鞘蛋白復(fù)合體的vipB缺失和編碼鞘蛋白水解酶的clpV缺失,T6SS 轉(zhuǎn)錄水平卻無(wú)整體變化。同時(shí)RNA-seq 的結(jié)果表示H1ΔvipA有22 個(gè)差異基因,其中有18 個(gè)屬于T6SS 基因簇(圖2B)。已有研究表明,霍亂弧菌的鞘蛋白是高度保守的,其同源物已在所有T6SS結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn);并且VipA 和VipB 蛋白相結(jié)合是保證T6SS 活性的必要條件。在霍亂弧菌O1 V1552 中,vipA缺失會(huì)導(dǎo)致VipB 不能穩(wěn)定產(chǎn)生[9]。在同樣擁有T6SS 的土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)中,vipA同源物基因的缺失,使vipB同源基因的轉(zhuǎn)錄水平下降兩倍,而vipB同源基因的缺失對(duì)vipA同源基因的轉(zhuǎn)錄水平并無(wú)影響[10]。以往研究表明vipA與vipB轉(zhuǎn)錄水平應(yīng)當(dāng)是相對(duì)穩(wěn)定的,而將vipA缺失vipB水平卻增高400 多倍(圖5),這種結(jié)果是從未報(bào)道過(guò)的。

    圖5 H1ΔvipA,H1ΔvipB和H1ΔclpV T6SS基因簇RNA-seq數(shù)據(jù)的qPCR驗(yàn)證Fig.5 Verification of RNA-seq data of genes of T6SS clusters by qPCR across H1ΔvipA,H1ΔvipB and H1ΔclpV

    H1ΔvipA,H1ΔvipB和H1ΔclpV共同擁有的差異基因有3 個(gè)(hapR,hapA,KW3_RS0115980)(圖2E)。在霍亂弧菌中,HapR是一種群體感應(yīng)通路主要的調(diào)節(jié)因子,可通過(guò)抑制霍亂弧菌多糖合成的調(diào)控基因vpsT及vpsR的表達(dá),來(lái)抑制霍亂弧菌生物膜形成和毒力基因的表達(dá);同時(shí)HapR 也可與T6SS附軸啟動(dòng)子結(jié)合,激活T6SS附軸的轉(zhuǎn)錄[11-13]。當(dāng)細(xì)胞密度較低時(shí),磷酸化的LuxO 激活Qrr sRNA 產(chǎn)生,激活A(yù)phA 的翻譯并抑制HapR 的翻譯,從而降低T6SS 附軸的轉(zhuǎn)錄水平;Qrr sRNA 也可通過(guò)與T6SS主基因簇的mRNA 堿基互補(bǔ)配對(duì)直接抑制T6SS 主軸轉(zhuǎn)錄[14]。當(dāng)細(xì)胞密度較高時(shí),LuxO 未磷酸化,Qrr sRNA 不轉(zhuǎn)錄,HapR 穩(wěn)定表達(dá),此時(shí)T6SS 主軸中的調(diào)控因子vasH 與HapR 一起促進(jìn)T6SS 附軸轉(zhuǎn)錄[11]。結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,H1ΔvipA株中hapR是轉(zhuǎn)錄差異基因,并呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì);而hapR在H1ΔvipB和H1ΔclpV中呈明顯增高趨勢(shì)(圖2B-D)。這提示我們,hapR可能參與H1 株中vipA對(duì)T6SS 基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,并與vipA轉(zhuǎn)錄趨勢(shì)一致。同時(shí),vipA可以調(diào)控T6SS 轉(zhuǎn)錄水平可能由于vipA與其他T6SS主軸基因共用一個(gè)啟動(dòng)子[6],并且vipA是T6SS主軸啟動(dòng)子后的第一個(gè)基因,可能作為反式作用因子結(jié)合阻遏蛋白,從而抑制后續(xù)T6SS基因簇轉(zhuǎn)錄。

    HapA 是hapA編碼的金屬蛋白酶,是一種霍亂弧菌O1 分泌的輔助毒素。其通過(guò)水解宿主黏蛋白、降低宿主細(xì)胞間的緊密連接、水解宿主的免疫蛋白等放方式加速疾病進(jìn)程[15]。在霍亂弧菌中,hapA的轉(zhuǎn)錄由HapR和RpoS共同調(diào)控,在營(yíng)養(yǎng)受限或細(xì)胞密度較高時(shí),群體感應(yīng)調(diào)控蛋白HapR 穩(wěn)定表達(dá),從而直接激活hapA的轉(zhuǎn)錄[16]。本實(shí)驗(yàn)中hapA和hapR表達(dá)趨勢(shì)一致并且與野生型有顯著差異性,即 在H1ΔvipA中hapA(log2FC=-3.89)和hapR(log2FC=-8.00)表達(dá)共降低,H1ΔvipB中hapA(log2FC=2.46)和hapR(log2FC=3.16)表達(dá)共增高,且H1ΔclpV中hapA(log2FC=2.27)和hapR(log2FC=3.78)表達(dá)共增高,提示hapA的轉(zhuǎn)錄變化可能由hapR變化引起。而三個(gè)敲除株中KW3_RS0115980轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)(圖2B-D),但其基因編碼蛋白目前僅預(yù)測(cè)為假想蛋白,其具體功能需要進(jìn)一步揭示。

    ClpV 是由clpV編碼的ATP 酶,可通過(guò)水解VipA/VipB 鞘蛋白復(fù)合體,達(dá)到移除已收縮過(guò)的T6SS以啟動(dòng)新的T6SS分泌過(guò)程[17-18]。但將clpV敲除后,有多達(dá)86 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著改變,這些差異基因GO 富集到蛋白質(zhì)代謝相關(guān)通路(圖3C),KEGG 通路包括硫胺代謝通路(圖4C)。維生素B1又名硫胺素,是參與碳水化合物和氨基酸代謝的酶的輔因子,幾乎所有的生命體都需要硫胺素[19]。大多數(shù)細(xì)菌可以從頭合成硫胺素,當(dāng)缺乏硫胺素合成基因缺乏時(shí)則需要通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從外界攝取硫胺素[20]。目前細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化出許多硫胺素及前體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ThiBPQ、ThiXYZ、ECFThiT和YkoEDC)、二級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NiaP)和促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PnuT)。在H1ΔclpV中thiC、thiF、thiH和thiS呈明顯轉(zhuǎn)錄增高趨勢(shì)(圖2D)。thiC在硫胺素合成中起著重要作用,其編碼蛋白ThiC 將硫胺素和嘌呤合成的分支點(diǎn)代謝物5-氨基咪唑核糖苷轉(zhuǎn)化為磷酸化的4-氨基-5-羥甲基-2-甲基嘧啶,這是合成有活性的焦磷酸硫胺素的關(guān)鍵[21]。有研究表示,在細(xì)菌、真菌和植物中硫胺素及其衍生物可以和RNA 結(jié)合以控制其基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯[22]。可見(jiàn)硫胺素在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方面有著重要作用,但至于在霍亂弧菌中是否也有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能以及clpV缺失引起硫胺素合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平升高,需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索。

    生物膜提供霍亂弧菌穩(wěn)定的生存環(huán)境,自然狀態(tài)下霍亂弧菌可以在浮游,單層生物膜中和成熟生物膜的生存狀態(tài)中切換,在不同的生存狀態(tài)下其體內(nèi)轉(zhuǎn)錄情況不同[23]。H1ΔvipA,H1ΔvipB和H1ΔclpV的KEGG 均富集到霍亂弧菌生物膜形成相關(guān)途徑(圖4A-C),其中H1ΔvipA的生物膜形成相關(guān)差異基因有hapA、hapR、KW3_RS0 107715;H1ΔvipB的生物膜形成相關(guān)差異基因有hapA、hapR、tcpS、KW3_RS0103100 和KW3_RS0 103115;H1ΔclpV的生物膜形成相關(guān)基因有hapA、KW3_RS0116000、hapR、KW3_RS0103100 和KW3_RS0103115 等?;魜y弧菌生物膜形成過(guò)程受多種途徑調(diào)控,其中包括群體感應(yīng)途徑[24]。已有研究表明霍亂弧菌C6706中hapR的表達(dá)時(shí)間與生物膜厚度,生物膜脫離率和霍亂弧菌定植率密切相關(guān)[25]。H1ΔvipA,H1ΔvipB和H1ΔclpV的KEGG 富集不僅富集到霍亂弧菌生物膜形成通路還都富集到群體感應(yīng)通路,推測(cè)H1株中群體感應(yīng)調(diào)控生物膜形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn):vipA基因是一個(gè)存在與H1 菌株中具有多重功能的基因,一是編碼T6SS鞘結(jié)構(gòu)蛋白,二是參與T6SS 調(diào)控。同時(shí),研究表明hapR可能參與H1 菌株vipA對(duì)T6SS 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。結(jié)合前期研究結(jié)果,將存在于H1 菌株中的可能調(diào)控通路繪制簡(jiǎn)圖(圖6)。本研究為將霍亂弧菌新發(fā)菌株H1 的T6SS 作為防治靶標(biāo)奠定基礎(chǔ);也為霍亂弧菌T6SS的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供新的思路。

    圖6 霍亂弧菌H1株T6SS轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.6 T6SS transcription regulation network in Vibrio cholerae H1

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