循環(huán)膽紅素水平與新診斷非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變及其危險因素相關(guān)性的病例對照研究

劉元樺，李雪妍，蘇 蕾，何佳林，耿修文，紀佳君，唐 松，趙立娜

（1.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)系//廣東省營養(yǎng)膳食與健康重點實驗室，廣東廣州 510080；2.深圳市眼科醫(yī)院//深圳市眼科學(xué)重點實驗室，廣東深圳 518000）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，也是成人失明的主要原因之一［1］。DR 發(fā)病隱匿、進展緩慢，且早期無明顯癥狀，往往導(dǎo)致診斷和干預(yù)的延誤［2-3］。盡管對公認的風險因素如糖尿病病程、血糖、血脂和血壓等進行強化控制可以減緩DR的進展，但全球DR的患病率仍不斷上升［2，4］。由于DR 發(fā)病的隱匿性和不可逆性，探索早期DR 預(yù)測和干預(yù)的臨床生物標志物具有重要的研究意義和臨床價值。膽紅素是膽汁中的主要色素，近年來的研究發(fā)現(xiàn)膽紅素在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用，被認為是人體內(nèi)的一種重要的內(nèi)源性抗氧化劑［5］，越來越多的研究報道膽紅素水平與心血管疾病及糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6］。有研究報道總膽紅素水平（total bilirubin，TBIL）能夠預(yù)測2型糖尿病患者的截肢事件發(fā)生［7］。另外，一項隊列研究提示TBIL與糖尿病腎病進展呈負相關(guān)［8］。然而，目前有關(guān)膽紅素水平與DR的關(guān)系的研究較為缺乏且結(jié)果存在較多的不一致［9-12］。目前的研究中沒有較全面地收集和調(diào)整可能影響膽紅素水平的多種混雜因素，如飲食行為、生活方式和藥物等［10，13-14］。此外，目前大多數(shù)的研究只關(guān)注TBIL，而沒有進一步區(qū)分結(jié)合形式（direct bilirubin，DBIL）和非結(jié)合形式（indirect bilirubin，IBIL）膽紅素與DR 的關(guān)系［10，15-16］，而已有相關(guān)的研究報道不同形式的膽紅素的抗氧化能力等功能特性有顯著的差別［9，17］。因此，本研究開展基于社區(qū)的2 型糖尿病視網(wǎng)膜病變的人工智能眼底鏡的篩查，納入新診斷的非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變（nonproliferative diabetic retinopathy，NPDR）的病人，并開展詳細的問卷調(diào)查和體格檢查收集相關(guān)的危險因素，全面的檢測了不同形式的膽紅素的水平，分析其與非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變及其相關(guān)危險因素的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究設(shè)計和研究對象

采用基于社區(qū)的病例對照研究設(shè)計，在2020年1 月至2020 年12 月共招募2 型糖尿病患者409例［符合以下標準之一：糖尿病史、空腹血糖≥7.0 mmol、隨機血糖≥11.1 mmol/L或糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c）≥6.5%］［18］。排除患有癲癇病史、青光眼病史、接受過玻璃體手術(shù)、白內(nèi)障、全身感染、風濕性心臟病、自身免疫性疾病、已確診DR 且接受藥物治療的研究對象。在本研究中，我們最終按年齡、性別和糖尿病病程1：3匹配納入78例NPDR 患者和234 例無DR 糖尿病患者。為了排除任何可能影響研究對象膽紅素分布比較的伴隨條件的影響，研究還納入了同期篩查的一組年齡和性別匹配的78 名非糖尿病人作為對照。本研究遵循赫爾辛基宣言的原則，經(jīng)中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準［中大公衛(wèi)醫(yī)倫〔2019〕第076號］，所有參與者均簽署了書面知情同意書。

1.2 糖尿病視網(wǎng)膜病變的評估

所有參與者均接受了標準化的眼底檢查，采用人工智能眼底相機（SYSEYE RetiCam 3100，重慶，中國）通過非藥物散瞳方式獲取研究對象每只眼睛的視網(wǎng)膜照片，并由眼科醫(yī)生根據(jù)國際DR 臨床標準將糖尿病患者兩只眼睛視網(wǎng)膜病變情況進一步確診［19］。本研究中409 例糖尿病人共篩查出78 例非增殖期DR，1 例增殖期DR，最終納入78 例非增殖期DR進入病例組（NPDR組）。

1.3 風險因素的評估

在本研究中，我們進行了詳細的面對面問卷調(diào)查，收集參與者的相關(guān)信息，包括性別、年齡、糖尿病病程、疾病史、目前的吸煙狀況和藥物的使用等。所有參與者都接受了標準化的體格檢查，以記錄身高、體質(zhì)量［通過計算來確定身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）］和血壓等。

1.4 實驗室檢測

采集每位參與者的空腹靜脈血并離心（800×g，15 min，4 ℃），分離血清、血漿、白細胞和紅細胞，并將所有分裝的樣本儲存在-80 ℃。采用生化分析儀（BS-800 生化分析儀，邁瑞，中國深圳）檢測相關(guān)生化指標。采用高效液相色譜法（HA-8180，Arkray，Shiga，Japan）檢測糖化血紅蛋白（HbA1c）。估計腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）由Lund-Malm? 修正方程計算。尿白蛋白/肌酐比值（urine albumin creatine ratio，UACR）=尿微量白蛋白（mg/L）/尿肌酐（g/L）。

1.5 統(tǒng)計方法

結(jié)果中分類變量采用數(shù)目（百分比）描述，連續(xù)變量采用均數(shù)±標準差或中位數(shù)M（P25～P75）表示。參與者的基本情況和臨床特征采用Mann-WhitneyU檢驗、χ2檢驗或t檢驗進行比較（視情況而定）。血清膽紅素水平與HbA1c 水平的關(guān)系采用Spearman 秩相關(guān)分析。血清膽紅素與非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變之間的關(guān)聯(lián)采用Logistic 回歸分析進行評估。在多因素logistic回歸分析中，納入了混雜因素和已知風險因素進行了校正。膽紅素對NPDR的預(yù)測能力采用ROC 曲線分析。所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 25.0 版軟件（IBM Corporation，Chicago，IL）進行。檢驗水準α=0.05（雙側(cè)檢驗）。本研究剔除缺失問卷數(shù)據(jù)或樣本的研究對象。

1.6 樣本量計算

樣本量計算是基于已有研究的基礎(chǔ)上進行計算［11，20］，本研究中的樣本量在總膽紅素分析中達到96.62%的功效，在結(jié)合膽紅素分析中達到98.93%功效，在非結(jié)合膽紅素分析中達到92.01%功效。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基本情況

與無DR 糖尿病患者相比，NPDR 患者的糖尿病病程更長［7.0（3.0～12.0）vs.6.0（3.0～9.0）年，P=0.016］、收縮壓［130.0（123.0～145.0）vs.127.0（116.0～137.0）mmHg，P=0.006］、HbA1c%水 平［8.4（7.1～9.5）vs.6.8（6.1～8.2），P＜0.001］、空腹血糖水平［8.2（6.6～11.6）vs.6.9（5.5～8.5）mmol/L，P＜0.001］和UACR 水平［53.3（13.9～182.8）vs.16.6（8.8～45.9）mg/g，P＜0.001］更高；與無DR 糖尿病患者相比，NPDR 患者的TBIL［10.1（8.2～13.3）vs.12.2（8.9～15.6）μmol/L，P=0.003］、DBIL［3.4（2.5～4.4）vs.3.9（3.0～5.3）μmol/L，P=0.001］和IBIL［7.2（5.9～8.4）vs.8.4（5.9～10.5）μmol/L，P=0.006］水平較低。NPDR 患者與無DR 糖尿病患者的年齡、性別、近期吸煙者、BMI、舒張壓、降糖治療情況、降脂藥物使用、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、eGFR 和C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）無差異，見表1。

表1 研究對象基本情況Table 1 Baseline characteristics of the research patients ［（± s）or M（P25～P75）or n（%）］

表1 研究對象基本情況Table 1 Baseline characteristics of the research patients ［（± s）or M（P25～P75）or n（%）］

P values were compared by Mann-Whitney U test，Student t test or χ2 test as appropriate.BMI：Body mass index；HbA1c：Glycated hemoglobin；TC：Total cholesterol；HDL-C：High-density lipoprotein cholesterol；LDL-C：Low-density lipoprotein cholesterol；TG：Triglyceride；eGFR：Estimated glomerular filtration rate；CRP：C-reactive protein；TBIL：Total bilirubin；DBIL：Direct bilirubin；IBIL：Indirect Bilirubin；UACR：Urine albumin creatine ratio；FBG：Fasting blood glucose；ALT：Alanine aminotransferase；AST：Aspartate aminotransferase.

2.2 各組血清總膽紅素、結(jié)合膽紅素和未結(jié)合膽紅素水平

NPDR 患者TBIL 水平［10.1（8.2～13.3）μmol/L］低于無DR 糖尿病患者［12.2（8.9～15.6）μmol/L，P=0.003］和非糖尿病人群［13.7（10.5～17.2）μmol/L，P＜0.001］（圖1 A）。NPDR 組DBIL 水平［3.4（2.5～4.4）μmol/L］低于無DR 糖尿病患者［3.9（3.0～5.3）μmol/L，P=0.001］和非糖尿病人群［4.0（3.2～5.6）μmol/L，P=0.001］（圖1 B）。NPDR 組IBIL 水平［7.2（5.9～8.4）μmol/L］低于無DR 糖尿病患者［8.4（5.9～10.5）μmol/L，P=0.006］和非糖尿病患者［9.8（7.1～12.3）μmol/L，P＜0.001］（圖1 C）。

圖1 各組血清TBIL、DBIL和IBIL水平情況Fig.1 Serum TBIL，DBIL and IBIL levels in each group

HbA1c 水平與膽紅素水平的Spearman 秩相關(guān)分析結(jié)果顯示TBIL 水平（rs=0.001，P=0.980）、DBIL 水平（rs=-0.007，P=0.907）、IBIL 水平（rs=-0.001，P=0.989）均為與HbA1c 水平無關(guān)（圖2 A-C）。

圖2 血清TBIL、DBIL和TBIL水平與HbA1c的關(guān)系Fig.2 Correlation between the serum TBIL，DBIL and IBIL levels and HbA1c

2.3 血清膽紅素和糖尿病視網(wǎng)膜病變的風險關(guān)系

TBIL 四分位數(shù)中NPDR 患病率分布從26.9%（第一四分位數(shù)）至12.8%（第四四分位數(shù)），Ptrend=0.018；在DBIL 四分位數(shù)中NPDR 患病率分布從38.0%（第一四分位數(shù)）到15.6%（第四四分位數(shù)），Ptrend=0.013；在IBIL 四分位數(shù)中NPDR 患病率分布從25.6%（第一四分位數(shù)）到15.6%（第四四分位數(shù)），Ptrend=0.010，見圖3。

圖3 各膽紅素四分位數(shù)水平NPDR的患病率Fig.3 The prevalence of NPDR at each bilirubin quartile level

以性別、糖尿病病程、HbA1c 和收縮壓為校正因子，納入多因素logistic 回歸分析，以血清膽紅素最高四分位數(shù)作為參照組。在單變量分析中，TBIL第一四分位數(shù)（26.9%）、第二四分位數(shù)（33.3%）和第三四分位數(shù)（26.9%）的NPDR 患病率均高于最高四分位數(shù)（12.8%），比值比（odds ratio，OR）95%CI分別為2.51（1.09，5.75），P=0.030；3.40（1.51，7.67），P=0.003；和2.51（1.09，5.75），P=0.030。DBIL第一四分位數(shù)（38.0%）NPDR患病率高于最高四分位數(shù)（15.6%），OR95%CI 為3.32（1.54，7.13），P=0.002。IBIL 第二四分位數(shù)（38.0%）的NPDR 患病率高于最高四分位數(shù)（15.6%），OR95%CI 為3.32（1.54，7.13），P=0.002。校正相關(guān)因素后，多因素分析顯示TBIL 第一四分位數(shù)、第二四分位數(shù)和第三四分位數(shù)發(fā)生NPDR 的風險均高于最高四分位數(shù)，OR 95%CI 分別為2.89（1.20，6.99），P=0.018；3.60（1.52，8.55），P=0.004；2.88（1.20，6.92），P=0.018；DBIL 第一四分位數(shù)發(fā)生NPDR 的風險高于最高四分位數(shù)，OR 95%CI 為3.36（1.49，7.55），P=0，003；IBIL 第二四分位數(shù)發(fā)生NPDR 的風險高于最高四分位數(shù)，OR 95%CI 為3.56（1.57，8.09），P=0.002，見表2。

表2 膽紅素與NPDR關(guān)系的多因素logistic回歸分析Table 2 Multivariate logistic regression analysis for the association of bilirubin and NPDR

2.4 不同尿白蛋白/肌酐比值和糖化血紅蛋白水平中膽紅素與糖尿病視網(wǎng)膜病變風險

膽紅素水平第一四分位數(shù)（Q1）和第二四分位數(shù)（Q2）為低膽紅素水平，第三四分位數(shù)（Q3）和第四四分位數(shù)（Q4）為高膽紅素水平。當HbA1c%≤7時，低IBIL 水平（Q1-Q2）NPDR 風險高于高IBIL 水平（Q3-Q4），OR95%CI 為3.44（1.04，11.38），P=0.043。當HbA1c% ＞7 時，低DBIL 水平（Q1-Q2）NPDR 風險高于高DBIL 水平（Q3-Q4），OR95%CI為2.05（1.09，3.86），P=0.026。當UACR ≤30 mg/g 時，低IBIL 水平（Q1-Q2）的NPDR 風險高于高IBIL 水 平（Q3-Q4），OR95%CI 為2.53（1.10，5.82），P=0.029。當UACR ＞30 mg/g 時，低DBIL水平（Q1-Q2）的NPDR 風險高于高DBIL 水平（Q3-Q4），OR95%CI=2.40（1.14，5.02），P=0.021。在其他亞組中，低膽紅素水平和高膽紅素水平之間NPDR風險無差異，見表3。

表3 不同HbA1c和UACR水平亞組中NPDR的風險Table 3 The risk of NPDR in subgroup according to HbA1c levels and UACR levels

我們進一步采用ROC 曲線分析DBIL、IBIL、HbA1c 和UACR 水平對NPDR 的預(yù)測能力。結(jié)果顯示：DBIL、IBIL、HbA1c 和UACR 對NPDR 的發(fā)生具有預(yù)測能力，AUC 分別為0.63（0.56，0.70），P=0.001；0.61（0.54，0.68），P=0.005；0.66（0.59，0.74），P＜0.001；0.71（0.64，0.77），P＜0.001。DBIL、HbA1c 和UACR 結(jié)合的AUC 為0.77（0.71，0.83），P＜0.001。IBIL、HbA1c 和UACR 結(jié)合的AUC為0.77（0.71，0.83），P＜0.001，見圖4。

圖4 DBIL、IBIL、HbA1c和UACR預(yù)測NPDR的ROC曲線分析Fig.4 ROC curve of DBIL，IBIL，HbA1c and UACR to predict NPDR

3 討論

在這項病例對照研究中，我們發(fā)現(xiàn)血清膽紅素（TBIL、DBIL 和IBIL）與NPDR 風險呈負相關(guān)關(guān)系，為NPDR 的獨立風險因素。此外，根據(jù)血糖水平和腎功能水平進行亞組分析，我們發(fā)現(xiàn)在血糖控制良好（HbA1c%≤7）或無微量白蛋白尿（UACR ≤30 mg/g）的糖尿病患者中，低IBIL 水平具有較高的NPDR風險；在血糖控制不良（HbA1c%＞7）或有微量白蛋白尿（UACR ＞30 mg/g）的糖尿病患者中，低DBIL 水平具有較高的NPDR 風險。將DBIL 或IBIL 與HbA1c 和UACR 結(jié)合可進一步提高對NPDR 的預(yù)測能力。

與目前的研究結(jié)果一致，本研究中我們也觀察到與未合并視網(wǎng)膜病變的2 型糖尿病患者相比，NPDR 患者的糖尿病病程更長，收縮壓更高，血糖控制更差［2-3］。目前，血脂水平與DR 的關(guān)系仍存在爭議，在荷蘭開展的Hoorn研究提示TC和TG與DR發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)，但Sacks 等人發(fā)現(xiàn)DR 與這些脂質(zhì)的相關(guān)性不太強［21-22］。本研究中糖尿病患者服用的降脂藥物和血脂情況相似，這表明研究參與者的血脂控制相對較好，血脂水平與本研究對象中的NPDR的相關(guān)性不強。

膽紅素是體內(nèi)紅細胞被破壞后代謝的產(chǎn)物，長期以來一直被認為是身體的代謝廢物。近年來，膽紅素的抗氧化特性在糖尿病血管病變中得到了越來越多的關(guān)注［23-25］。與之前兩項不同人群的橫斷面研究的發(fā)現(xiàn)一致，本研究中也發(fā)現(xiàn)NPDR 患者的總膽紅素水平低于無DR 糖尿病患者［20，26］。我們進一步發(fā)現(xiàn)，與無DR 糖尿病患者相比，NPDR 患者中所有形式的膽紅素都較低，這可能進一步表明膽紅素可能在糖尿病相關(guān)血管并發(fā)癥發(fā)展中發(fā)揮作用。

目前有關(guān)膽紅素水平與HbA1c 的關(guān)聯(lián)的研究報道較少。Oda 發(fā)現(xiàn)膽紅素水平與HbA1c 呈負相關(guān)，并且獨立于空腹血糖水平［27］。然而，在我們的研究中沒有觀察到糖尿病患者的循環(huán)膽紅素水平和HbA1c水平之間存在關(guān)聯(lián)，提示膽紅素水平可能是獨立于糖化血紅蛋白水平的危險因素。另外，我們進一步開展多因素的分析，在調(diào)整相關(guān)因素后［2］，所有形式的膽紅素水平均與NPDR風險呈負相關(guān)，其中TBIL 結(jié)果與先前發(fā)表的不同橫斷面研究結(jié)果一致［10，20，26］。而在本研究中，我們進一步發(fā)現(xiàn)了低DBIL 和IBIL 水平均增加了NPDR 風險，更深入地探索了循環(huán)膽紅素與DR 的關(guān)系。目前，關(guān)于膽紅素和糖尿病視網(wǎng)膜病變的隊列研究比較缺乏，現(xiàn)有一項隊列研究僅納入了男性糖尿病患者，研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)膽紅素水平與DR風險之間可能存在U形關(guān)聯(lián)［12］。因此循環(huán)膽紅素水平的性別差異以及膽紅素水平與DR的關(guān)系仍待進一步的前瞻性隊列研究確認。

HbA1c 水平是糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素，大多數(shù)2 型糖尿病患者的HbA1c 理想水平應(yīng)＜7%，可以防止糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生［28］。然而，許多血糖控制良好的糖尿病患者仍發(fā)生了DR。本研究中我們進一步根據(jù)血糖水平開展了亞組分析，在血糖控制良好的（HbA1c%≤7）糖尿病患者中，IBIL 水平低的情況下發(fā)生NPDR 的風險較高，提示即使血糖控制良好，低IBIL 也可能增加NPDR 的風險，若血糖控制不良（HbA1c% ＞7），低DBIL 水平可能增加NPDR 的發(fā)生風險。此外，糖尿病腎臟并發(fā)癥也是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，通常與DR相伴隨發(fā)生發(fā)展［29］。根據(jù)腎臟功能開展進一步的亞組分析，研究結(jié)果表明，在沒有腎損害的糖尿病患者中（UACR ≤30mg/g），低水平的IBIL 也會增加NPDR 的風險。此外，低水平的DBIL 會增加伴有腎損害的糖尿病患者（UACR ＞30 mg/g）發(fā)生NPDR 的風險。這些結(jié)果進一步表明，在不同狀態(tài)下糖尿病患者中，不同形式的膽紅素對NPDR 風險有不同的影響。這可能是由于不同形式的膽紅素的抗氧化能力不同，如未結(jié)合形式的膽紅素可通過激活糖尿病小鼠模型主動脈中的Akt/Enos 通路直接改善內(nèi)皮功能障礙［9］，不同形式膽紅素對NPDR發(fā)生的機制值得進一步研究。

綜上，目前的研究存在以下優(yōu)點和局限性。優(yōu)點是在這項基于社區(qū)開展的病例對照研究中篩選和納入了新診斷的NPDR 病例，與增殖期DR 相比，NPDR 處于糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期階段，更有利于篩查DR 發(fā)生發(fā)展中的早期生物標志物。同時，病例組和對照組之間的年齡、性別和糖尿病病程等混雜因素通過匹配均衡，增加了病例組和對照組的可比性。同時，本研究還分別探討和分析了不同形式的循環(huán)膽紅素的分布及其與NPDR 的關(guān)系，并根據(jù)不同的血糖控制狀態(tài)和腎功能對糖尿病患者進行進一步亞組分析糖尿病患者NPDR 的風險。本研究的局限性在于為單一中心病例對照研究，結(jié)果的外推及不同形式膽紅素在NPDR 中的因果作用有待進一步證實，膽紅素與NPDR 進展的潛在機制值得進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)膽紅素濃度與NPDR 風險呈負相關(guān)關(guān)系，為NPDR 發(fā)生發(fā)展的獨立因素。循環(huán)膽紅素可能是預(yù)測、評估和治療DR的有價值的早期臨床生物標志物。