多器官細(xì)胞共同培養(yǎng)方法檢測參麥及喘可治注射液的細(xì)胞毒性

于海明，閻政禮，付 虎，于風(fēng)江，朱勇飛

（1.湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院（湖南省人民醫(yī)院）重癥醫(yī)學(xué)科，長沙410006；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，長沙410013；3.湖南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，長沙410086）

多器官細(xì)胞共同培養(yǎng)方法檢測參麥及喘可治注射液的細(xì)胞毒性

于海明1，閻政禮2，付 虎2，于風(fēng)江3，朱勇飛2

（1.湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院（湖南省人民醫(yī)院）重癥醫(yī)學(xué)科，長沙410006；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，長沙410013；3.湖南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，長沙410086）

目的：觀察參麥、喘可治注射液對人類體外不同器官細(xì)胞增殖的影響，以期發(fā)現(xiàn)其潛在的毒性和靶器官。方法：應(yīng)用人類多器官細(xì)胞共培養(yǎng)模型，觀察參麥、喘可治注射液分別作用24、48、72 h后，對WI-38、HepG2、HEK293、SH-SY5Y和HCF細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：參麥和喘可治注射液分別處理24、48、72 h后，兩種藥物的高劑量均抑制所有細(xì)胞的增殖；在兩種藥物處理后的各時點(diǎn)各種細(xì)胞的相對增殖率均隨劑量的降低而升高、并有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。處理48、72 h后，次低～高劑量的參麥注射液均抑制WI-38細(xì)胞增殖，中劑量2組～高劑量組中的該藥則對HEK293細(xì)胞的增殖均有抑制作用，中劑量1組～高劑量組中的該藥可抑制HepG2和SHSY5Y這兩種細(xì)胞的增殖。喘可治注射液處理72 h后，次低～高劑量均抑制WI-38細(xì)胞增殖。結(jié)論：多器官細(xì)胞共培養(yǎng)模型發(fā)現(xiàn)兩種藥物對人胚肺均可能具有潛在的毒性，參麥注射液可能還對人胚腎有潛在的毒性；較大劑量的參麥注射液可能具有肝臟和神經(jīng)毒性。

多器官細(xì)胞共培養(yǎng)方法；參麥注射液；喘可治注射液；細(xì)胞毒性

近年來有關(guān)中成藥（尤其是中藥注射劑）引起毒性反應(yīng)時有發(fā)生，社會各界對中成藥毒性的關(guān)注也日益增多［1］，國家食品藥品安全監(jiān)督管理局也于前些年下發(fā)了《關(guān)于開展中藥注射劑安全性再評價工作的通知》（國食藥監(jiān)辦［2009］28號）。然而，對中成藥再評價的報道基本是臨床研究資料，目前關(guān)于其藥理、毒理、藥代動力學(xué)的資料較少［2］。多器官細(xì)胞共同培養(yǎng)方法（integrated discrete multiple organ cell culture，IdMOC）能較好地模擬體內(nèi)代謝，系統(tǒng)、快速地進(jìn)行化學(xué)物的體外藥理、毒理學(xué)檢測［3］，以人源細(xì)胞建立的共培養(yǎng)系已用于藥物毒性靶器官的篩選［4］。參麥注射液是臨床不良反應(yīng)報道較多的一個中成藥［5］，而喘可治注射液幾乎沒有不良反應(yīng)報道；因此，本研究擬利用該方法對這2種藥物的細(xì)胞毒理學(xué)進(jìn)行篩選，以期為臨床不良反應(yīng)的研究提供毒理學(xué)佐證，并探索其潛在的毒性和靶器官。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司），倒置顯微鏡（Lecia公司），多功能酶標(biāo)儀（BioTek公司），48孔培養(yǎng)板（Corning公司）；參麥注射液（生藥含量為：紅參50 mg/mL，麥冬50 mg/mL；河北某藥業(yè)有限公司），喘可治注射液（含巴戟天提取液50μg/mL，淫羊藿提取液100μg/mL；廣東某藥業(yè)有限公司）；噻唑蘭（MTT）購自Sigma公司，胰蛋白酶，DMEM（高糖）培養(yǎng)基購

圖1 多器官細(xì)胞共培養(yǎng)板側(cè)邊示意圖

自Hyclone公司；胎牛血清（FBS）為Gibco公司產(chǎn)品。共培養(yǎng)板為自己改制的48孔培養(yǎng)板，每6孔為一組，在6個孔與孔之間孔壁底部打一洞，當(dāng)孔內(nèi)培養(yǎng)基超過0.3 cm高度時使6個孔之間培養(yǎng)基能相互連通（見圖1）。

1.2 培養(yǎng)液配制 細(xì)胞單培養(yǎng)和共培養(yǎng)時，均采用同一種培養(yǎng)液，即在DMEM高糖培養(yǎng)基，加入10%的FBS和1%青霉素鏈霉素。

1.3 細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立及分組 參照文獻(xiàn)［6］，先將WI-38細(xì)胞（人正常胎兒肺細(xì)胞）、HepG2細(xì)胞（人肝癌細(xì)胞）、HEK293細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞）、SH-SY5Y細(xì)胞（人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞）、HCF細(xì)胞（人心臟成纖維細(xì)胞）復(fù)蘇并分別培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖到足夠數(shù)量時將其共同接種于各孔連通的共培養(yǎng)板，待細(xì)胞全部貼壁后加入藥物。參麥注射液（主要成分為紅參、麥冬）、喘可治注射液（主要成分為巴戟天、淫羊藿）臨用前分別用培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，參麥注射液各劑量組生藥的濃度分別為：0（陰性對照組），高劑量組：25.0 mg/mL（紅參）+25.0 mg/mL（麥冬），次高劑量組：12.50 mg/mL（紅參）+12.50 mg/mL（麥冬），中劑量1組：6.25 mg/mL（紅參）+6.25 mg/mL（麥冬），中劑量2組：3.13 mg/mL（紅參）+3.13 mg/mL（麥冬），次低劑量組：1.57 mg/mL（紅參）+1.57 mg/mL（麥冬），低劑量組：0.78 mg/mL（紅參）+0.78 mg/mL（麥冬）；喘可治注射液各劑量組巴戟天和淫羊藿提取液的濃度分別為0（陰性對照組），高劑量組：25.0μg/mL（巴戟天）+50.0μg/mL（淫羊藿），次高劑量組：12.50μg/mL（巴戟天）+25.0μg/mL（淫羊藿），中劑量1組：6.25μg/mL（巴戟天）+12.50μg/mL（淫羊藿），中劑量2組：3.13μg/mL（巴戟天）+6.25μg/mL（淫羊藿），次低劑量組：1.57μg/mL（巴戟天）+3.13μg/mL（淫羊藿），低劑量組：0.78μg/mL（巴戟天）+1.57μg/mL（淫羊藿）；所有受試物每個劑量組設(shè)3個平行實(shí)驗孔。將所有受試物加入共培養(yǎng)板以后，立即置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72 h后檢測細(xì)胞相對增殖率。

1.4 MTT法檢測相對增殖率 參照文獻(xiàn)［7］提供的方法，配制MTT溶液，并在加入受試物24 h后，每孔加入MTT溶液（5 g·L-1）20ul，于37 ℃孵育4 h，棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加二甲亞砜（DMSO）150 μL，震蕩，用酶標(biāo)儀于490 nm波長測定各孔吸光度（OD）。細(xì)胞相對增殖率（relative growth rate，RGR）的計算公式：RGR（%）=（試驗組平均OD值）/（對照組平均OD值）×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；同種物質(zhì)作用下，同種細(xì)胞的所有劑量比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；比較兩個劑量的RGR時，采用獨(dú)立樣本t檢驗；差異性顯著率以0.05為標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 參麥注射液處理24 h后對各種細(xì)胞的影響表1顯示，參麥注射液處理24 h后，各種細(xì)胞的增殖率隨著劑量的降低而升高，有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）；除中劑量1組的參麥注射液不影響SHSY5Y細(xì)胞增殖、中劑量2組的該藥使SH-SY5Y細(xì)胞增殖率升高外，中劑量2組～高劑量組各種細(xì)胞的增殖均受到抑制；次低劑量組中WI-38、HEK293、SH-SY5Y細(xì)胞增殖率升高，HepG2細(xì)胞的增值率降低；低劑量組中的各種細(xì)胞增殖率高于對照組。

表1 參麥注射液處理24小時后各種細(xì)胞的相對增殖率（%）

2.2 參麥注射液處理48 h后對各種細(xì)胞的影響表2顯示，參麥注射液處理后48 h，各種細(xì)胞的增殖率隨著劑量的降低而升高，有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）；除中劑量2組的參麥注射液不影響SHSY5Y細(xì)胞外，中劑量2組～高劑量組的該藥使各種細(xì)胞的增殖均受到抑制；次低劑量組的該藥使WI-38、HepG2細(xì)胞受到抑制，對HEK293、SH-SY5Y細(xì)胞無影響，使HCF細(xì)胞增殖率升高；低劑量組的參麥注射液對WI-38依然具有抑制作用，對HepG2、HEK293細(xì)胞無影響，但使SH-SY5Y、HCF細(xì)胞的增殖率升高。

由表3可知，參麥注射液處理后72 h，各種細(xì)胞的增殖率隨著劑量的降低而升高，有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）；中劑量2組～高劑量組的參麥注射液除了使HepG2細(xì)胞增殖率升高外，抑制了其余各種細(xì)胞的增殖均；次低劑量組中SH-SY5Y細(xì)胞不受影響，WI-38、HEK293、HCF細(xì)胞增殖受到抑制，HepG2細(xì)胞增殖率卻升高；低劑量組的的參麥注射液對WI-38、HEK293、HCF細(xì)胞無影響，使HepG2、SH-SY5Y細(xì)胞增殖率升高。

表4提示，喘可治注射液處理24 h后，各種細(xì)胞的增殖率隨著劑量的降低而升高，有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）。所有濃度的喘可治對HEK293細(xì)胞均無影響；高劑量組的該藥抑制WI-38細(xì)胞增殖，低劑量組則升高該細(xì)胞的增殖率，其余濃度對WI-38細(xì)胞無影響；次低劑量組～高劑量組的喘可治注射液抑制HepG2、SH-SY5Y和HCF細(xì)胞增殖，低劑量組的該藥則升高SH-SY5Y和HCF細(xì)胞增殖率、但對HepG2細(xì)胞無影響。

2.3 參麥注射液處理72 h后對各種細(xì)胞的影響

2.4 喘可治注射液處理24 h后對各種細(xì)胞的影響

2.5 喘可治注射液處理48 h后對各種細(xì)胞的影響

表2 參麥注射液處理48小時后各種細(xì)胞的相對增殖率（%）

表3 參麥注射液處理72小時后各種細(xì)胞的相對增殖率（%）

表4 喘可治注射液處理24小時后各種細(xì)胞的相對增殖率（%）

表5 喘可治注射液處理48小時后各種細(xì)胞的相對增殖率（%）

表6 喘可治注射液處理72小時后各種細(xì)胞的相對增殖率（%）

喘可治處理各種細(xì)胞72 h后，各種細(xì)胞的增殖率隨著劑量的降低而升高，有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）；次低劑量組～高劑量組中的WI-38細(xì)胞均被抑制，而低劑量組的該藥對其無影響；高劑量組中的HepG2、HEK293、SH-SY5Y和HCF細(xì)胞受到抑制；次高劑量組中的該藥使SH-SY5Y和HCF細(xì)胞抑制，但對HepG2、HEK293細(xì)胞無影響；除低劑量組的喘可治注射液可使SH-SY5Y細(xì)胞增殖率升高外，低劑量組～中劑量1組的該藥對HepG2、HEK293、SH-SY5Y和HCF細(xì)胞均無影響。

3 討論

張?zhí)鞂毥淌诘劝l(fā)展了大鼠肝、腎、神經(jīng)、心、肺等多器官原代細(xì)胞共同培養(yǎng)的方法，表明可作為靶器官毒性的篩選方法［8］。我們將該方法用于幾種上市多年的化學(xué)藥物（紅霉素、鏈霉素、多柔比星和白消安）的毒性研究，可較好地反映靶器官并發(fā)現(xiàn)了這些藥物的某些潛在毒性［6］。王磊利用人源細(xì)胞系共培養(yǎng)模型對鹽酸阿霉素、硫酸鏈霉素、羥基多巴胺和白消安等藥物的毒性靶器官篩選進(jìn)行了可行性研究，發(fā)現(xiàn)了上述藥物的潛在毒性靶器官［4］?；谝郧暗难芯?，我們將人類WI-38、HepG2、HEK293、SH-SY5Y和HCF細(xì)胞共同培養(yǎng)，用于檢測參麥注射液和喘可治注射液潛在的毒性和靶器官。

參麥注射液的臨床不良反應(yīng)主要有：全身心損害，皮膚及其附件損害，心率及心律紊亂，消化、呼吸、神經(jīng)系統(tǒng)損害等［9］，提示該藥可能具有皮膚、心臟、消化器官、呼吸器官、神經(jīng)毒性等。本研究發(fā)現(xiàn)，參麥注射液處理24、48、72 h后，除SH-SY5Y 細(xì)胞72 h后未受影響外，中劑量1組～高劑量組中的該藥對WI-38、HepG2、HEK293、SH-SY5Y、HCF細(xì)胞的增殖率均有抑制作用，且在該藥處理后的各時點(diǎn)各種細(xì)胞的增殖率均隨劑量的降低而升高、并有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)該藥可通過抑制纖維化等途徑而保護(hù)心肌細(xì)胞［11］、抑制體外培養(yǎng)神經(jīng)元的凋亡［12］和人氣管平滑肌細(xì)胞的增殖［13］等。綜上所述，我們推測較大劑量的該藥由于過度抑制纖維化、使細(xì)胞基本的纖維形成減少而導(dǎo)致各種細(xì)胞的死亡，肺、肝、腎、神經(jīng)、心臟可能是參麥注射液潛在的毒性靶器官。

處理后48 h，參麥注射液的各劑量對WI-38細(xì)胞的增殖都有抑制作用；處理后72 h，該藥對低劑量組中的細(xì)胞增殖率的統(tǒng)計學(xué)無影響（但絕對數(shù)值下降），而次低劑量組～高劑量組中WI-38細(xì)胞的增殖均被抑制，由此我們推測較長時間（無論劑量大?。┦褂脜Ⅺ溩⑸湟嚎赡軗p傷發(fā)育中的肺組織。次低和低劑量的參麥注射液處理48 h后、低劑量處理72 h后對HEK293細(xì)胞的增殖率的統(tǒng)計學(xué)無影響（但絕對數(shù)值下降），其余劑量在處理48、72 h后對該細(xì)胞的增殖均有抑制作用，提示劑量稍大、較長時間用藥對發(fā)育中的腎臟可能會有損傷。

我們尚未發(fā)現(xiàn)喘可治注射液不良反應(yīng)的報道。有報道認(rèn)為喘可治對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO的分泌和IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ、TNF-α 5種細(xì)胞因子的生成具有雙向調(diào)節(jié)作用［13］，還有研究發(fā)現(xiàn)該藥可抑制猴免疫缺陷病毒（SIV）感染的淋巴組織纖維化［14］，由此提示我們大劑量的該藥可能具有細(xì)胞毒性。我們發(fā)現(xiàn)，喘可治注射液處理24、48、72 h后，高劑量可抑制所有細(xì)胞的增殖；且在該藥處理后的各時點(diǎn)各種細(xì)胞的增殖率均隨劑量的降低而升高、并有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，由此我們認(rèn)為此藥可能有一定的細(xì)胞毒性，但相對較弱。

該藥處理WI-38細(xì)胞24、48 h后，僅高濃度對細(xì)胞有抑制作用；而處理72 h后，除低劑量外的所有劑量均抑制細(xì)胞增殖，提示較長時間使用喘可治注射液可能導(dǎo)致發(fā)育中的肺組織損傷。喘可治注射液作用24 h后，

次低～高劑量的該藥抑制HepG2、SH-SY5Y、HCF細(xì)胞增殖，但48、72 h后僅有高劑量或次高～高劑量抑制細(xì)胞增殖，說明通過細(xì)胞代謝可清除其毒作用，提示該藥毒性較弱。

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Investigating cytotoxicity induced by Shenmai injection and Chuankezhi injection with the human IdMOC model

Yu Hai-ming, Yan Zheng-li, Fu Hu, Yu Feng-jiang, Zhu Yong-fei
(1. Department of Critical Care Medicine, the First Affiliated Hospital(The People’s Hospital of Hunan province), Changsha 410005, China; 2. School of Medicine, Hunan Normal University, Changsha 410013, China; 3. School of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Normal University, Changsha 410013, China)

Objective Add different dose Shenmai injection or Chuankezhi injection to human’s different organs cells cultured in vitro separately and observing the proliferation of these cells, in order to discover the potential toxicity and target organs of the two drugs. Methods After the human IdMOC(integrated discrete multiple organ cell culture)model was administrated with Shenmai injection and Chuankezhi injection for 24 hours, 48 hours and 72 hours, the growth of WI-38, HepG2, HEK293, SH-SY5Y and HCF cells was detected. Results After Shenmai injection and Chuankezhi injection were treated the cells for 24, 48, 72 hours respectively, the two drugs with their high dose inhibited the proliferation of all kinds of cells. And at different times, the relative growth rates of all kinds of cells were increased with the two drugs’ concentration reducing, and there is a good dose-response relationship. After administrated by Shenmai injection for 48 and 72 hours respectively, the proliferation of WI-38 cells was inhibited among the sub-low ～ high dose of this drug, and that of HEK293 cells was inhibited among middle dose 1～high dose. After treated by Chuankezhi injection for 72 hours, the proliferation of WI-38 cells was inhibited among the sub-low ～ high dose of the drug. Conclusion The potential lung toxicity of the two drugs was detected by the IdMOC model, and Shenmai injection maybe cause the toxicity to kidney; The Chuankezhi injection maybe induced liver and nerve toxicity.

IdMOC(integrated discrete multiple organ cell culture)model; Shenmai injection; Chuankezhi injection; cytotoxicity

R114

A

1673-016X（2017）01-0011-05

2016-12-28

湖南省科技計劃項目課題（2015SK2036）

朱勇飛，E-mail：njzhu70@163.com