紅花注射液通過抗炎癥反應(yīng)治療急性腦梗死的機制研究*

秦秀德劉 玉李傳朋李新悅王 鈺虢周科△張國偉△

（1.廣州中醫(yī)藥大學附屬深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518000；2.河北大學，河北 保定 071000）

·研究報告·

紅花注射液通過抗炎癥反應(yīng)治療急性腦梗死的機制研究*

秦秀德1劉 玉1李傳朋1李新悅2王 鈺2虢周科1△張國偉2△

（1.廣州中醫(yī)藥大學附屬深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518000；2.河北大學，河北 保定 071000）

目的觀察紅花注射液對于腦卒中大鼠模型血清中超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）炎性生物標志物表達的影響。方法用改良線栓法制作大鼠中動脈阻斷（MCAO）模型，評定紅花注射液對MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損、腦梗死面積等的影響，并采用ELISA法來檢測hs-CRP在腦卒中大鼠模型中表達的水平。結(jié)果紅花注射液能改善MCAO大鼠的的神經(jīng)功能損傷情況；紅花注射液12 h組的腦梗死面積與模型12 h組相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），紅花注射液24 h組的腦梗死面積與模型24 h組相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。紅花注射液12 h組的hs-CRP與模型12 h組相比具有均有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。結(jié)論紅花注射液能減小急性腦梗死MCAO大鼠的腦梗死面積，減輕炎癥反應(yīng)，對于腦卒中大鼠模型血清中超敏C反應(yīng)蛋白這種炎性生物標志物表達有抑制作用。

急性腦梗死 超敏C反應(yīng)蛋白 紅花注射液

腦梗死是臨床常見的重大疾病，如何更有效的防治腦梗死是國家戰(zhàn)略層面重點研究的內(nèi)容之一。腦血管病急性期炎癥反應(yīng)的嚴重程度與患者的預后關(guān)系密切。急性腦缺血后炎癥反應(yīng)存在有利的一面，也有有害的一面［1］。隨著免疫學、分子生物學等醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的發(fā)展，更多學者把眼光投向如何運用炎性生物標志物對腦卒中及其相關(guān)性疾病進行檢測等方面的研究。本研究擬通過動物實驗，探討臨床常用中成藥紅花注射液對腦梗死炎性標志物C反應(yīng)蛋白（CRP）的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，SPF級，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。許可證編號：SCXK-（軍）2012-0004，飼料批號：SCXK（京）2015-0007。

1.2 試藥與儀器 紅花注射液（雅安三九藥業(yè)有限公司）；依達拉奉注射液（國藥集團國瑞藥業(yè)有限公司）。大鼠超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑 （TTC）（北京索萊寶科技有限公司）；PBS磷酸鹽 （北京博奧拓科技有限公司）；水合氯醛 （天津市科密歐化學試劑公司）；多聚甲醛（天津市科密歐化學試劑公司）。電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；雙光束紫外可見分光光度計 （TU-1901）（北京普析通用儀器有限責任公司）；恒溫水浴鍋（DR-HW-2）（北京醫(yī)療設(shè)備總廠）；臺式高速離心機（TG16W）（長沙易達儀器有限公司）；全自動酶標儀（ELx800）（美國BIO-TEK寶特）。

1.3 造模與分組 在24~26℃室溫的實驗室中飼養(yǎng)3 d，大鼠于晨8時給予食物20 g，自由飲水。手術(shù)大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水，稱體質(zhì)量，采用改良線栓法制備腦缺血大鼠模型。先用質(zhì)量分數(shù)為1%的戊巴比妥鈉0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉，將大鼠四肢和牙齒用棉線繩固定好，消毒，正中切口，鈍性分離頸部肌肉，分離頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內(nèi)動脈（ICA），結(jié)扎ECA遠心端、CCA近心端。動脈夾夾閉ICA，由CCA插入MCAO栓線，向頸內(nèi)動脈（ICA）推進，至大腦中動脈（MCA），導致局灶性腦缺血［2］。10-0絲線縫合頸部切口。假手術(shù)組動物不插入MCAO栓線，術(shù)中嚴格控制室溫在20~25℃。術(shù)前大鼠體質(zhì)量控制在250~ 280 g范圍內(nèi)，可增加成功率。動物分組，SD雄性大鼠48只，隨機分成8組，每組6只。分組如下：模型組12 h組（C-12組），模型組24 h組（C-24組），假手術(shù)12 h組（SC-12組），假手術(shù)24 h組（SC-24組），紅花注射液12 h組（HH-12組），紅花注射液24 h組（HH-24組），依達拉奉12 h組（YD-12組），依達拉奉24 h組（YD-24組）。分組后大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開始正式實驗。給藥劑量：1）依達拉奉注射液人體用藥劑量為0.9 mg/kg，換算后大鼠的用藥劑量為5.67 mg/kg，將依達拉奉加入0.9%氯化鈉溶液2 mL溶解。12 h組和24 h組均為造模成功3 h后，進行尾緣靜脈注射1次。2）紅花注射液：紅花注射液人體用藥劑量為0.29 mL/kg，換算后大鼠的用藥劑量為1.83 mL/kg。12 h組和24 h組均為造模成功后6 h后紅花注射液尾緣靜脈注射1次。

1.4 標本采集與檢測 手術(shù)24 h后稱取大鼠體質(zhì)量，將大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血5 mL，3000 r/min離心10 min取上清液，并用ELISA試劑盒檢測CRP。大鼠斷頭取腦，稱取大腦濕質(zhì)量后，放入-20℃冰箱中冰凍30 min后取出，沿大腦冠狀方向均勻切成6片，在1%TTC中水浴并避光15 min染色。而后將腦切片分別放入多聚甲醛及組織保存液中以待病理檢測。主要指標：模型制作前后大鼠體質(zhì)量變化；大腦指數(shù)；血清中超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）及白細胞介素1β（IL-1β）的水平；神經(jīng)功能損傷評分：1）大腦指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器濕質(zhì)量（mg）/大鼠質(zhì)量（g）×100%；2）大鼠神經(jīng)功能損傷評分。神經(jīng)功能損傷程度評分標準采用改良的Zea Longa標準分為6個等級。具體評分標準：0分，無缺陷；1分，不能伸展對側(cè)前肢；2分，對側(cè)前肢彎曲；3分，輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分，嚴重向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；5分，對側(cè)癱瘓。3）hs-CRP檢測按照ELISA試劑盒步驟操作。

1.5 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（s）表示，統(tǒng)計學分析采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較 見表1。假手術(shù)12 h與模型組12 h相比具有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.05），假手術(shù)24h與模型24h相比具有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。其他組均無顯著性差異。

2.2 各組大鼠腦梗死面積比 見表1。腦梗死面積比分析：假手術(shù)12 h組與模型12 h組相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），假手術(shù)24 h與模型24 h組相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），紅花注射液12 h組與模型12h組相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），紅花注射液24 h組與模型24 h組相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。紅花注射液12 h組與依達拉奉12 h組相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），紅花注射液24 h組與依達拉奉24 h組相比無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 各組大鼠hs-CRP水平比較 見表1。假手術(shù)12 h組與模型12 h組有顯著性差異（P＜0.05），模型12 h組大鼠血清中CRP含量明顯高于假手術(shù)12 h組；假手術(shù)24 h組與模型24 h組無顯著性差異（P＞0.05），但是模型24 h組血清中CRP含量均值大于假手術(shù)24 h組，模型組血清中CRP炎性因子表達程度高；紅花注射液12 h組CRP含量明顯低于模型12 h組CRP含量（P＞0.05）；紅花注射液24 h組與模型24 h組CRP含量雖然沒有顯著性差異，但紅花注射液24 h組CRP含量均值比模型組24 h低，證實了紅花注射液對24 h的大鼠模型血清中CRP起到一定抑制作用；紅花注射液12 h組、依達拉奉注射液12 h組和紅花注射液24 h組、依達拉奉注射液24 h組均無顯著性差異。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積比及CRP水平比較（s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積比及CRP水平比較（s）

組別 n CRP（ng/mL）CS-12組 6 20.66±2.08 CS-24組 6 20.30±0.76神經(jīng)功能缺損評分 腦梗死面積比均值0 0 0 0 C-12組 6 27.23±5.65 3.99±0.82 0.40±0.033 C-24組 6 3.00±0.63 0.37±0.024 22.93±2.97 HH-12組 6 18.85±3.34 2.67±0.81 0.31±0.037 HH-24組 6 2.67±0.51 0.30±0.044 20.71±1.68 YD-12組 6 2.67±0.81 0.29±0.065 19.74±3.35 YD-24組 6 2.67±0.51 0.30±0.056 17.76±1.51

2.4 各組大鼠腦切片病理及炎癥情況比較 見圖1。病理切片顯示，模型組局灶神經(jīng)上皮胞漿透亮，似核周空暈，散在分布淋巴細胞；假手術(shù)組：散在分布淋巴細胞；紅花注射液組局灶神經(jīng)上皮胞漿透亮，散在較多分布的淋巴細胞；依達拉奉組散在分布少許淋巴細胞，近腦室為著，灶狀淋巴組織聚集。

圖1 各組大鼠腦病理切片比較（HE染色，400倍，100倍）

3 討 論

現(xiàn)今由于吸煙、喝酒、夜生活過度、高脂肪飲食等不良生活習慣及高工作強度使腦卒中等心腦血管疾病的患病率顯著升高。世界銀行發(fā)布的報告中指出，慢性病已對中國國民健康造成不可估計的損失，慢性病死亡占死亡人數(shù)的比例已超過百分之八十多，其中，腦卒中對個體健康和生活造成的危害最大［3］。根據(jù)相關(guān)報告公布的數(shù)據(jù)，我國腦卒中患病率逐步升高。由此可見，我國腦卒中防控形勢嚴峻［4］。

hs-CRP是急性時相蛋白，可以誘發(fā)炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，并對細胞因子的平衡起重要調(diào)節(jié)功能［5］。hs-CRP異常表達均對急性腦梗死病變的形成和進展起重要作用［6］。正常人血清中超敏CRP含量很少，幾乎檢測不到，但當機體出現(xiàn)炎癥、創(chuàng)傷和心腦血管疾病時hs-CRP會升高。hs-CRP的水平與炎癥的出現(xiàn)及其嚴重程度具有相關(guān)性。臨床研究表明，患者hs-CRP、FIB水平均與NIHSS評分呈正相關(guān)（r分別為0.291、0.891，P＜0.05），并由此得出結(jié)論：hs-CRP、FIB水平的升高與腦梗死的發(fā)病關(guān)系密切，及時檢測這兩項指標的水平變化有助于腦梗死的早發(fā)現(xiàn)、早治療［7］。hs-CRP濃度可以作為腦梗死高危人群的臨床篩查工具指標［8］。

紅花注射液是臨床常用的中成藥，因此本課題基于抗炎癥反應(yīng)來探討紅花注射液治療腦梗死的部分作用機制。紅花味辛微苦、性溫，乃活血通經(jīng)、祛瘀止痛之良藥，素有“活血之王”的美稱，其在腦血管的防治中發(fā)揮著重要作用。從紅花中提取得到的紅花黃色素可顯著改善腦缺血性缺氧，并且紅花黃色素的抗凝血作用可以抑制大鼠血栓形成［9］，對腦梗死具有較好的治療效果［10］。研究表明，黃芪注射液加紅花注射液促進腦缺血再灌注模型鼠NT-3的上調(diào)可能是其抗腦缺血再灌注損傷的作用機制之一［11］。紅花黃色素可以明顯改善急性腦梗死患者的血漿黏度，降低紅細胞壓積，糾正血液高黏狀態(tài)［12］。紅花注射液在大鼠腦缺血/再灌注損傷中通過增強機體SOD活性，降低MDA含量，達到其保護作用［13］。紅花注射液顯著減輕CH誘導的兔海馬缺血缺氧性損傷，可能是通過抑制nNOS蛋白表達起作用的［14］。趙氏等［15］運用網(wǎng)絡(luò)藥理學理念和網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)研究紅花注射液主要活性成分對腦血管疾病網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控作用，結(jié)果成分-靶點網(wǎng)絡(luò)含有940個節(jié)點，2360條連接。涉及的生物學過程主要有生物大分子合成及代謝、神經(jīng)再生、凋亡、血管生成、免疫炎癥反應(yīng)、缺氧應(yīng)激響應(yīng)等，其中羥基紅花黃色素A和槲皮素可能通過協(xié)同抗凋亡的作用發(fā)揮抗腦血管疾病作用。紅花注射液廣泛的用于腦梗死、冠心病等疾病的臨床治療，臨床觀察發(fā)現(xiàn)患者癥狀顯著改善，且使用過程中無明顯不良反應(yīng)。崔氏等［16］通過對9項研究共800例患者的系統(tǒng)評價，肯定了紅花黃色素對急性腦梗死治療的有效性與安全性。

因紅花注射液通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)標志物hs-CRP的研究較少，探究紅花注射液對于腦卒中大鼠模型血清中hs-CRP這種重要的炎性生物標志物表達的影響有重要的意義。本實驗研究表明，紅花注射液能夠改善急性腦梗死實驗大鼠神經(jīng)功能缺損，減輕炎癥反應(yīng)，抑制腦卒中大鼠血清中hs-CRP炎性生物標志物的表達，進一步明確了紅花注射液對缺血性腦卒中有治療作用的機理，也為紅花注射液治療某些炎癥損傷疾病提供了一定的參考價值。下一步本課題將從氧化應(yīng)激信號通路深化對紅花注射液抗炎的機制研究。

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Study of Safflower Injection on Acute Ischemic Cerebral Infarction through Anti-inflammatory Way

QIN Xiude，LIU Yu，LI Chuanpeng，et al. Shenzhen TCM Hospital Affiliated to Guangzhou University of TCM，Guangdong，Shenzhen 518000，China.

Objective：To explore the effect of safflower injection on the expression of inflammatory bio-markers of hypersensitive C-reactive protein in MCAO model rats.Methods：MCAO model was established with reforming Longa method.The effect of safflower injection on the neurological deficits and infarct size in MCAO rats was evaluated.The expression level of inflammatory bio-markers of hypersensitive C-reactive protein was detected using ELISA method.Results：Neurologic impairment in rats：safflower injection could improve the neurologic function of MCAO rats.The brain infarction area ratio：there was significant difference between the 12 hours group of safflower injection and the model group（P＜0.05），and there was also significant difference between the 24 hours group of safflower injection and the model group（P＜0.05）.Serum hs-CRP concentration：there was significant difference between the hsCRP concentration of the safflower injection 12 hours group and the 12 hours model group（P＜0.05）.Conclusion：Safflower injection can reduce the infarct area of the stroke model rats，relieve inflammatory reaction and inhibit the expression of inflammatory biomarkers such as serum super-sensitive C-reactive protein.

Stroke；high-sensitivity C-reactive protein；Safflower injection

R285.5

A

1004-745X（2017）03-0409-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.010

2016-12-06）

深圳市科技計劃項目（JCYJ20150401163247219）

△通信作者（電子郵箱：xxzgw@126.com）