鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶耐藥基因分析及同源性研究

饒麗華++++涂建斌++++王艷琴

[摘要]目的 分析鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶耐藥基因型和醫(yī)院感染鮑曼不動(dòng)桿菌同源性。方法 回顧性分析2013年1月～2014年8月非重復(fù)分離的68株耐碳青烯酶鮑曼不動(dòng)桿菌（CRAB），多重PCR的方法檢測(cè)6種常見的β-內(nèi)酰胺酶基因IMP、VIM、OXA-23、OXA-24、OXA-58和OXA-51，并對(duì)其中確定為醫(yī)院感染的8株用脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）進(jìn)行基因同源性分析。結(jié)果 68株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌全部檢出OXA-23、OXA-51基因，其余基因均未檢出；8株經(jīng)PFGE同源性分析提示為同一來(lái)源克隆株，且同源性較高。結(jié)論 我院臨床分離的耐碳青霉烯酶鮑曼不動(dòng)桿菌主要攜帶OXA-23、OXA-51基因型，且存在克隆傳播。

[關(guān)鍵詞]鮑曼不動(dòng)桿菌；碳青霉烯酶；耐藥基因；同源性

[中圖分類號(hào)] R446.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）02（c）-0115-04

Analysis for genotype and homology of carbapenemase resistance in Acinetobacter baumannii

RAO Li-hua TU Jian-bin WANG Yan-qin

Department of Clinical Laboratory，Nanchang Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine in Jiangxi Province，Nanchang 330002，China

[Abstract]Objective To analyze the genotype and homology of drug resistance gene in carbapenemase resistant Acinetobacter baumannii（CRAB）.Methods 68 strains of CRAB isolated from January 2013 to August 2014 were included in our retrospective analysis.Multiplex Polymerase Chain Reaction（Multiplex-PCR） was conducted to analyze six types of β-lactamase resistant gene IMP，VIM，OXA-23，OXA-24，OXA-58，OXA-51 in these strains of CRAB，and the gene homology of 8 CRAB isolateswere analyzed by pulsed field gel electrophoresis（PFGE）.Results All of the 68 isolates of CRAB were found to carry OXA-23，OXA-51，but not IMP，VIM，OXA-24，OXA-58.The result of PFGE suggested that the 8 CRAB isolates might derived from the same clone.And the gene homology analysis showed high homology among them.Conclusion All the 68 CRAB strains isolated from our hospital belong to the same clone and carry OXA-23，OXA-51 genes mainly，indicating that there is clone spread among CRAB isolates.

[Key words]Acinetobacter baumannii；Carbapenemase；Drug resistance gene；Homology鮑曼不動(dòng)桿菌為不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界，屬于條件致病菌，是醫(yī)院感染的重要病原菌之一，可引起呼吸道、泌尿道、血液、傷口等感染[1]。碳青霉烯類抗生素（亞胺培南、美羅培南等）是有效治療革蘭陰性桿菌，特別是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和持續(xù)高產(chǎn)C類頭孢菌素酶（AmpC酶）感染的重要抗生素。近年來(lái)，廣譜抗菌藥物的大量運(yùn)用使鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌（carbapenemase resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）的比例逐年增高[2]。多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌已成為引起院內(nèi)感染的重要病原菌，給臨床治療帶來(lái)極大困難[3]。本研究分析我院臨床分離的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶耐藥基因型和醫(yī)院感染鮑曼不動(dòng)桿菌同源性，探究CRAB對(duì)多種抗菌藥物的耐藥機(jī)制，為防治CRAB感染提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來(lái)源 68株CRAB均分離自2013年1月～2014年8月于我院住院患者臨床標(biāo)本，68株菌株均為非重復(fù)分離菌株。其中痰65株、膿液2株、創(chuàng)面分泌物1株。68例菌株中有26例來(lái)自我院呼吸科，其余均來(lái)自我院ICU。

1.1.2儀器與試劑 VITEK2-Compact型全自動(dòng)微生物鑒定與藥敏分析系統(tǒng)（法國(guó)生物-梅里埃）、AMP Genligt2400擴(kuò)增儀、3730xl DNA Analyzer、測(cè)序儀和Beckman Coulter Optimal-80XP、Premix Tag酶體系由安普利生物技術(shù)公司提供。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢驗(yàn)中心。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 所有分離菌株的培養(yǎng)鑒定嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[4]進(jìn)行，采用梅里埃VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)所有收集的菌株進(jìn)行種屬鑒定。采用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定菌株對(duì)常用18種抗菌藥物的敏感性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Lab？鄄oratory Standards Institute，CLSI）2010的標(biāo)準(zhǔn)判定[5]。

1.2.2 OXA酶基因檢測(cè)PCR擴(kuò)增 此過(guò)程由廈門安普利生物技術(shù)公司協(xié)作完成。①樣本的處理：挑取平板上的單菌落，加入25 μl的TE緩沖液水溶解，振蕩均勻后加入25 μl的標(biāo)本處理液混勻，100℃加熱10 min，13 000 r/min離心10 min，取上清備用；②50 μl的擴(kuò)增體系如下：上游引物0.2 μl，下游引物0.2 μl，dNTPS 0.6 μl，Taq酶0.5 μl，模板DNA 2 μl，DNA通用液46.5 μl；③PCR擴(kuò)增過(guò)程：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳，染色后在凝膠成像系統(tǒng)上分析結(jié)果，電泳結(jié)果大小與預(yù)期產(chǎn)物片段大小一致的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。在NCBI上下載VIM、IMP、OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA58的相關(guān)基因序列，用DNAman比對(duì)軟件進(jìn)行比對(duì)，選擇其保守序列設(shè)計(jì)引物，利用Primer 3.0在線設(shè)計(jì)引物（廈門安普利生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)）（表1）。

1.2.3脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE） 由廈門安普利生物技術(shù)公司協(xié)作完成：首先配制pH值為8.0的細(xì)胞懸浮液，乙二胺四乙酸∶Tris（100 mmol/L）=1∶1；將平板上的細(xì)菌制成均勻細(xì)菌懸液，細(xì)菌濃度為4 MCF。取細(xì)菌懸液200 μl和蛋白酶K 10 μg混合，取1% Seaken Gold 200 μl瓊脂糖凝膠制成膠塊，膠塊固定后置于細(xì)胞裂解液與蛋白酶K的混合液中3 h，洗膠后置于5 ml的TE緩沖液中低溫保存，膠塊切割成小塊后置于酶切緩沖液中3 h，配制Seaken Gold瓊脂糖凝膠160 ml，54℃水浴，倒入模具，凝固后將膠塊置于電泳槽，條件設(shè)置為：電壓6 V/cm，時(shí)間16 h，溫度14℃，脈沖0.2～18.0 s，重復(fù)間隔120°，分子量標(biāo)志物為λLadderDNA。電泳結(jié)束后行Gelred染色20 min，用熒光成像儀進(jìn)行膠體成分分析，用統(tǒng)計(jì)軟件分析同源性。

2結(jié)果

2.1 68株CRAB桿菌耐藥率

68株CRAB對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦最為敏感，耐藥率為36%，其次是米諾環(huán)素，耐藥率為45%；而對(duì)另外16種抗菌藥物的耐藥率均在60%以上，其中對(duì)氨芐西林、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、哌拉西林等耐藥率高達(dá)100%（表2）。

2.2多重PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.1 OXA酶基因檢測(cè)結(jié)果 68株CRAB的基因檢測(cè)均攜帶有OXA-23、OXA-51基因；未檢測(cè)出IMP、VIM、OXA-24、OXA-58基因。

2.2.2部分?jǐn)U增產(chǎn)物電泳結(jié)果 結(jié)果表明若基因電泳為陰性，則無(wú)條帶顯示（圖1）。

1.OXA-51基因；2.OXA-23基因；其他4個(gè)基因電泳結(jié)果陰性，無(wú)條帶

3討論

近幾年，世界各地均出現(xiàn)了多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的醫(yī)院感染和暴發(fā)流行。隨著廣譜抗菌藥物的大量使用特別是碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，CRAB呈逐年增加的趨勢(shì)，對(duì)其臨床治療造成較大的困難[6]。有報(bào)道鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多種抗菌藥物具有天然耐藥性，其主要耐藥機(jī)制是外膜微孔蛋白形成的通道小，從而導(dǎo)致外膜通透性低，抗菌藥物不易進(jìn)入[7]。

本研究收集的菌株均來(lái)自使用廣譜抗生素且免疫力低下的ICU病區(qū)和呼吸科患者，與王金良[8]報(bào)道的近幾年鮑曼不動(dòng)桿菌感染率在不斷上升，已成為重癥監(jiān)護(hù)病房感染的主要病原菌相符。

本研究藥敏結(jié)果表明除對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦和米諾環(huán)素比較敏感，對(duì)其他16種抗菌藥物的耐藥率均在60%以上，其中對(duì)氨芐西林、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、哌拉西林等耐藥率高達(dá)100%，耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻。據(jù)目前研究，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)生水解藥物的碳青霉烯酶，碳青霉烯水解酶的產(chǎn)生是介導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因[9]，而產(chǎn)OXA類碳青霉烯酶是引起世界范圍內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的最重要機(jī)制。

本研究68株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌全部檢出OXA-23、OXA-51基因，其余基因均未檢出，高于魏星等[10]報(bào)道的比例，表明我院臨床分離的CRAB碳青霉烯酶的耐藥基因主要是OXA-23型，這與國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道基本相同[11-12]。我院鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥與OXA-23、OXA-51基因密切相關(guān)，據(jù)報(bào)道國(guó)內(nèi)大約有80%的鮑曼不動(dòng)桿菌是由于產(chǎn)生OXA-23型碳?xì)湎┟?，OXA-23可能是鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥的主要原因[13]。這與有些學(xué)者認(rèn)為鮑曼不動(dòng)桿菌中最常見的為產(chǎn)生碳?xì)涿赶┟?，即OXA酶，OXA酶的四個(gè)基因型中OXA-23和OXA-51是我國(guó)流行最廣的碳?xì)涿赶┟富蛐陀^點(diǎn)一致[14]。

鮑曼不動(dòng)桿菌作為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌已引起世界范圍內(nèi)的廣泛重視，隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素和第三代頭孢菌素等廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，誘導(dǎo)了大量耐藥株的產(chǎn)生，由單一抗生素耐藥發(fā)展到多重耐藥，甚至出現(xiàn)了泛耐菌株，給抗感染治療帶來(lái)巨大困難[15-16]。鮑曼不動(dòng)桿菌感染也一直是我院ICU、呼吸科等臨床科室抗感染治療最棘手的問(wèn)題，本研究中鮑曼不動(dòng)桿菌菌株表型全部為多重耐藥，目前，臨床面臨藥物選擇的巨大壓力，所以臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)積極建立碳青霉烯水解酶的檢測(cè)方法，加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)酶菌株的檢測(cè)與監(jiān)控，指導(dǎo)臨床在選擇聯(lián)合用藥方案時(shí)，一方面要考慮到藥物的最小抑制濃度，另一方面應(yīng)盡可能了解菌株的主要耐藥表型，便于針對(duì)不同的耐藥機(jī)制，合理聯(lián)合用藥。

本研究對(duì)確定為醫(yī)院感染的8株CRAB經(jīng)PFGE同源性分析提示為同一來(lái)源克隆株，且同源性較高，進(jìn)一步提示CRAB在我院潛在暴發(fā)流行趨勢(shì)。由于CRAB對(duì)包括碳青霉烯類的大多數(shù)抗生素耐藥，CRAB在同一病區(qū)及不同病區(qū)間傳播是很容易導(dǎo)致暴發(fā)流行的，因此預(yù)防該類感染的發(fā)生較治療更重要，為避免耐藥菌在醫(yī)院環(huán)境中廣泛定植傳播，應(yīng)采取有效的感染控制方法，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作和感染控制規(guī)范，重視醫(yī)護(hù)人員手衛(wèi)生，加強(qiáng)消毒隔離措施，切斷耐藥克隆株的傳播途徑，合理使用抗菌藥物防止耐藥菌株的產(chǎn)生與流行。

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（收稿日期：2016-11-21 本文編輯：任 念）