人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)CD4+CD45RA—CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞增殖研究

張煥婷++池穎+++韓之波+曹曉滄

[摘要] 目的 研究人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是否能誘導(dǎo)正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞增殖。 方法 分離、純化、表型鑒定人胎盤來源的MSC。實(shí)驗(yàn)分組如下：PBMC組、PBMC+MSC組、CD3+CD28+PBMC組和MSC+CD3+CD28+PBMC組。相同條件下培養(yǎng)24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞比例；ELISA法檢測各組上清中白細(xì)胞介素10（IL-10）水平，并對MSC+CD3+CD28+PBMC組中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例和其上清中IL-10含量作相關(guān)性分析。 結(jié)果 MSC+CD3+CD28+PBMC組中CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞比例為（6.66±2.80）%，PBMC組為（1.01±0.44）%，PBMC+MSC組為（1.14±0.78）%，CD3+CD28+PBMC組為（4.20±2.58）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。MSC+CD3+CD28+PBMC組上清中的IL-10含量為（14.45±3.14）pg/mL，PBMC組為（0.90±0.05）pg/mL，PBMC+MSC組為（11.00±3.02）pg/mL，CD3+CD28+PBMC組為（6.04±1.90）pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。MSC+CD3+CD28+PBMC組中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例與其上清中IL-10含量成正相關(guān)（r=0.880，P < 0.01）。 結(jié)論 MSC可以誘導(dǎo)CD3、CD28活化的PBMC細(xì)胞中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞增殖，CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞比例增加與上清中IL-10水平升高有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 間充質(zhì)干細(xì)胞；外周血單個(gè)核細(xì)胞；白介素10；CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞

[中圖分類號] R392 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（c）-0008-05

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是一群來源于中胚層的異質(zhì)細(xì)胞。這些細(xì)胞能在合適的培養(yǎng)條件下分化為骨、軟骨、脂肪甚至神經(jīng)組織，用于受損組織的修復(fù)或治療免疫性疾病[1-2]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞主要是CD4+細(xì)胞群：CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1等。Tr1細(xì)胞首先在人類白細(xì)胞抗原不相合胎兒肝臟造血干細(xì)胞移植形成長期嵌合體的重癥聯(lián)合免疫缺陷患者中發(fā)現(xiàn)[3-4]。Tr1與Th0、Th1及Th2最大的區(qū)別在于其獨(dú)特的細(xì)胞因子格局：IL-2-/low、IL-4-、IL-5+、IFN-γ+、IL-10+、TGF-β+[5-7]。Tr1細(xì)胞本身并不存在于外周血中，而是由CD4+T細(xì)胞在抗原反復(fù)刺激誘導(dǎo)下產(chǎn)生的。Tr1細(xì)胞可通過其分泌的細(xì)胞因子治療多種免疫相關(guān)的疾病如哮喘、移植物抗宿主反應(yīng)疾病等[8-9]，因此在免疫學(xué)界的掀起了極大的研究熱潮。

研究發(fā)現(xiàn)，MSC與PBMC共培養(yǎng)時(shí)可以誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+Treg增殖[10-11]。本實(shí)驗(yàn)旨在探究MSC與CD3、CD28活化的PBMC共培養(yǎng)時(shí)誘導(dǎo)CD4+CD45RA- CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞增殖的情況及CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞對上清中IL-10水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640培養(yǎng)基、DF-12培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，胎牛血清（FBS）購于美國Hyclone公司，PE標(biāo)記的小鼠抗人CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166抗體以及PE標(biāo)記的小鼠抗人CD4抗體，PE-Cy7標(biāo)記的小鼠抗人CD45RA抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的小鼠抗人CD49b抗體，APC標(biāo)記的小鼠抗人LAG3抗體，同型對照抗體，抗CD3、CD28抗體，IL-10 ELISA檢測試劑盒均購自Biolegend公司。人淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)柟?。收?016年3～6月在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院就診患者的血樣13個(gè)，研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有人簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 MSC的分離、純化及鑒定

胎盤由天津中心婦產(chǎn)醫(yī)院健康足月產(chǎn)產(chǎn)婦捐獻(xiàn)，簽署知情同意書。將胎盤剪成1 cm3左右的小塊，經(jīng)膠原酶酶II消化、淋巴細(xì)胞分離液離心、濾網(wǎng)過濾制備成單個(gè)核細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度1×106/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃孵箱中，48 h后換液，棄去未貼壁的細(xì)胞。細(xì)胞達(dá)到70%融合時(shí)，胰酶消化，分瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。3 d換液1次，7～8 d傳代1次。擴(kuò)增大量的3代細(xì)胞用于接下來的實(shí)驗(yàn)。光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)分析MSC表面抗原CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166。

1.2.2 人外周血T細(xì)胞的分離

取適量的淋巴細(xì)胞分離液置于50 mL的無菌離心管，5 mL肝素抗凝血與等量無菌PBS充分混勻后緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液液面上，2000 r/min離心20 min。將彎頭滴管插入云霧層仔細(xì)吸取上、中層界面處的云霧層細(xì)胞置入另一離心管中，加入10倍體積的RPMI1640液，1500 r/min離心10 min，洗滌2次，棄上清，加入含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL。

1.2.3 MSC對各組CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例的影響

取1 mL調(diào)整至1×105/mL的第3代MSC接種于6孔板內(nèi)，完全貼壁后，經(jīng)60Co照射后棄去培養(yǎng)基。將1 mL PBMC混懸液接種于上述的6孔培養(yǎng)板中，加入CD3+CD28（終濃度20 μg/mL）。實(shí)驗(yàn)組分為PBMC、PBMC+MSC、PBMC+CD3+CD28和PBMC+CD3+CD28+MSC 4個(gè)組。37℃培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞，加入由PE、PE-Cy7、FITC、APC分別標(biāo)記的CD4、CD45RA、CD49b、LAG3抗體，4°C避光孵育30 min，流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1的比例。

1.2.4 MSC對各組IL-10水平的影響

取上述4組培養(yǎng)體系的上清，-80℃保存待檢。ELISA法檢測各組的IL-10水平，具體操作步驟按說明書進(jìn)行。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析以及SNK法多重比較，相關(guān)分析采用Pearson分析法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSC的分離、純化及鑒定

原代分離的MSC只有少數(shù)貼壁生長，換液后MSC生長加快，形態(tài)不均一。1周后細(xì)胞成克隆樣生長，2周后細(xì)胞成漩渦狀生長，3周后細(xì)胞匯集成片，融合度達(dá)90%，3代后的細(xì)胞形態(tài)呈均一的長梭形（圖1A）。流式細(xì)胞術(shù)分析MSC表型為：CD14-、CD34-、CD45-、CD29+、CD44+、CD105+、CD106+和CD166+（圖1B）。

2.2 MSC對CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例的影響

研究采用CD4、CD45RA、CD49b與LAG3抗體標(biāo)記鑒定Tr1細(xì)胞（圖2）。流式細(xì)胞術(shù)分析各組中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例，MSC+PBMC+CD3+CD28組為（6.66±2.80）%，PBMC組為（1.01±0.44）%，PBMC+CD3+CD28組為（4.20±2.58）%，MSC+PBMC組為（1.14±0.78）%，可見MSC+PBMC+CD3+CD28組中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖3。

2.3 MSC對上清中IL-10水平的影響

在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h后經(jīng)ELISA法檢測4組上清中的IL-10水平。結(jié)果表明MSC+PBMC+CD3+CD28組的IL-10水平為（14.45±3.14）pg/mL，PBMC+CD3+CD28組為（6.04±1.90）pg/mL，PBMC組為（0.90±0.05）pg/mL，MSC+PBMC組為（11.00±3.02）pg/mL。數(shù)據(jù)分析表明CD3+CD28+PBMC+MSC組的IL-10水平顯著高于PBMC+CD3+CD28組和PBMC組（P < 0.05），但與MSC+PBMC組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。此外，MSC+PBMC+CD3+CD28組CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例與其上清中IL-10水平為正相關(guān)（r=0.880，P < 0.01）。見圖4。

3 討論

人類MSC具有高度的自我更新和多向分化潛能，在合適的培養(yǎng)基中可向多種組織方向分化，包括成骨細(xì)胞、軟骨、脂肪、肌肉、肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，因此在組織工程和臨床細(xì)胞治療中發(fā)揮重要作用[1，12-13]。胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞因其取材方便，來源充足，不受倫理的限制，受到國內(nèi)外免疫學(xué)學(xué)者的關(guān)注[14-16]。許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MSC能夠誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+Treg增殖，但MSC是否能夠誘導(dǎo)PBMC中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1增殖還未可知。

Tr1細(xì)胞主要是由CD4+T細(xì)胞經(jīng)IL-10誘導(dǎo)產(chǎn)生的，以分泌高水平的IL-10和TGF-β為特征，其可能通過非細(xì)胞接觸依賴的IL-10分泌發(fā)揮抑制效應(yīng)性T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生的作用[17]。過去Tr1因缺乏特異性表面標(biāo)志無法對其進(jìn)行分析與分離。Groux等[7]發(fā)現(xiàn)兩個(gè)用于鑒定Tr1的選擇性表面標(biāo)志—CD49b與LAG3。本研究利用這兩個(gè)標(biāo)志對MSC是否能誘導(dǎo)產(chǎn)生Tr1細(xì)胞進(jìn)行了分析。

本研究發(fā)現(xiàn)人胎盤來源的MSC能誘導(dǎo)經(jīng)CD3、CD28活化的PBMC中CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞增殖。機(jī)制可能是MSC本身就具有免疫調(diào)節(jié)能力，其本身通過分泌IL-10作用于PBMC中的CD4+細(xì)胞促進(jìn)其向CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1方向分化，也可能是MSC分泌的細(xì)胞因子作用于PBMC中的單核細(xì)胞，如M2型巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其分泌IL-10，再作用于CD4+細(xì)胞使其向CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1方向分化，CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞分泌的IL-10再作用于CD4+細(xì)胞，從而形成正反饋增加Tr1細(xì)胞的產(chǎn)生[18-20]。本研究證實(shí)MSC可以誘導(dǎo)經(jīng)CD3、CD28活化的PBMC中CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1增殖，并提高上清中IL-10水平。但I(xiàn)L-10可能來源于CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細(xì)胞，也可能來源于MSC甚至是單核細(xì)胞，將來的研究需進(jìn)一步研究IL-10的來源。本文研究了CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1的比例和上清中IL-10水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MSC與CD3、CD28活化的PBMC共培養(yǎng)后誘導(dǎo)的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1與上清中IL-10水平有正相關(guān)的關(guān)系。由此推測共培養(yǎng)上清中增高的IL-10有可能與CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例升高有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MSC能誘導(dǎo)CD3、CD28活化的PBMC中CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1增殖，并能提高培養(yǎng)體系上清中的IL-10水平。本研究為臨床應(yīng)用MSC治療自身免疫性疾病、過敏性反應(yīng)、慢性炎癥性疾病、移植排斥及腫瘤等因免疫失調(diào)引起的疾病提供了新的依據(jù)和手段。

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（收稿日期：2016-11-21 本文編輯：李岳澤）