• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    數(shù)字PCR在幾種常見人類傳染病研究中的應(yīng)用

    2017-04-05 07:56:52蔣析文朱小亞高秀潔周其偉
    分子診斷與治療雜志 2017年1期
    關(guān)鍵詞:拷貝數(shù)載量精密度

    蔣析文朱小亞 高秀潔 周其偉

    ·綜述·

    數(shù)字PCR在幾種常見人類傳染病研究中的應(yīng)用

    蔣析文★朱小亞 高秀潔 周其偉

    聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechain reaction,PCR)是現(xiàn)代分子生物學(xué)的基礎(chǔ),被廣泛應(yīng)用于核酸的定性及定量分析,是人類傳染病病毒核酸分析的核心技術(shù)。數(shù)字PCR(digital polymerase chain reaction,dPCR)作為一種新興的核酸定量分析技術(shù),具有高精確度、高精密度等優(yōu)點(diǎn)。它打破了傳統(tǒng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real?time PCR,qPCR)技術(shù)的局限,不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線,直接檢測(cè)樣本中靶片段的拷貝數(shù),是一種更為簡(jiǎn)單且實(shí)用的核酸絕對(duì)定量分析技術(shù)。本文就近幾年該技術(shù)在人類傳染病病毒核酸定量分析方面的研究進(jìn)行概述。

    數(shù)字PCR(dPCR);病毒;核酸

    數(shù)字PCR(digital polymerase chain reaction,dPCR)誕生于上個(gè)世紀(jì)90年代末,該技術(shù)將反應(yīng)體系分散到許多獨(dú)立的反應(yīng)單元,使得每個(gè)反應(yīng)單元中只包含1分子的靶片段或者不包含靶片段,經(jīng)熱循環(huán)反應(yīng),直接或通過泊松分布分析陽(yáng)性反應(yīng)單元的數(shù)目,計(jì)算樣本中靶片段的起始拷貝數(shù)。該技術(shù)使用與實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantita?tive real?time PCR,qPCR)相同的引物以及探針,無需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線且不依賴于Ct值,對(duì)樣品中靶片段進(jìn)行絕對(duì)定量,已廣泛用于基因差異表達(dá)、下一代測(cè)序、微生物檢測(cè)及臨床診斷等領(lǐng)域[1?6]。

    病毒載量是病毒感染診斷和治療的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo),一方面用于評(píng)價(jià)高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的療效,另一方面用于篩查血清學(xué)檢驗(yàn)中由窗口期造成的漏檢[7?8]。qPCR被廣泛應(yīng)用于病毒載量的分析,該方法雖然簡(jiǎn)易、快速且成本較低,但在靶片段含量較低或抑制物存在等情況下精密度和靈敏度低,且依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值[9]。核酸檢測(cè)方法的精密度對(duì)于傳染病的的診斷治療極為重要,即使病毒載量處于低拷貝水平,其少量增加也具有重要臨床意義。據(jù)研究報(bào)道,當(dāng)人類巨細(xì)胞病毒感染者體內(nèi)該病毒的載量從低于200 copies/mL增加到高于200 copies/mL時(shí)會(huì)表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀,而qPCR由于精密度不夠高,無法檢測(cè)出這一變化[10?13]。dPCR作為一種新型的核酸分子定量檢測(cè)技術(shù),具有高精密度的特點(diǎn),完全可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)qPCR在精密度方面的缺陷[14?16]。臨床樣本如血液、糞便、石蠟包埋樣本等通常比較復(fù)雜,常含有大量的PCR抑制劑,研究發(fā)現(xiàn)dPCR具有對(duì)抑制物的耐受能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),其擴(kuò)增效率受抑制物影響小,更適合用于檢測(cè)復(fù)雜的臨床樣本如糞便、組織樣品等[17]。此外一些研究表明dPCR還具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),在檢測(cè)稀有突變時(shí)靈敏度達(dá)0.005%,約為qPCR的200倍[18]。因此,該技術(shù)逐漸被用于病毒載量分析相關(guān)研究,本文就近幾年dPCR在幾種常見傳染病研究上的應(yīng)用進(jìn)行介紹,以期為該技術(shù)的發(fā)展及在傳染病方面的應(yīng)用提供參考。

    1 dPCR平臺(tái)簡(jiǎn)介

    數(shù)字PCR的概念于上個(gè)世紀(jì)末由Vogelstein等[19]提出,具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景,已飛速地商業(yè)化發(fā)展。目前基于數(shù)字PCR技術(shù)的商業(yè)化平臺(tái)主要有2種,一種是芯片式的dPCR(chip digital PCR,cdPCR),該平臺(tái)以美國(guó)FluidigmBioMarkTMHD和Life Technologies QuantStudioTM3D系統(tǒng)為代表,采用微流控技術(shù)將混合均勻的PCR反應(yīng)體系分成若干個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)單元,并將這些反應(yīng)單元傳送至芯片反應(yīng)室中進(jìn)行PCR反應(yīng),利用類似基因芯片方法分析每個(gè)反應(yīng)室的熒光信號(hào),計(jì)算靶片段的數(shù)目。另一種是由美國(guó)Bio?Rad和RainDance先后引進(jìn)的一個(gè)微滴式dPCR系統(tǒng)(droplet digital PCR,ddP?CR),該平臺(tái)將反應(yīng)液均勻地分散到許多由乳液包裹的微型液滴中(Bio?Rad QX200為2萬個(gè),RainDance為100~1 000萬個(gè)),每個(gè)液滴都是一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)單元,通過分析帶有熒光信號(hào)的液滴數(shù),計(jì)算熒光信號(hào)的液滴與總液滴的比例,最終計(jì)算出靶片段的拷貝數(shù),這種系統(tǒng)與cdPCR相比,原理和操作都更為簡(jiǎn)單,也更為經(jīng)濟(jì),目前已得到廣泛的應(yīng)用。

    2 dPCR在幾種常見傳染病中的應(yīng)用

    2.1 dPCR在人類免疫缺陷病毒(human immuno?deficiency virus,HIV)分析中的研究應(yīng)用

    自1981年獲得性免疫缺乏綜合征(acquired im? mune deficiency syndrome,AIDS)被發(fā)現(xiàn)以來,全球已經(jīng)有2 000多萬人死于此病,我國(guó)于1985年發(fā)現(xiàn)了首例HIV感染者,至2014年底累計(jì)報(bào)告的病例有49.7萬例,其中接受治療的患者約有34.4萬[20]。對(duì)于AIDS的治療,目前公認(rèn)的效果最好的方法為高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active anti?retroviral therapy,HAART),該方法使AIDS從致死性傳染病轉(zhuǎn)變成一種可以被治療的慢性疾病。2013年,Deb?orah等[21]報(bào)道了首例被功能性治愈的HIV感染案例,這名被治愈的HIV感染者是一個(gè)剛出生的嬰兒,在出生30 h后被確診感染了該病毒,在經(jīng)過18個(gè)月的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)HIV DNA和HIV RNA的拷貝數(shù)及HIV特異性抗體低于檢測(cè)限,最后利用ddPCR技術(shù)確認(rèn)該嬰兒被功能性治愈。病毒載量是評(píng)價(jià)HAART療效的重要指標(biāo)之一,HIV DNA被廣泛地用于衡量患者HIV病毒儲(chǔ)存庫(kù)的狀態(tài),而2?LTR(HIV前病毒核酸在宿主細(xì)胞中存在的一種形式)常反映患者HIV病毒動(dòng)力學(xué)特征。據(jù)報(bào)道,ddPCR在分析HIV DNA和2?LTR拷貝數(shù)時(shí)均具有較高精密度,檢測(cè)HIV DNA的精密度為qPCR的5倍,檢測(cè)2?LTR的精密度更高,為qPCR的20倍[22]。但也有研究指出ddPCR檢測(cè)低水平2?LTR(HIV前病毒核酸在宿主細(xì)胞中存在的一種形式)時(shí)變異度較大[23],由于該研究檢測(cè)的樣本數(shù)較少,并沒能解釋其變異度大的原因。由此可見,ddPCR確實(shí)具有精密度高的優(yōu)點(diǎn),但在檢測(cè)低水平核酸時(shí),其檢測(cè)性能還需進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證。細(xì)胞關(guān)聯(lián)的HIV?1 RNA(CA HIV?1 RNA)被認(rèn)為是評(píng)估病毒量及抗逆病毒療效的一個(gè)潛在的標(biāo)志。Kiselinova等[24]對(duì)44個(gè)HIV患者的外周單核細(xì)胞樣本中的CA HIV?1 RNA拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)ddPCR在檢測(cè)過程中容易產(chǎn)生假陽(yáng)性,進(jìn)而導(dǎo)致其線性關(guān)系、精確度和敏感性等方面不及半巢式定量PCR。導(dǎo)致PCR出現(xiàn)假陽(yáng)性原因有很多,如樣品間的交叉污染、氣溶膠污染等,dPCR靈敏度較高,即使反應(yīng)體系中存在極少量的污染也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性,因此使用dPCR時(shí)應(yīng)更加規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì),以避免假陽(yáng)性的產(chǎn)生。

    2.2 dPCR在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)核酸檢測(cè)中的應(yīng)用

    HBV呈世界性流行,全世界各地區(qū)均有不同程度的HBV感染。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)報(bào)道,全球曾經(jīng)感染過HBV的人約有20億,每年大約有100萬人死于HBV引起的肝硬化、肝衰竭及原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)等急性和慢性肝病[25?26]。Huang等[27]通過ddPCR技術(shù)分析感染HBV的HCC患者石蠟包埋的肝臟組織中HBV DNA拷貝數(shù)與腫瘤轉(zhuǎn)移、肝癌疾病歷程及血清中甲胎蛋白(α?fetoprotein,AFP)含量變化的相關(guān)性,同時(shí)對(duì)該技術(shù)的檢測(cè)性能進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果表明HBV感染是誘導(dǎo)HCC發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵因子,ddPCR靈敏度高且特異性強(qiáng)。qPCR為HBV DNA含量分析的常用方法,但用于檢測(cè)復(fù)雜的臨床樣本時(shí),如石蠟包埋的組織樣本,常因量化循環(huán)數(shù)接近PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)而難以精確定量,ddPCR技術(shù)在檢測(cè)中不依賴于Ct值,不受量化循環(huán)數(shù)的影響,因而更適合用于檢測(cè)復(fù)雜的臨床樣本。cccD?NA是HBV病毒在侵入人體肝細(xì)胞后,其部分雙鏈環(huán)狀的DNA分子以負(fù)鏈為模板延長(zhǎng)修補(bǔ)正鏈的缺口形成的完整共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子。它在細(xì)胞中作為HBV病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的模板,在病毒持續(xù)感染、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后病毒再活化及病毒耐藥性方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)ddPCR在檢測(cè)細(xì)胞中cccDNA方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。對(duì)HepG2.215細(xì)胞DNA中cccDNA含量進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在cccD?NA含量較低時(shí)qPCR精密度急劇下降,且qPCR檢測(cè)的靈敏度較低,最低檢出限為10 ng/μL,而ddP?CR的最低檢出限為1 ng/μL[28]。

    2.3 dPCR在檢測(cè)丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)研究中的應(yīng)用

    HCV是一種單鏈RNA病毒,其基因極易發(fā)生變異,可分為6個(gè)基因型及多個(gè)亞型。HCV感染性極強(qiáng),在全球普遍流行,據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)分析,全球大約有1.85億人感染該病毒,每年約有35萬人死于丙型肝炎及其并發(fā)癥[29]。持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(sus?tained virological response,SVR)是評(píng)價(jià)丙型肝炎治療藥物療效的重要指標(biāo),而快速病毒學(xué)應(yīng)答(rapid virological response,RVR)和早期病毒學(xué)應(yīng)答(ear?ly virological response,EVR)的精確判定對(duì)SVR的預(yù)測(cè)尤為重要,因此高靈敏度的HCV載量檢測(cè)方法對(duì)輔助HCV的治療極為關(guān)鍵。目前我國(guó)已有批準(zhǔn)生產(chǎn)的HCV RNA定量檢測(cè)試劑盒,但靈敏度較低,與我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局制定的標(biāo)準(zhǔn)(最低檢出限<50 IU/mL)相差甚遠(yuǎn)[30],根本不能滿足臨床的需求。Roche TaqMan HCV檢測(cè)試劑盒在國(guó)際上被公認(rèn)為是HCV RNA定量檢測(cè)性能較好的試劑盒之一,其靈敏度較高,檢測(cè)下限為15 IU/mL。比較分析dPCR和Roche TaqMan檢測(cè)HCV RNA的性能,發(fā)現(xiàn)dPCR在其可檢測(cè)的范圍內(nèi)保持良好線性關(guān)系和精密度,但在檢測(cè)低水平HCV RNA時(shí),與Roche TaqMan HCV存在較大差異,在18個(gè)HCV RNA水平低于15 IU/mL的樣本中,dPCR檢測(cè)出22.2%的樣本中HCV RNA高于15 IU/mL[31]。目前,dPCR在HCV病毒載量檢測(cè)方面的研究報(bào)道相對(duì)較少,還未見有研究對(duì)該技術(shù)檢測(cè)HCV載量的靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)。HCV基因組容易發(fā)生突變,其編碼的核心氨基酸區(qū)發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致肝病的惡化,是演變?yōu)镠CC的重要因素。ddPCR檢測(cè)突變靈敏度較高,Mukaide等[16]采用ddPCR的方法對(duì)HCV編碼的核心氨基酸區(qū)的突變進(jìn)行了分析,同時(shí)也將該方法與TaqMan HCV檢測(cè)方法進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)ddPCR在2.5~105拷貝數(shù)的檢測(cè)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好且靈敏度較高,最低檢出限達(dá)0.005%,該結(jié)果預(yù)示著ddPCR在定量分析基因突變方面具有顯著優(yōu)勢(shì),有望作為新一代基因突變定量分析工具應(yīng)用于病毒基因組多態(tài)性分析領(lǐng)域。

    2.4 dPCR在其他傳染病方面的應(yīng)用

    人類巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HC?MV)為皰疹病毒科(herpesviruses)雙螺旋DNA病毒,因其感染細(xì)胞后,導(dǎo)致細(xì)胞腫大而且細(xì)胞核內(nèi)具有巨大的包涵體,所以被稱為巨細(xì)胞病毒。該病毒在我國(guó)廣泛流行,研究表明,當(dāng)機(jī)體處于免疫缺陷或免疫系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)時(shí)極易感染HC?MV,如胎兒、新生兒及孕婦等,除此之外,接受器官或骨髓移植的患者也極易感染此病毒[32]。目前,基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)HCMV DNA的試劑盒已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn),但其檢測(cè)的靈敏度和精密度有時(shí)并不能滿足臨床的實(shí)際需求。采用qPCR和ddPCR對(duì)50個(gè)HCMV血漿樣本、梯度稀釋的HCMV標(biāo)準(zhǔn)品(WHO/NIST)進(jìn)行定量分析,發(fā)現(xiàn)dPCR檢測(cè)HCMV的精密度較好,但其靈敏度卻不及qPCR,還需進(jìn)一步的優(yōu)化才能更好的用于HCMV DNA定量分析[33]。另一項(xiàng)研究也利用qPCR和ddPCR技術(shù)分析了HCMV血漿樣本[34],但該研究發(fā)現(xiàn)ddPCR靈敏度與qPCR并無差異,且其精密度顯著高于qPCR。這2項(xiàng)研究表明,ddPCR在檢測(cè)HCMV時(shí)精密度確實(shí)較好,但其靈敏度卻沒有表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì),還需要進(jìn)一步的優(yōu)化,以提高其靈敏度。單純皰疹病毒(her?pes simplex virus,HSV)是一種雙鏈線性DNA病毒,具有囊膜結(jié)構(gòu),它能引起人類皮膚性疾病。人類是HSV病毒的唯一宿主,它主要通過感染人類面部和生殖器部位的皮膚和黏膜,引起口角膜炎、唇皰疹、口腔黏膜炎、生殖器皰疹等疾病,HSV感染還與多種疾病關(guān)系密切,如流產(chǎn)、胎兒畸形、宮頸癌及阿爾茨海默癥等[35]。Azizi等[36]利用dPCR的方法通過檢測(cè)HSV?1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系A(chǔ)V529?19中HSV編碼區(qū)UL5和UL29的的拷貝數(shù)評(píng)價(jià)HSV?1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系A(chǔ)V529?19的穩(wěn)定性,同時(shí)對(duì)dP?CR的檢測(cè)性能進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果表明dPCR的穩(wěn)定性、精確度以及精密度良好。dPCR在傳染病方面的應(yīng)用起步較晚,目前僅在幾種常見傳染病領(lǐng)域的研究中有所應(yīng)用。盡管如此,dPCR已表現(xiàn)出其顯著的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn),隨著該技術(shù)的不斷創(chuàng)新與發(fā)展,在傳染病領(lǐng)域的應(yīng)用前景將會(huì)越來越廣闊。

    3 展望

    傳染病病毒載量的檢測(cè)對(duì)于傳染病的早期診斷、治療效果評(píng)價(jià)、病情預(yù)測(cè)及監(jiān)測(cè)極為重要。而檢測(cè)方法的靈敏度、精密度和變異度等對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響不容忽視,高性能的檢測(cè)方法有助于對(duì)人類傳染病的預(yù)測(cè)及監(jiān)管,以縮短檢測(cè)的窗口期并及時(shí)的予以治療。數(shù)字PCR不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控品,直接對(duì)核酸進(jìn)行絕對(duì)定量,該技術(shù)目前已經(jīng)逐步的被用于多個(gè)領(lǐng)域的研究,且表現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì),大量的研究發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)qPCR相比,dPCR在檢測(cè)稀有突變、拷貝數(shù)變異及腫瘤相關(guān)的mi?RNA定量分析方面性能顯著提高。dPCR技術(shù)發(fā)展十分迅速,第一款數(shù)字PCR由Fluidigm公司于2006年推出,可同時(shí)檢測(cè)3.7萬個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)。隨后,QuantaLife推出了微滴數(shù)字PCR,被Bio?Rad收購(gòu)并推出新一代的微滴數(shù)字PCR QX100可生成2萬個(gè)液滴進(jìn)行高通量分析。而Rain Dance Technology于2012年推出的RainDrop?系統(tǒng)通量更大,可生成100萬個(gè)皮升級(jí)液滴。目前這3種dPCR產(chǎn)品中,Bio?RadQX100應(yīng)用較為普遍,主要運(yùn)用于科學(xué)研究領(lǐng)域,且已有的研究報(bào)道也暴露該技術(shù)還存在一些缺陷,就傳染病方面主要包括線性范圍比較局限、檢測(cè)過程中容易產(chǎn)生假陽(yáng)性、靈敏度也沒有顯著的優(yōu)勢(shì)等。盡管如此,dPCR憑借其現(xiàn)有的優(yōu)勢(shì),已逐步的被運(yùn)用于臨床疾病的診斷,去年我國(guó)將該技術(shù)列入腫瘤個(gè)體化治療檢測(cè)技術(shù)之一,今年Bio?Rad公司推出的微滴式數(shù)字PCR技術(shù)的第二代產(chǎn)品QX200成功獲得歐盟體外診斷產(chǎn)品CE認(rèn)證,這將極大地促進(jìn)該技術(shù)在臨床上的應(yīng)用。隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展與完善,相信在不久的將來該技術(shù)的缺陷得以彌補(bǔ),并在感染性疾病診斷、疾病超早期診斷、產(chǎn)前診斷及腫瘤早期診斷等領(lǐng)域發(fā)揮不可或缺的作用,成為新一代分子診斷的標(biāo)準(zhǔn)工具。

    [1]Hindson CM,Chevillet JR,Briggs HA,et al.Abso?lute quantification by droplet digital PCR versus analog real?time PCR[J].Nature Methods,2013,10(10):1003?1005.

    [2]Toshikatsu M,Satoshi N,Mikako I,et al.Comprehen?sive next?generation sequencing analyses of hypopara?thyroidism:identification of novel GCM2 mutations[J].Journal of Clinical Endocrinology&amp;Metabolism,2014,99(11):2421?2428.

    [3]Nejc R,Dany M,Ion GA,et al.One?step RT?droplet digital PCR:a breakthrough in the quantification of wa?terborne RNA viruses[J].Analytical&amp;Bioanalytical Chemistry,2014,406(3):661?667.

    [4]Sakorn P,Watcharee P.Detection of alpha(0)?thalasse?mia South?East Asian?type deletion by droplet digital PCR[J].European Journal of Haematology,2013,92(3):244?248.

    [5]Baker M.Digital PCR hits its stride[J].Nature Meth?ods,2012,9(6):541?544.

    [6]Morley AA.Digital PCR:a brief history[J].Biomolec?ular Detection and Quantification,2014,1(1):1?2.

    [7]Humar A,Gregson D,Caliendo AM,et al.Clinical utility of quantitative cytomegalovirus viral load deter?mination for predicting cytomegalovirus disease in liver transplant recipients[J].Transplantation,1999,68(9):1305?1311.

    [8]Thompson MA,Aberg JA,Hoy JF,et al.Antiretrovi?ral treatment of adult HIV infection:2012 recommenda?tions of the International Antiviral Society?USA panel[J].JAMA,2012,308(4):387?402.

    [9]Caliendo AM,Shahbazian MC.A commutable cyto?megalovirus calibrator is required to improve the agree?ment of viral load values between laboratories[J].Clini?cal chemistry,2009,55(9):1701?1710.

    [10]Doyle T,Smith C,Vitiello P,et al.Plasma HIV?1 RNA detection below 50 copies/ml and risk of virologic rebound in patients receiving highly active antiretrovi?ral therapy[J].Clinical Infectious Diseases,2012,54(5):724?732.

    [11]Jesse W,Ho DY,Paolo L,et al.Clinical significance of low cytomegalovirus DNA levels in human plasma[J].Journal of Clinical Microbiology,2012,50(7):2378?2383.

    [12]Tomas D,Anna MG.Low?level viraemia on HAART:significance and management[J].Current Opinion in Infectious Diseases,2012,25(1):17?25.

    [13]John W,Brendan P,Manjul M,et al.The significance of very low?level viraemia detected by sensitive viral load assays in HIV infected patients on HAART[J]. Journal of Infection,2011,62(1):87?92.

    [14]Phillip B,Tanner SC,Regan JF,et al.Droplet digital PCR measurement of HER2 copy number alteration in formalin?fixed paraffin?embedded breast carcinoma tis?sue[J].Clinical Chemistry,2013,59(6):1155?1156.

    [15]Madej RM,Davis J,Holden MJ,et al.International standards and reference materials for quantitative molec?ular infectious disease testing[J].The Journal of Molec?ular Diagnostics,2010,12(2):133?143.

    [16]Mukaide M,Sugiyama M,Korenaga M,et al.High?throughput and sensitive next?generation droplet digital PCR assay for the quantitation of the hepatitis C virus mutation at core amino acid 70[J].Journal of Virologi?cal Methods,2014,207:169?177.

    [17]Dingle TC,Ruth HS,Linda C,et al.Tolerance of droplet?digital PCR vs real?time quantitative PCR to in?hibitory substances[J].Clinical Chemistry,2013,59(11):1670?1672.

    [18]Reid AL,F(xiàn)reeman JB,Millward M,et al.Detection of BRAF?V600E and V600K in melanoma circulating tumour cells by droplet digital PCR[J].Clinical Bio?chemistry,2014,48(15):999?1002.

    [19]Vogelstein B,Kinzler KW.Digital PCR[J].Proceed?ings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1999,96(16):9236?9241.

    [20]徐鵬,韓琳,陳婉瑩,等.我國(guó)艾滋病醫(yī)療保障制度的現(xiàn)狀與變革[J].衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)研究,2015(12):40?43.

    [21]Deborah P,Hannah G,Carrie Z,et al.Absence of de?tectable HIV?1 viremia after treatment cessation in an infant[J].New England Journal of Medicine,2013,369(19):1828?1835.

    [22]Matthew CS,Steven ML,Tiffany L,et al.Highly pre?cise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR[J].Plos One,2013,8(4):e55943.

    [23]Henrich TJ,Gallien S,Li JZ,et al.Low?level detec?tion and quantitation of cellular HIV?1 DNA and 2?LTR circles using droplet digital PCR[J].Journal of Vi?rological Methods,2012,186(1):68?72.

    [24]Kiselinova M,Pasternak AO,De Spiegelaere WD,et al.Comparison of droplet digital PCR and seminested real?time PCR for quantification of cell?associated HIV?1 RNA[J].Plos One,2014,9(1):e85999.

    [25]Dienstag JL.Hepatitis B virus infection[J].New Eng?land Journal of Medicine,2008,359(14):1486?1500.

    [26]Don G,Prince AM.Hepatitis B virus infection?natural history and clinical consequences[J].New England Journal of Medicine,2004,350(11):1118?1129.

    [27]Huang JT,Liu YJ,Wang J,et al.Next generation digi?tal PCR measurement of hepatitis B virus copy number in formalin?fixed paraffin?embedded hepatocellular car?cinoma tissue[J].Clinical Chemistry,2015,61(1):290?296.

    [28]Mu D,Yan L,Tang H,et al.A sensitive and accurate quantification method for the detection of hepatitis B vi?rus covalently closed circular DNA by the application of a droplet digital polymerase chain reaction amplifica?tion system[J].Biotechnology Letters,2015,37(10):2063?2073.

    [29]Murphy EL.The increasing burden of mortality from vi?ral hepatitis in the united states between 1999 and 2007[J].Annals of Internal Medicine,2012,156(4):271?278.

    [30]王劍,金茜,饒慧瑛,等.國(guó)產(chǎn)試劑與Roche COBAS TaqMan試劑對(duì)慢性丙型肝炎快速和早期病毒學(xué)應(yīng)答的比較研究[J].傳染病信息,2012,25(3):177?179.

    [31]Wei F,Guo X,Yin J,et al.Performance of picodrop?let digital PCR for quantitative detection of HCV RNA[J].Journal of Clinical Virology,2015,69:226?227.

    [32]Ryan KJ,Ray CG,Sherris JC.Sherris medical micro?biology:an introduction to infectious diseases[M].Mc?Graw?Hill,2004.

    [33]Hayden R,Gu Z,Ingersoll J,et al.Comparison of droplet digital PCR to real?time PCR for quantitative de?tection of cytomegalovirus[J].Journal of Clinical Mi?crobiology,2013,51(2):540?546.

    [34]Ruth HS,Linda C,Anqi C,et al.Clinical utility of droplet digital PCR for human cytomegalovirus[J]. Journal of Clinical Microbiology,2014,52(8):2844?2848.

    [35]Whitley RJ.Herpes simplex virus infections of the cen?tral nervous system[J].American Journal of Medicine,2015,85(14):61?67.

    [36]Azizi A,Aidoo F,Gisonni?Lex L,et al.Determina?tion of HSV?1 UL5 and UL29 gene copy numbers in an HSV complementing Vero cell line[J].Journal of bio?technology,2013,168(4):382?387.

    The applications of digital PCR on the researches of several common human infections

    JIANG Xiwen★,ZHU Xiaoya,GAO Xiujie,ZHOU Qiwei
    (DaAn Gene CO.,Ltd.of SunYat?sen University,Guangzhou,Guangdong,China,510665)

    Polymerase chain reaction(PCR)is the foundation of molecular biology and the core technology for virus nucleic acid detection of human infectious,which can be used for qualitative and quantitative analysis of nucleic acid.Digital PCR is a new technology to quantify nucleic acid,with so many attractive advantages such as high accuracy,precision,and so on.It could give the copy numbers of the sample target fragment directly.Digital PCR is a simpler and more practical method for quantitative analysis of nucleic acid than traditional qPCR.The new technology broke through the limitations of traditional qPCR,working without standard curve.In this paper,the researches of digital PCR on nucleic acid detection of human infectious diseases in recent years are reviewed briefly.

    Quantitative real?time PCR(dPCR);Virus;Nucleic acid

    中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司,廣東,廣州510665

    ★通訊作者:蔣析文,E?mail:yuanyecat@vip.sina.com

    注:蔣析文,朱小亞和高秀潔為并列第一作者

    猜你喜歡
    拷貝數(shù)載量精密度
    線粒體DNA拷貝數(shù)變異機(jī)制及疾病預(yù)測(cè)價(jià)值分析
    病毒載量檢測(cè)在102例HIV抗體不確定樣本診斷中的應(yīng)用
    陳建杰教授治療低病毒載量慢性乙型肝炎經(jīng)驗(yàn)總結(jié)
    Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate dependent Rac exchange factor 1 is a diagnostic and prognostic biomarker for hepatocellular carcinoma
    副波長(zhǎng)對(duì)免疫比濁法檢測(cè)尿微量清蛋白精密度的影響
    胎兒染色體組拷貝數(shù)變異與產(chǎn)前超聲異常的相關(guān)性分析
    海水U、Th長(zhǎng)壽命核素的高精密度MC-ICP-MS測(cè)定方法
    DNA序列拷貝數(shù)變化決定黃瓜性別
    乙肝患者HBV載量與IgA,IgG,IgM及C3,C4相關(guān)性研究
    2014年全國(guó)452家實(shí)驗(yàn)室全血銅、鋅、鈣、鎂、鐵檢驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不精密度分析
    精品一区二区三区视频在线观看免费| 99久久综合精品五月天人人| 叶爱在线成人免费视频播放| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 老司机在亚洲福利影院| 免费看日本二区| 国产成人av教育| 久久天堂一区二区三区四区| 精华霜和精华液先用哪个| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 欧美一级a爱片免费观看看 | 啦啦啦观看免费观看视频高清| 精品人妻1区二区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 女同久久另类99精品国产91| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 在线观看免费午夜福利视频| 在线看三级毛片| 18禁美女被吸乳视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 51午夜福利影视在线观看| videosex国产| 日本精品一区二区三区蜜桃| 美女午夜性视频免费| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲av成人精品一区久久| 成人欧美大片| 国产成人aa在线观看| 国产视频内射| e午夜精品久久久久久久| 国产片内射在线| 久久这里只有精品19| av超薄肉色丝袜交足视频| 成人av在线播放网站| 国产欧美日韩一区二区精品| 午夜精品在线福利| 日本a在线网址| 男女视频在线观看网站免费 | 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 在线a可以看的网站| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美一级a爱片免费观看看 | 香蕉av资源在线| 日本成人三级电影网站| 欧美高清成人免费视频www| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲午夜理论影院| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 日韩国内少妇激情av| 熟女电影av网| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲精品在线观看二区| 国产高清激情床上av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 日本免费一区二区三区高清不卡| 美女午夜性视频免费| 精品电影一区二区在线| 亚洲 国产 在线| 日本五十路高清| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 一区二区三区国产精品乱码| 国产黄片美女视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久伊人香网站| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产97色在线日韩免费| 国产高清videossex| 最近在线观看免费完整版| 精品无人区乱码1区二区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 香蕉国产在线看| 成人三级做爰电影| 男男h啪啪无遮挡| 国产免费男女视频| 91九色精品人成在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 精品第一国产精品| 天天一区二区日本电影三级| 全区人妻精品视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲精品在线美女| 国产成人系列免费观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 丰满的人妻完整版| 99国产综合亚洲精品| 亚洲av成人av| 日本 欧美在线| 制服诱惑二区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 最近在线观看免费完整版| 无人区码免费观看不卡| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 欧美成狂野欧美在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 国产单亲对白刺激| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产激情欧美一区二区| 中文资源天堂在线| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 手机成人av网站| 黄色丝袜av网址大全| 一本大道久久a久久精品| 免费一级毛片在线播放高清视频| 成人永久免费在线观看视频| 婷婷亚洲欧美| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 麻豆久久精品国产亚洲av| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美中文综合在线视频| 麻豆国产av国片精品| √禁漫天堂资源中文www| 国产精品电影一区二区三区| 黄色a级毛片大全视频| 婷婷亚洲欧美| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产av不卡久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 99精品欧美一区二区三区四区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 天天添夜夜摸| 精品免费久久久久久久清纯| 久久久久国内视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 欧美另类亚洲清纯唯美| 成人欧美大片| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产精品久久久久久久电影 | 最近在线观看免费完整版| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美日本视频| 在线观看66精品国产| 精品第一国产精品| 国产精品免费视频内射| 国产1区2区3区精品| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 悠悠久久av| 午夜免费成人在线视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 九色成人免费人妻av| 一个人免费在线观看电影 | 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久中文字幕一级| 日本一区二区免费在线视频| 婷婷丁香在线五月| 成人欧美大片| 一级毛片高清免费大全| 国产精品99久久99久久久不卡| 我的老师免费观看完整版| 在线视频色国产色| 90打野战视频偷拍视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲免费av在线视频| 脱女人内裤的视频| 岛国在线观看网站| 日韩欧美在线二视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久人妻av系列| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美中文日本在线观看视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 一级毛片高清免费大全| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲专区中文字幕在线| 国产成年人精品一区二区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久久久久大精品| 哪里可以看免费的av片| 日韩av在线大香蕉| 中出人妻视频一区二区| 久久久久久久久免费视频了| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 男女下面进入的视频免费午夜| av天堂在线播放| 亚洲九九香蕉| 国产精品九九99| 狠狠狠狠99中文字幕| 色综合站精品国产| 一级作爱视频免费观看| x7x7x7水蜜桃| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲欧美日韩东京热| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲熟女毛片儿| www日本黄色视频网| 国产伦人伦偷精品视频| 国产区一区二久久| 少妇的丰满在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产亚洲精品久久久久久毛片| www日本在线高清视频| 精品电影一区二区在线| 久久精品综合一区二区三区| 欧美久久黑人一区二区| 日韩欧美在线乱码| 午夜福利高清视频| 美女午夜性视频免费| www.999成人在线观看| 香蕉国产在线看| 国产单亲对白刺激| √禁漫天堂资源中文www| 777久久人妻少妇嫩草av网站| av欧美777| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品 国内视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 91麻豆av在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 一级a爱片免费观看的视频| 999久久久精品免费观看国产| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 日韩欧美精品v在线| 日韩三级视频一区二区三区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 香蕉国产在线看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 成人一区二区视频在线观看| 99热这里只有精品一区 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 成人一区二区视频在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 午夜福利免费观看在线| 国内精品久久久久久久电影| 日本在线视频免费播放| 动漫黄色视频在线观看| 不卡av一区二区三区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产精品九九99| 精品无人区乱码1区二区| 91国产中文字幕| 看免费av毛片| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| www日本黄色视频网| or卡值多少钱| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久久久久久久免费视频了| 淫妇啪啪啪对白视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 99国产综合亚洲精品| 后天国语完整版免费观看| 国产精品电影一区二区三区| 伦理电影免费视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美3d第一页| 91麻豆av在线| 国产亚洲av高清不卡| 国产av不卡久久| 午夜福利免费观看在线| 最新在线观看一区二区三区| 超碰成人久久| 一区二区三区激情视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 91av网站免费观看| svipshipincom国产片| 亚洲av成人精品一区久久| 18禁观看日本| 久久中文看片网| 久99久视频精品免费| 精品久久久久久久久久久久久| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久这里只有精品中国| 九色成人免费人妻av| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 久久久国产欧美日韩av| 国产成人精品无人区| svipshipincom国产片| 国产亚洲av高清不卡| 久久中文看片网| 美女 人体艺术 gogo| 不卡av一区二区三区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产人伦9x9x在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美av亚洲av综合av国产av| 麻豆av在线久日| 久9热在线精品视频| 丁香六月欧美| 国产1区2区3区精品| 亚洲 国产 在线| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久久国产成人精品二区| 韩国av一区二区三区四区| 一区二区三区高清视频在线| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 成人手机av| 在线国产一区二区在线| 亚洲成人久久性| 一本综合久久免费| 亚洲美女视频黄频| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美极品一区二区三区四区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 全区人妻精品视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 又爽又黄无遮挡网站| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲美女视频黄频| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲专区字幕在线| 少妇粗大呻吟视频| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲av熟女| 中文字幕久久专区| 国产精品国产高清国产av| 国产免费av片在线观看野外av| 夜夜爽天天搞| 精品第一国产精品| 色哟哟哟哟哟哟| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 精品欧美一区二区三区在线| 99国产精品一区二区三区| 久久久久久久久久黄片| 亚洲人成电影免费在线| 窝窝影院91人妻| netflix在线观看网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲男人天堂网一区| 1024香蕉在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 免费在线观看日本一区| 国产一区在线观看成人免费| 麻豆国产97在线/欧美 | 亚洲中文日韩欧美视频| www日本黄色视频网| 91国产中文字幕| 欧美一级a爱片免费观看看 | 夜夜爽天天搞| 日日夜夜操网爽| 午夜免费成人在线视频| 日韩高清综合在线| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲成人久久性| 欧美日韩黄片免| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产熟女xx| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 九色国产91popny在线| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 欧美性猛交黑人性爽| 香蕉av资源在线| aaaaa片日本免费| 国产亚洲av高清不卡| 长腿黑丝高跟| 亚洲精品国产一区二区精华液| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 久久久久久久久久黄片| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品日韩av在线免费观看| 1024手机看黄色片| 色老头精品视频在线观看| 精品国产亚洲在线| 国产高清有码在线观看视频 | 久久婷婷成人综合色麻豆| av视频在线观看入口| 欧美一级a爱片免费观看看 | 免费在线观看成人毛片| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲国产看品久久| 国产av又大| 老司机在亚洲福利影院| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产麻豆成人av免费视频| 中文字幕高清在线视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 无人区码免费观看不卡| av免费在线观看网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 在线永久观看黄色视频| 一本久久中文字幕| 久久草成人影院| 男人舔女人的私密视频| 日韩大码丰满熟妇| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 最好的美女福利视频网| 两性夫妻黄色片| 757午夜福利合集在线观看| 九色成人免费人妻av| www.www免费av| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久精品91蜜桃| 久久亚洲真实| 久久久久免费精品人妻一区二区| 欧美黑人欧美精品刺激| АⅤ资源中文在线天堂| 高清在线国产一区| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久精品91蜜桃| 哪里可以看免费的av片| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 村上凉子中文字幕在线| 麻豆成人午夜福利视频| 午夜激情av网站| 一个人免费在线观看的高清视频| 91大片在线观看| 在线观看一区二区三区| 国产日本99.免费观看| 又紧又爽又黄一区二区| 两个人视频免费观看高清| 国产精品野战在线观看| 亚洲,欧美精品.| www国产在线视频色| 国产亚洲av高清不卡| 欧美在线一区亚洲| 久久久精品大字幕| 色综合亚洲欧美另类图片| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲专区中文字幕在线| 禁无遮挡网站| 黄色成人免费大全| 婷婷六月久久综合丁香| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 999精品在线视频| 久久久久国内视频| 成人欧美大片| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美中文综合在线视频| 少妇粗大呻吟视频| 国产精华一区二区三区| 亚洲av五月六月丁香网| 日韩中文字幕欧美一区二区| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲激情在线av| bbb黄色大片| av福利片在线观看| а√天堂www在线а√下载| 亚洲av成人一区二区三| 美女大奶头视频| 99热6这里只有精品| 国产单亲对白刺激| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲电影在线观看av| 在线观看www视频免费| 国产精品一及| 日本三级黄在线观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产精华一区二区三区| 可以在线观看的亚洲视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 在线观看免费午夜福利视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久久久久久久免费视频了| 国产精品免费一区二区三区在线| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲成人久久性| 久久午夜亚洲精品久久| 在线观看免费视频日本深夜| 熟女电影av网| 在线观看午夜福利视频| av免费在线观看网站| 久久香蕉精品热| 99riav亚洲国产免费| 一区二区三区国产精品乱码| 国产午夜精品久久久久久| 午夜激情福利司机影院| 日韩欧美 国产精品| 久久香蕉激情| 国产视频一区二区在线看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 精品国产乱子伦一区二区三区| 在线免费观看的www视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 妹子高潮喷水视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产精品久久久久久久电影 | 国产99白浆流出| 亚洲七黄色美女视频| 香蕉久久夜色| 国产精品精品国产色婷婷| 中文字幕高清在线视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 少妇的丰满在线观看| 18禁观看日本| 美女 人体艺术 gogo| 精品福利观看| 久久精品综合一区二区三区| 波多野结衣巨乳人妻| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久热在线av| 麻豆成人av在线观看| 精品久久久久久久末码| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产亚洲精品久久久久5区| 99热这里只有是精品50| 五月玫瑰六月丁香| 精品久久蜜臀av无| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 91麻豆av在线| 一区福利在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 不卡一级毛片| 久久精品影院6| 怎么达到女性高潮| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 丁香六月欧美| 久久精品影院6| 看片在线看免费视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 窝窝影院91人妻| 久久久国产精品麻豆| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产成人系列免费观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产熟女午夜一区二区三区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久国产精品麻豆| 亚洲中文日韩欧美视频| 90打野战视频偷拍视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 极品教师在线免费播放| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美黑人精品巨大| www.熟女人妻精品国产| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 91av网站免费观看| 曰老女人黄片| 这个男人来自地球电影免费观看| 中出人妻视频一区二区| 久久这里只有精品中国| 欧美极品一区二区三区四区| 国产主播在线观看一区二区| 一进一出抽搐动态| 亚洲 国产 在线| 欧美黄色淫秽网站| 在线观看一区二区三区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 免费一级毛片在线播放高清视频| 嫩草影院精品99| 亚洲国产精品合色在线| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产精品 欧美亚洲| 91麻豆精品激情在线观看国产| 看免费av毛片| 亚洲无线在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产真人三级小视频在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 久久人人精品亚洲av| 亚洲国产中文字幕在线视频| 999精品在线视频| aaaaa片日本免费| 国产三级中文精品| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 全区人妻精品视频| 久99久视频精品免费| 神马国产精品三级电影在线观看 | 麻豆成人av在线观看| 1024手机看黄色片| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美大码av| videosex国产| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产91精品成人一区二区三区| 一级毛片精品| 日韩欧美免费精品| 天天一区二区日本电影三级| 听说在线观看完整版免费高清| 黑人操中国人逼视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 在线观看www视频免费| 十八禁人妻一区二区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 99热6这里只有精品| 午夜福利高清视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 免费av毛片视频| 观看免费一级毛片| 国产三级黄色录像| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久中文字幕一级| 黄色成人免费大全| 长腿黑丝高跟| 国产成人精品久久二区二区免费| av视频在线观看入口| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 免费在线观看成人毛片| 亚洲美女视频黄频| 可以在线观看毛片的网站| 精品乱码久久久久久99久播| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 99国产精品一区二区蜜桃av| av免费在线观看网站| 一级片免费观看大全|