數(shù)字PCR在幾種常見人類傳染病研究中的應(yīng)用

蔣析文朱小亞 高秀潔 周其偉

·綜述·

數(shù)字PCR在幾種常見人類傳染病研究中的應(yīng)用

蔣析文★朱小亞 高秀潔 周其偉

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechain reaction，PCR）是現(xiàn)代分子生物學(xué)的基礎(chǔ)，被廣泛應(yīng)用于核酸的定性及定量分析，是人類傳染病病毒核酸分析的核心技術(shù)。數(shù)字PCR（digital polymerase chain reaction，dPCR）作為一種新興的核酸定量分析技術(shù)，具有高精確度、高精密度等優(yōu)點(diǎn)。它打破了傳統(tǒng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real?time PCR，qPCR）技術(shù)的局限，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接檢測(cè)樣本中靶片段的拷貝數(shù)，是一種更為簡(jiǎn)單且實(shí)用的核酸絕對(duì)定量分析技術(shù)。本文就近幾年該技術(shù)在人類傳染病病毒核酸定量分析方面的研究進(jìn)行概述。

數(shù)字PCR（dPCR）；病毒；核酸

數(shù)字PCR（digital polymerase chain reaction，dPCR）誕生于上個(gè)世紀(jì)90年代末，該技術(shù)將反應(yīng)體系分散到許多獨(dú)立的反應(yīng)單元，使得每個(gè)反應(yīng)單元中只包含1分子的靶片段或者不包含靶片段，經(jīng)熱循環(huán)反應(yīng)，直接或通過泊松分布分析陽(yáng)性反應(yīng)單元的數(shù)目，計(jì)算樣本中靶片段的起始拷貝數(shù)。該技術(shù)使用與實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantita?tive real?time PCR，qPCR）相同的引物以及探針，無需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線且不依賴于Ct值，對(duì)樣品中靶片段進(jìn)行絕對(duì)定量，已廣泛用于基因差異表達(dá)、下一代測(cè)序、微生物檢測(cè)及臨床診斷等領(lǐng)域［1?6］。

病毒載量是病毒感染診斷和治療的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，一方面用于評(píng)價(jià)高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的療效，另一方面用于篩查血清學(xué)檢驗(yàn)中由窗口期造成的漏檢［7?8］。qPCR被廣泛應(yīng)用于病毒載量的分析，該方法雖然簡(jiǎn)易、快速且成本較低，但在靶片段含量較低或抑制物存在等情況下精密度和靈敏度低，且依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值［9］。核酸檢測(cè)方法的精密度對(duì)于傳染病的的診斷治療極為重要，即使病毒載量處于低拷貝水平，其少量增加也具有重要臨床意義。據(jù)研究報(bào)道，當(dāng)人類巨細(xì)胞病毒感染者體內(nèi)該病毒的載量從低于200 copies/mL增加到高于200 copies/mL時(shí)會(huì)表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，而qPCR由于精密度不夠高，無法檢測(cè)出這一變化［10?13］。dPCR作為一種新型的核酸分子定量檢測(cè)技術(shù)，具有高精密度的特點(diǎn)，完全可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)qPCR在精密度方面的缺陷［14?16］。臨床樣本如血液、糞便、石蠟包埋樣本等通常比較復(fù)雜，常含有大量的PCR抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)dPCR具有對(duì)抑制物的耐受能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，其擴(kuò)增效率受抑制物影響小，更適合用于檢測(cè)復(fù)雜的臨床樣本如糞便、組織樣品等［17］。此外一些研究表明dPCR還具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，在檢測(cè)稀有突變時(shí)靈敏度達(dá)0.005％，約為qPCR的200倍［18］。因此，該技術(shù)逐漸被用于病毒載量分析相關(guān)研究，本文就近幾年dPCR在幾種常見傳染病研究上的應(yīng)用進(jìn)行介紹，以期為該技術(shù)的發(fā)展及在傳染病方面的應(yīng)用提供參考。

1 dPCR平臺(tái)簡(jiǎn)介

數(shù)字PCR的概念于上個(gè)世紀(jì)末由Vogelstein等［19］提出，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景，已飛速地商業(yè)化發(fā)展。目前基于數(shù)字PCR技術(shù)的商業(yè)化平臺(tái)主要有2種，一種是芯片式的dPCR（chip digital PCR，cdPCR），該平臺(tái)以美國(guó)FluidigmBioMarkTMHD和Life Technologies QuantStudioTM3D系統(tǒng)為代表，采用微流控技術(shù)將混合均勻的PCR反應(yīng)體系分成若干個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)單元，并將這些反應(yīng)單元傳送至芯片反應(yīng)室中進(jìn)行PCR反應(yīng)，利用類似基因芯片方法分析每個(gè)反應(yīng)室的熒光信號(hào)，計(jì)算靶片段的數(shù)目。另一種是由美國(guó)Bio?Rad和RainDance先后引進(jìn)的一個(gè)微滴式dPCR系統(tǒng)（droplet digital PCR，ddP?CR），該平臺(tái)將反應(yīng)液均勻地分散到許多由乳液包裹的微型液滴中（Bio?Rad QX200為2萬個(gè)，RainDance為100～1 000萬個(gè)），每個(gè)液滴都是一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)單元，通過分析帶有熒光信號(hào)的液滴數(shù)，計(jì)算熒光信號(hào)的液滴與總液滴的比例，最終計(jì)算出靶片段的拷貝數(shù)，這種系統(tǒng)與cdPCR相比，原理和操作都更為簡(jiǎn)單，也更為經(jīng)濟(jì)，目前已得到廣泛的應(yīng)用。

2 dPCR在幾種常見傳染病中的應(yīng)用

2.1 dPCR在人類免疫缺陷病毒（human immuno?deficiency virus，HIV）分析中的研究應(yīng)用

自1981年獲得性免疫缺乏綜合征（acquired im? mune deficiency syndrome，AIDS）被發(fā)現(xiàn)以來，全球已經(jīng)有2 000多萬人死于此病，我國(guó)于1985年發(fā)現(xiàn)了首例HIV感染者，至2014年底累計(jì)報(bào)告的病例有49.7萬例，其中接受治療的患者約有34.4萬［20］。對(duì)于AIDS的治療，目前公認(rèn)的效果最好的方法為高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（highly active anti?retroviral therapy，HAART），該方法使AIDS從致死性傳染病轉(zhuǎn)變成一種可以被治療的慢性疾病。2013年，Deb?orah等［21］報(bào)道了首例被功能性治愈的HIV感染案例，這名被治愈的HIV感染者是一個(gè)剛出生的嬰兒，在出生30 h后被確診感染了該病毒，在經(jīng)過18個(gè)月的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)HIV DNA和HIV RNA的拷貝數(shù)及HIV特異性抗體低于檢測(cè)限，最后利用ddPCR技術(shù)確認(rèn)該嬰兒被功能性治愈。病毒載量是評(píng)價(jià)HAART療效的重要指標(biāo)之一，HIV DNA被廣泛地用于衡量患者HIV病毒儲(chǔ)存庫(kù)的狀態(tài)，而2?LTR（HIV前病毒核酸在宿主細(xì)胞中存在的一種形式）常反映患者HIV病毒動(dòng)力學(xué)特征。據(jù)報(bào)道，ddPCR在分析HIV DNA和2?LTR拷貝數(shù)時(shí)均具有較高精密度，檢測(cè)HIV DNA的精密度為qPCR的5倍，檢測(cè)2?LTR的精密度更高，為qPCR的20倍［22］。但也有研究指出ddPCR檢測(cè)低水平2?LTR（HIV前病毒核酸在宿主細(xì)胞中存在的一種形式）時(shí)變異度較大［23］，由于該研究檢測(cè)的樣本數(shù)較少，并沒能解釋其變異度大的原因。由此可見，ddPCR確實(shí)具有精密度高的優(yōu)點(diǎn)，但在檢測(cè)低水平核酸時(shí)，其檢測(cè)性能還需進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證。細(xì)胞關(guān)聯(lián)的HIV?1 RNA（CA HIV?1 RNA）被認(rèn)為是評(píng)估病毒量及抗逆病毒療效的一個(gè)潛在的標(biāo)志。Kiselinova等［24］對(duì)44個(gè)HIV患者的外周單核細(xì)胞樣本中的CA HIV?1 RNA拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ddPCR在檢測(cè)過程中容易產(chǎn)生假陽(yáng)性，進(jìn)而導(dǎo)致其線性關(guān)系、精確度和敏感性等方面不及半巢式定量PCR。導(dǎo)致PCR出現(xiàn)假陽(yáng)性原因有很多，如樣品間的交叉污染、氣溶膠污染等，dPCR靈敏度較高，即使反應(yīng)體系中存在極少量的污染也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性，因此使用dPCR時(shí)應(yīng)更加規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，以避免假陽(yáng)性的產(chǎn)生。

2.2 dPCR在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）核酸檢測(cè)中的應(yīng)用

HBV呈世界性流行，全世界各地區(qū)均有不同程度的HBV感染。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）報(bào)道，全球曾經(jīng)感染過HBV的人約有20億，每年大約有100萬人死于HBV引起的肝硬化、肝衰竭及原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）等急性和慢性肝病［25?26］。Huang等［27］通過ddPCR技術(shù)分析感染HBV的HCC患者石蠟包埋的肝臟組織中HBV DNA拷貝數(shù)與腫瘤轉(zhuǎn)移、肝癌疾病歷程及血清中甲胎蛋白（α?fetoprotein，AFP）含量變化的相關(guān)性，同時(shí)對(duì)該技術(shù)的檢測(cè)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明HBV感染是誘導(dǎo)HCC發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵因子，ddPCR靈敏度高且特異性強(qiáng)。qPCR為HBV DNA含量分析的常用方法，但用于檢測(cè)復(fù)雜的臨床樣本時(shí)，如石蠟包埋的組織樣本，常因量化循環(huán)數(shù)接近PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)而難以精確定量，ddPCR技術(shù)在檢測(cè)中不依賴于Ct值，不受量化循環(huán)數(shù)的影響，因而更適合用于檢測(cè)復(fù)雜的臨床樣本。cccD?NA是HBV病毒在侵入人體肝細(xì)胞后，其部分雙鏈環(huán)狀的DNA分子以負(fù)鏈為模板延長(zhǎng)修補(bǔ)正鏈的缺口形成的完整共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子。它在細(xì)胞中作為HBV病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的模板，在病毒持續(xù)感染、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后病毒再活化及病毒耐藥性方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)ddPCR在檢測(cè)細(xì)胞中cccDNA方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。對(duì)HepG2.215細(xì)胞DNA中cccDNA含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在cccD?NA含量較低時(shí)qPCR精密度急劇下降，且qPCR檢測(cè)的靈敏度較低，最低檢出限為10 ng/μL，而ddP?CR的最低檢出限為1 ng/μL［28］。

2.3 dPCR在檢測(cè)丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）研究中的應(yīng)用

HCV是一種單鏈RNA病毒，其基因極易發(fā)生變異，可分為6個(gè)基因型及多個(gè)亞型。HCV感染性極強(qiáng)，在全球普遍流行，據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)分析，全球大約有1.85億人感染該病毒，每年約有35萬人死于丙型肝炎及其并發(fā)癥［29］。持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答（sus?tained virological response，SVR）是評(píng)價(jià)丙型肝炎治療藥物療效的重要指標(biāo)，而快速病毒學(xué)應(yīng)答（rapid virological response，RVR）和早期病毒學(xué)應(yīng)答（ear?ly virological response，EVR）的精確判定對(duì)SVR的預(yù)測(cè)尤為重要，因此高靈敏度的HCV載量檢測(cè)方法對(duì)輔助HCV的治療極為關(guān)鍵。目前我國(guó)已有批準(zhǔn)生產(chǎn)的HCV RNA定量檢測(cè)試劑盒，但靈敏度較低，與我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局制定的標(biāo)準(zhǔn)（最低檢出限＜50 IU/mL）相差甚遠(yuǎn)［30］，根本不能滿足臨床的需求。Roche TaqMan HCV檢測(cè)試劑盒在國(guó)際上被公認(rèn)為是HCV RNA定量檢測(cè)性能較好的試劑盒之一，其靈敏度較高，檢測(cè)下限為15 IU/mL。比較分析dPCR和Roche TaqMan檢測(cè)HCV RNA的性能，發(fā)現(xiàn)dPCR在其可檢測(cè)的范圍內(nèi)保持良好線性關(guān)系和精密度，但在檢測(cè)低水平HCV RNA時(shí)，與Roche TaqMan HCV存在較大差異，在18個(gè)HCV RNA水平低于15 IU/mL的樣本中，dPCR檢測(cè)出22.2％的樣本中HCV RNA高于15 IU/mL［31］。目前，dPCR在HCV病毒載量檢測(cè)方面的研究報(bào)道相對(duì)較少，還未見有研究對(duì)該技術(shù)檢測(cè)HCV載量的靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)。HCV基因組容易發(fā)生突變，其編碼的核心氨基酸區(qū)發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致肝病的惡化，是演變?yōu)镠CC的重要因素。ddPCR檢測(cè)突變靈敏度較高，Mukaide等［16］采用ddPCR的方法對(duì)HCV編碼的核心氨基酸區(qū)的突變進(jìn)行了分析，同時(shí)也將該方法與TaqMan HCV檢測(cè)方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)ddPCR在2.5～105拷貝數(shù)的檢測(cè)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好且靈敏度較高，最低檢出限達(dá)0.005％，該結(jié)果預(yù)示著ddPCR在定量分析基因突變方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，有望作為新一代基因突變定量分析工具應(yīng)用于病毒基因組多態(tài)性分析領(lǐng)域。

2.4 dPCR在其他傳染病方面的應(yīng)用

人類巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HC?MV）為皰疹病毒科（herpesviruses）雙螺旋DNA病毒，因其感染細(xì)胞后，導(dǎo)致細(xì)胞腫大而且細(xì)胞核內(nèi)具有巨大的包涵體，所以被稱為巨細(xì)胞病毒。該病毒在我國(guó)廣泛流行，研究表明，當(dāng)機(jī)體處于免疫缺陷或免疫系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)時(shí)極易感染HC?MV，如胎兒、新生兒及孕婦等，除此之外，接受器官或骨髓移植的患者也極易感染此病毒［32］。目前，基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)HCMV DNA的試劑盒已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)，但其檢測(cè)的靈敏度和精密度有時(shí)并不能滿足臨床的實(shí)際需求。采用qPCR和ddPCR對(duì)50個(gè)HCMV血漿樣本、梯度稀釋的HCMV標(biāo)準(zhǔn)品（WHO/NIST）進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)dPCR檢測(cè)HCMV的精密度較好，但其靈敏度卻不及qPCR，還需進(jìn)一步的優(yōu)化才能更好的用于HCMV DNA定量分析［33］。另一項(xiàng)研究也利用qPCR和ddPCR技術(shù)分析了HCMV血漿樣本［34］，但該研究發(fā)現(xiàn)ddPCR靈敏度與qPCR并無差異，且其精密度顯著高于qPCR。這2項(xiàng)研究表明，ddPCR在檢測(cè)HCMV時(shí)精密度確實(shí)較好，但其靈敏度卻沒有表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，還需要進(jìn)一步的優(yōu)化，以提高其靈敏度。單純皰疹病毒（her?pes simplex virus，HSV）是一種雙鏈線性DNA病毒，具有囊膜結(jié)構(gòu)，它能引起人類皮膚性疾病。人類是HSV病毒的唯一宿主，它主要通過感染人類面部和生殖器部位的皮膚和黏膜，引起口角膜炎、唇皰疹、口腔黏膜炎、生殖器皰疹等疾病，HSV感染還與多種疾病關(guān)系密切，如流產(chǎn)、胎兒畸形、宮頸癌及阿爾茨海默癥等［35］。Azizi等［36］利用dPCR的方法通過檢測(cè)HSV?1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系A(chǔ)V529?19中HSV編碼區(qū)UL5和UL29的的拷貝數(shù)評(píng)價(jià)HSV?1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系A(chǔ)V529?19的穩(wěn)定性，同時(shí)對(duì)dP?CR的檢測(cè)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明dPCR的穩(wěn)定性、精確度以及精密度良好。dPCR在傳染病方面的應(yīng)用起步較晚，目前僅在幾種常見傳染病領(lǐng)域的研究中有所應(yīng)用。盡管如此，dPCR已表現(xiàn)出其顯著的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，隨著該技術(shù)的不斷創(chuàng)新與發(fā)展，在傳染病領(lǐng)域的應(yīng)用前景將會(huì)越來越廣闊。

3 展望

傳染病病毒載量的檢測(cè)對(duì)于傳染病的早期診斷、治療效果評(píng)價(jià)、病情預(yù)測(cè)及監(jiān)測(cè)極為重要。而檢測(cè)方法的靈敏度、精密度和變異度等對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響不容忽視，高性能的檢測(cè)方法有助于對(duì)人類傳染病的預(yù)測(cè)及監(jiān)管，以縮短檢測(cè)的窗口期并及時(shí)的予以治療。數(shù)字PCR不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控品，直接對(duì)核酸進(jìn)行絕對(duì)定量，該技術(shù)目前已經(jīng)逐步的被用于多個(gè)領(lǐng)域的研究，且表現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)，大量的研究發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)qPCR相比，dPCR在檢測(cè)稀有突變、拷貝數(shù)變異及腫瘤相關(guān)的mi?RNA定量分析方面性能顯著提高。dPCR技術(shù)發(fā)展十分迅速，第一款數(shù)字PCR由Fluidigm公司于2006年推出，可同時(shí)檢測(cè)3.7萬個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)。隨后，QuantaLife推出了微滴數(shù)字PCR，被Bio?Rad收購(gòu)并推出新一代的微滴數(shù)字PCR QX100可生成2萬個(gè)液滴進(jìn)行高通量分析。而Rain Dance Technology于2012年推出的RainDrop?系統(tǒng)通量更大，可生成100萬個(gè)皮升級(jí)液滴。目前這3種dPCR產(chǎn)品中，Bio?RadQX100應(yīng)用較為普遍，主要運(yùn)用于科學(xué)研究領(lǐng)域，且已有的研究報(bào)道也暴露該技術(shù)還存在一些缺陷，就傳染病方面主要包括線性范圍比較局限、檢測(cè)過程中容易產(chǎn)生假陽(yáng)性、靈敏度也沒有顯著的優(yōu)勢(shì)等。盡管如此，dPCR憑借其現(xiàn)有的優(yōu)勢(shì)，已逐步的被運(yùn)用于臨床疾病的診斷，去年我國(guó)將該技術(shù)列入腫瘤個(gè)體化治療檢測(cè)技術(shù)之一，今年Bio?Rad公司推出的微滴式數(shù)字PCR技術(shù)的第二代產(chǎn)品QX200成功獲得歐盟體外診斷產(chǎn)品CE認(rèn)證，這將極大地促進(jìn)該技術(shù)在臨床上的應(yīng)用。隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，相信在不久的將來該技術(shù)的缺陷得以彌補(bǔ)，并在感染性疾病診斷、疾病超早期診斷、產(chǎn)前診斷及腫瘤早期診斷等領(lǐng)域發(fā)揮不可或缺的作用，成為新一代分子診斷的標(biāo)準(zhǔn)工具。

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The applications of digital PCR on the researches of several common human infections

JIANG Xiwen★,ZHU Xiaoya,GAO Xiujie,ZHOU Qiwei
(DaAn Gene CO.,Ltd.of SunYat?sen University,Guangzhou,Guangdong,China,510665)

Polymerase chain reaction(PCR)is the foundation of molecular biology and the core technology for virus nucleic acid detection of human infectious,which can be used for qualitative and quantitative analysis of nucleic acid.Digital PCR is a new technology to quantify nucleic acid,with so many attractive advantages such as high accuracy,precision,and so on.It could give the copy numbers of the sample target fragment directly.Digital PCR is a simpler and more practical method for quantitative analysis of nucleic acid than traditional qPCR.The new technology broke through the limitations of traditional qPCR,working without standard curve.In this paper,the researches of digital PCR on nucleic acid detection of human infectious diseases in recent years are reviewed briefly.

Quantitative real?time PCR(dPCR);Virus;Nucleic acid

中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，廣東，廣州510665

★通訊作者：蔣析文，E?mail：yuanyecat@vip.sina.com

注：蔣析文，朱小亞和高秀潔為并列第一作者