北京市3 221例門診患者HPV 13個高危型別分型的實驗研究

張靜 郭建巍陳昌國 李文軍 馬志家

·論著·

北京市3 221例門診患者HPV 13個高危型別分型的實驗研究

張靜 郭建巍★陳昌國 李文軍 馬志家

目的了解北京市門診患者人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）13個高危型別的感染情況及在不同年齡、宮頸疾病中的分布情況。方法收集2012年4月到2014年2月門診就診患者的宮頸分泌物或泌尿生殖道分泌物標本，利用熒光定量PCR方法進行檢測，用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果在3 221例門診患者中，HPV 13個高危型別的檢出率為33.7％，其中男性患者650例，檢出率為22.8％；女性患者2 571例，檢出率為36.5％。年齡18～22歲、23～44歲和45～80歲組男性HPV 13個高危型別的檢出率分別為14.7％、21.2％和37.9％，女性檢出率分別為41.2％、33.4％和44.4％。結(jié)論北京市3 221例門診患者，HPV高危型總體陽性率較高的型別為HPV16型、HPV52型和HPV58型，女性感染HPV13個高危型別總陽性率高于男性；HPV高危型在男性與女性各個年齡組中的分布有差異，但HPV16型和HPV58型在兩組中陽性率都較高；在男性門診患者中，隨著年齡的增加陽性率逐漸增加。對男性13個高危型別陽性者進行早期干預(yù)，在降低其女性伴侶宮頸疾病的發(fā)病率中具有重要意義。

人乳頭瘤病毒；分子分型；宮頸疾病

宮頸癌是中國女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，并有明顯增高及年輕化的趨勢［1］。據(jù)研究報道宮頸癌的發(fā)生與高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的持續(xù)性感染有關(guān)［2?3］。HPV的型別分布隨不同地理位置和不同種族而存在一定差異［4］。本研究擬通過對北京市3 221例不同性別、年齡的門診患者感染HPV的情況進行分子生物學(xué)檢測，以期獲得HPV 13個高危型別在北京市不同年齡、宮頸類疾病中分布情況，為北京市宮頸癌等相關(guān)疾病的有效防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2012年4月到2014年2月不同性別和年齡門診患者的宮頸分泌物或泌尿生殖道分泌物標本，保存于含有保存液的轉(zhuǎn)運瓶中，及時送檢，當日不能檢測的保存于-20℃冰箱，一周內(nèi)完成檢測。

1.2 儀器及試劑

本次實驗使用上海宏石生物技術(shù)有限公司提供的SLAN?9P熒光定量PCR儀和由上海之江生物科技股份有限公司提供的HPV分型試劑。

1.3 核酸提取

用漩渦振蕩器充分混勻采集的樣本，取1 mL加入1.5 mL離心管中13 000 rpm離心5 min，棄上清留沉淀，再加入1 mL標本與沉淀充分混勻后同上操作。沉淀用1 mL無菌生理鹽水洗滌后離心13 000 rpm離心5 min棄上清。沉淀直接加入100 μL核酸提取液充分混勻，沸水浴10 min，13 000 rpm 5 min，取上清做PCR反應(yīng)模板，陰、陽性對照同上操作。

1.4 PCR擴增

循環(huán)參數(shù)：適宜變性的條件為94℃2 min；退火的溫度為93℃，反應(yīng)時間為2 min；最后在62℃延伸31 s，循環(huán)40次，在60℃單點熒光檢測。

1.5 結(jié)果判斷

若待檢樣本混合液1（16、56、31型+IC）的CY5通道的Ct值≤32，且在混合液1的其余通道以及其余混合液的各通道循環(huán)閾值欄顯示No Ct，檢測樣本判定為陰性；如果待檢樣本Ct值在38～40之間，需重復(fù)測定，如仍在38～40之間，且擴增曲線呈典型的S型，則結(jié)果判定為陽性；若非典型的S型曲線，則結(jié)果判定為陰性。

1.6 分析方法

數(shù)據(jù)處理采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0軟件包，用卡方檢驗，P＜0.05差別有統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05差別無統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.13 221例臨床標本中HPV13個高危型別的分布情況

本文共收集門診標本3 221例，從結(jié)果中可看出HPV13個高危型別陽性率由高到低依次為HPV16，52，58，56，39，51，31，18，35，36，33，68，16型。陽性率較高的型別為HPV16，52，58型，均大于5％，其它型別陽性率均在3％以下。將HPV13個高危型別進行卡方檢驗，HPV16，52和58型與其它型別間差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，而這3種型別差別無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。

圖13 221例門診患者中HPV各個型別的陽性分布情況Figure 1The types of HPV positive distribution in 3 221 outpatients

2.2 HPV13個高危型別在不同性別中的分布情況

本次研究共收集臨床病例3 221例，出現(xiàn)至少一項陽性患者1 086例，陽性率為33.7％，其中男性患者650例，陽性人數(shù)148例，陽性率22.8％；女性患者2 571例，陽性人數(shù)938例，陽性率36.5％（表1）。女性患者的陽性率明顯高于男性，對其進行卡方檢驗，P＜0.05，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。女性患者中陽性率較高的型別為HPV16，52和58型，均大于5％，與其它型別相比差別有統(tǒng)計學(xué)差異，而這三者間無統(tǒng)計學(xué)差異，與總體分布情況一致。而對于男性患者，型別間無統(tǒng)計學(xué)差異。但男性HPV型別的陽性分布情況與總體不同，所以男性感染HPV仍不能忽視。

2.3 HPV13個高危型別在不同年齡組中的分布

本研究中按年齡分為3組，分別為婚前期（18～22歲）、婚育期（23～44歲）和中老年（45～80歲）（表中分別用A、B、C表示）。在女性患者HPV13個高危型別在3個年齡組中的陽性率分別為41.2％、33.4％和44.4％（表2），婚前期組與婚育期組用卡方檢驗，P＞0.05差別無統(tǒng)計學(xué)意義；婚育期組與中老年組比較，P＜0.05差別有統(tǒng)計學(xué)意義；婚育期組與中老年組比較，P＞0.05差別無統(tǒng)計學(xué)意義。而男性患者HPV13個高危型別在3個年齡組中的陽性率分別為14.7％、21.2％和37.9％（表3），男性有隨著年齡增加感染率逐漸升高的趨勢?；榍捌诮M與婚育期組用卡方檢驗，P＞0.05差別無統(tǒng)計學(xué)意義；婚育期組與中老年組比較，P＜0.05差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 HPV13個高危型別在不同性別中的分布情況（％）Table 1The distribution of 13 high?risk types in different sex（％）

表2 HPV13個高危型別在女性不同年齡組的分布情況（％）Table 2The distribution of 13 high?risk types in different age groups in female（％）

表3 HPV13個高危型別在男性不同年齡組的分布情況（％）Table 3The distribution of 13 high?risk types in different age groups in male（％）

2.4 HPV13個高危型別在宮頸疾病中的分布

3 221例門診患者中有2 426是宮頸疾病患者，其中感染HPV的人數(shù)為885例，陽性率為36.5％（圖2）。HPV13個高危型別陽性率較高的型別為HPV52、HPV16和HPV58型，陽性率均大于5％，其它型別陽性率均在3％以下。與總體比較，陽性率較高的型別較一致。

圖2 HPV13個高危型別在宮頸疾病中的分布Figure 2The distribution of 13 high?risk types in Cervi?cal disease

3 討論

HPV是一種嗜粘膜和皮膚的雙鏈DNA病毒，具有宿主及組織特異性，能引起人類皮膚多種禿頭狀瘤或疣及粘膜生殖道上皮增生性損傷，和人類多種腫瘤的發(fā)生關(guān)系較為密切。根據(jù)致癌能力的大小，HPV可分為高危型、中危型及低危型，高危型HPV主要引起宮頸不典型增生和原位癌如宮頸癌。

人是HPV的唯一宿主，在普通人群中HPV感染非常普遍，據(jù)文獻報道感染率20％～46％［5］。本研究調(diào)查的北京市3 221例門診患者標本中，陽性人數(shù)1 086例，總陽性率為33.7％，與文獻報道相符［5］。北京市3 221例門診患者中，HPV13個高危型別陽性率由高到低依次為HPV16型、HPV52型、HPV58型、HPV56型、HPV39型等，以HPV16型、HPV52型、HPV58型為主，陽性率均大于5％，其它型別陽性率均在3％以下。

雖然目前世界范圍內(nèi)HPV基因分型結(jié)果存在明顯的地域差異［6］，但HPV16型陽性率依然最高。本實驗室結(jié)果與世界范圍內(nèi)的研究結(jié)果一致［7］，也與廣東潮州地區(qū)農(nóng)村婦女宮頸癌篩查主要型別一致［8］。有研究發(fā)現(xiàn)HPV16型是最難清除的基因型，女性感染HPV16型后，在隨后的6年發(fā)展成為CINⅡ級的風(fēng)險比未感染者高210倍［9］。此外HPV52型和58型僅次于HPV16型，符合亞洲人群的研究結(jié)果，也與盧建明等［10］對中國地區(qū)人群的研究結(jié)果相一致。

在3 221例門診患者中，女性感染HPV13個高危型別的總體陽性率高于男性，男女不同年齡組比較女性陽性率也較高，可能與女性的生理結(jié)構(gòu)更易于HPV感染有關(guān)。雖然男性HPV感染的陽性率較低，但HPV16型和HPV58型陽性率依然較高，型別分布與女性也有所不同，所以男性感染者也不容忽視［11］。HPV13個高危型別感染率在各個年齡組之間有明顯的差異，特別是男性，有隨著年齡增加陽性率逐漸增加的趨勢。在女性HPV的感染中，HPV的感染率呈兩頭增高的現(xiàn)象，與韓品等［12］的報道一致，這種情況可能與婚前期組性行為較活躍有關(guān)，缺乏保護。近年來育齡期女性體檢意識增強，政府優(yōu)生優(yōu)育的提倡以及孕前保健的普及，婚育期女性備孕前及時進行了篩查與治療，在減少HPV感染率上有一定的作用。男性感染HPV后，可分為臨床、亞臨床和潛伏感染，亞臨床感染可能經(jīng)過幾月會自行消退或消失，也可能轉(zhuǎn)變?yōu)轱@性濕疣，或者持續(xù)存在甚至伴其一生，是尖銳濕疣復(fù)發(fā)的危險因素。在男性HPV感染中，中老年組的感染率最高，一方面由于男性HPV的亞臨床感染和潛伏感染，另一方面可能與性行為混亂有關(guān)。男、女中老年組的感染率均高于同性別的婚育組，可能是隨著年齡增長體內(nèi)原有的免疫力逐漸消失或激素水平變化而導(dǎo)致潛伏期病毒復(fù)活有關(guān)［13］。一方面與免疫力下降相關(guān)，導(dǎo)致清除病毒的能力下降，另一方面可能與本文納入例數(shù)較少有關(guān)。

目前已被鑒定HPV的亞型多達100多種，其中有40余種與人類生殖器皮膚黏膜病變相關(guān)［14］，也和人類多種腫瘤的發(fā)生關(guān)系較為密切［15?16］。1995年，國際癌癥研究機構(gòu)專題討論會通過HPV感染是宮頸癌的主要原因。在本研究中，2 571例女性門診患者中確診為宮頸疾病的2 426人，占總?cè)藬?shù)的94.4％，宮頸疾病中HPV的感染率為38.7％。致癌能力最強的HPV16型在宮頸疾病的發(fā)展中有極大的促進作用，具有很強的致癌性，在臨床中應(yīng)引起高度的重視。HPV感染宮頸后，從早期的損害到宮頸癌的整個發(fā)生過程約10年，HPV感染后如果及時進行HPV的基因分型，陽性者進行早期干預(yù)，可對宮頸疾病的早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防、早治療提供幫助，同時男性HPV感染對女性宮頸癌的發(fā)生中也起著非常重要的作用，對男性感染者的性伴侶進行檢測，陽性者進行早期干預(yù)對降低宮頸疾病的發(fā)病率也具有非常重要的意義。

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Experiment research of HPV 13 high?risk types in 3 221 outpatients of Beijing

ZHANG Jing,GUO Jianwei★,CHENG Changguo,LI Wenjun,MA Zhijia
(Department of Clinical Laboratory,Navy General Hospital,Beijing,China,100048)

ObjectiveTo study high?risk HPV typing and its distribution in 3 221 outpatients of Beijing.MethodsSamples from the outpatient department from April 2012 to February 2014 were collected according to sample collection guide.Detectiion and typing were performed with fluorescence quantitative PCR method.Data were analyzed with statistically soft SPSS 16.0.ResultsOf all the 3 221 cases,the positive rate is 33.7％.650 cases were male patients with the positive rate of 22.8％,2 571 cases were female with the positive rate of 36.5％.According to age,all patients were divided into 3 groups.18～22 years old,23～44 years old and 45～80 years old.The positive rates of each group of male patients were 14.7％,21.2％and 37.9％ respectively,and the positive rates of female patients of each group were 41.2％,33.4％and 44.4％ respectively.ConclusionThe main types of high?risk HPV in 3 221 outpatients of Beijing were HPV16, HPV52 and HPV58.The positive rate of female patients were higher than that of male patients.Although different groups of males and females have different distribution in typing,they are still in accordance with main types of HPV16 and HPV58.The infection rate of male patients increased along with the increasing age. Treatments with male positive patients have impartment significance for decrease cervical diseases.

Human papilloma virus;Molecular typing;Cervical disease

中國人民解放軍海軍總醫(yī)院檢驗科，北京100048

★通訊作者：郭建巍，E?mail：jwkuo@sohu.com