促黃體生成素定量測定試劑盒（化學(xué)發(fā)光免疫分析法）的臨床性能評價(jià)

周穎方婉仙吳英松

·論著·

促黃體生成素定量測定試劑盒（化學(xué)發(fā)光免疫分析法）的臨床性能評價(jià)

周穎1方婉仙2吳英松3★

目的對廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司的促黃體生成素定量測定試劑盒（化學(xué)發(fā)光免疫分析法）進(jìn)行臨床應(yīng)用研究及臨床性能評價(jià)。方法采用平行、盲法、對照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用達(dá)瑞生物公司試劑盒檢測335例樣本，以雅培公司的促黃體生成素測定試劑盒（化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法）作為對照試劑盒，羅氏公司的促黃體生成素檢測試劑盒（電化學(xué)發(fā)光法）作為復(fù)核試劑盒。操作按各試劑盒說明書進(jìn)行，對達(dá)瑞生物公司試劑盒的符合率和相關(guān)性進(jìn)行計(jì)算分析。結(jié)果同雅培公司試劑盒比較，達(dá)瑞生物公司試劑盒檢測血清樣品異常符合率為95.8％，正常符合率為95.2％，總符合率為95.4％，Kappa值為0.898（P＜0.01）。線性回歸方程為Y=0.358+0.961X，兩者測定值接近，相關(guān)系數(shù)為0.988（P＜0.01），相關(guān)性良好。同血清檢測結(jié)果相比，血漿檢測結(jié)果Kappa值為1.000（P＜0.01），線性回歸方程為Y=0.120+0.966X，相關(guān)系數(shù)r值為0.999（P＜0.01），相關(guān)性良好。特異性樣本檢測結(jié)果均為正常。結(jié)論本試劑盒檢測性能可以滿足臨床應(yīng)用的需要。

促黃體生成素（LH）；化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）；試劑盒

近年來，不孕癥的發(fā)病率持續(xù)增高，給育齡人群帶來很大的困擾。在美國，大約16.6％年齡介于15歲至44歲的女性患有不孕不育癥，11.9％（730萬）女性需要生育治療［1-3］。國內(nèi)不孕癥的發(fā)病率增高至7％～10％［4-7］。內(nèi)源性黃體生成素的缺乏是導(dǎo)致自然周期排卵障礙的主要原因［8］，其分泌主要受促黃體生成素的調(diào)節(jié)。促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）是一種糖蛋白激素，由腺垂體嗜堿粒細(xì)胞分泌，能夠協(xié)同促卵泡激素共同作用維持卵巢的月經(jīng)周期，導(dǎo)致排卵與黃體形成。異常的促黃體生成素水平以及由此導(dǎo)致的促卵泡激素、雌激素、孕酮、睪丸激素等水平的增高或者降低與許多疾病有關(guān)聯(lián)。促黃體生成素水平增高在女性中會(huì)引起絕經(jīng)、原發(fā)性卵巢功能低減以及多囊卵巢疾病，在男性中則會(huì)引起原發(fā)性性腺功能衰減。而促黃體生成素水平降低在女性中會(huì)引起原發(fā)性卵巢功能亢進(jìn)，在男性中會(huì)引起原發(fā)性性腺功能亢進(jìn)。目前，市面上以雅培公司的促黃體生成素測定試劑盒（化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法）和羅氏公司的促黃體生成素檢測試劑盒（電化學(xué)發(fā)光法）較為常用。但進(jìn)口試劑盒存在價(jià)錢昂貴、檢測系統(tǒng)封閉等不足之處。近年來，發(fā)光免疫分析方法因其具有靈敏度高、線性范圍寬、操作簡單及容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等特點(diǎn)［9-10］，受到廣大科研工作者和臨床分析工作者的注意，該技術(shù)將在現(xiàn)在及未來的免疫分析檢測領(lǐng)域顯示極其重要的作用。因此，開發(fā)操作簡單、經(jīng)濟(jì)和性能較優(yōu)的國產(chǎn)促黃體生成素化學(xué)發(fā)光法測定試劑盒具有巨大的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。

本文對廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司自行研制的促黃體生成素定量測定試劑盒（化學(xué)發(fā)光免疫分析法）進(jìn)行了臨床性能評價(jià)，與現(xiàn)行使用的進(jìn)口試劑盒在樣本檢測中的符合率和相關(guān)性等指標(biāo)進(jìn)行比較分析，為LH體外診斷試劑盒的國產(chǎn)化開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份公司的促黃體生成素定量測定試劑盒（化學(xué)發(fā)光免疫分析法）；促黃體生成素測定試劑盒（化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法）（雅培公司，美國）；促黃體生成素檢測試劑盒（電化學(xué)發(fā)光法）（羅氏公司，德國）。

1.1.2 LH質(zhì)控品

C1預(yù)期濃度范圍為4～6 IU/L，C2為32～48 IU/ L，C3為72～96 IU/L，廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司自配。

1.1.3 樣本

隨機(jī)選取年齡段為18歲至50歲人群血液樣本。①血清樣本：男性64例，絕經(jīng)期女性28例，卵泡期女性63例，月經(jīng)中期女性64例，黃體期女性64例，共283例；②血漿樣本：，男性15例，女性37例，共52例，血漿樣本隨機(jī)來源個(gè)體相應(yīng)的血清樣本包含在上述283例血清樣本中；③特異性樣本：含促卵泡激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）樣本10例、含促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）樣本10例、含人絨毛膜促性腺激素（human cho?rionic gonadotropin，HCG）樣本10例、含類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）樣本10例、含抗核抗體（anti nuclear antibodies，ANA）樣本10例、含人抗鼠抗體（human anti mouse antibody，HAMA）樣本10例、溶血樣本10例、脂血樣本10例、黃疸樣本10例。以上樣本分別由南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院和廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院共2家醫(yī)院提供，均用雅培公司的促黃體生成素測定試劑盒作為對照進(jìn)行血清LH測定。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（型號：Ca?ris200），廈門優(yōu)邁科醫(yī)學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將采集的樣本病例編碼，采用盲法、對照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按各試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，用達(dá)瑞生物公司的試劑盒檢測樣本，美國雅培公司的促黃體生成素化學(xué)發(fā)光法測定試劑盒作為對照實(shí)驗(yàn)，差異樣本用德國羅氏公司的促黃體生成素電化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒作為復(fù)核實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 樣本正常參考值

達(dá)瑞生物公司試劑盒正常范圍值：黃體期樣本：0.78～13.2 IU/L；卵泡期樣本：2.0～12.45 IU/L；月經(jīng)中期樣本：9.24～93.77 IU/L；男性樣本：0.54～13.10 IU/L；絕經(jīng)期樣本：7.7～58.5 IU/L。

雅培試劑盒正常值范圍：黃體期樣本：0.56～14.00 IU/L；卵泡期樣本：1.80～11.78 IU/L；月經(jīng)中期樣本：7.59～89.08 IU/L；男性：0.57～12.07 IU/L；絕經(jīng)期樣本：5.16～61.99 IU/L。

羅氏試劑盒正常值范圍：黃體期樣本：1.0～11.4 IU/L，卵泡期樣本：2.4～12.6 IU/L；月經(jīng)中期樣本：14.0～95.6 IU/L；男性樣本：1.7～8.6 IU/L；絕經(jīng)期樣本：7.7～58.5 IU/L。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)處理

利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行一致性及相關(guān)性分析，用Medcalc軟件進(jìn)行Bland?Altman定量分析。

2 結(jié)果

2.1 血清樣本的檢測結(jié)果分析

2.1.1 一致性性分析

與雅培公司試劑盒比較，達(dá)瑞生物公司試劑盒檢測283例血清樣本的異常符合率為95.8％，正常符合率為95.2％，總符合率為95.4％，Kappa值為0.898（P＜0.01）（表1）。

表1 臨床檢測血清統(tǒng)計(jì)歸納表Table 1Statistical table of clinical detection of serum

2.1.2 相關(guān)性分析

對達(dá)瑞生物公司試劑盒和對照試劑盒的臨床檢測結(jié)果相關(guān)性分析，其線性回歸方程為Y=0.358+ 0.961X，相關(guān)系數(shù)r值為0.988(P＜0.01)（圖1）。

2.1.3 Bland?Altman分析

達(dá)瑞生物公司試劑盒與對照試劑盒測值的95％一致性界限為（-5.4，5.8），4.24％（12/283）的點(diǎn)在95％一致性界限以外，可見達(dá)瑞生物公司試劑盒與對照試劑盒具有較高的一致性。

2.1.4 差異樣本分析

按照各醫(yī)院設(shè)定的正常參考值及達(dá)瑞生物公司試劑盒推薦的正常參考值，283例考核樣本中，達(dá)瑞生物公司試劑盒和對照試劑盒對13例樣本檢測結(jié)果判斷不一致，故對這13例差異樣本用羅氏復(fù)核試劑盒進(jìn)行檢測。13例差異樣本均在cut?off值附近，復(fù)核結(jié)果是有10例復(fù)核結(jié)果與考核結(jié)果一致，有3例復(fù)核結(jié)果與對照結(jié)果一致。

圖1 血樣測值相關(guān)性分析散點(diǎn)圖Figure 1Scatterplot of correlation analysis of blood measurements

圖22 種試劑盒檢測促黃體生成素的Bland?Altman分析Figure 2Bland?Altman analysis of 2 kit which detect LH

2.2 血清與血漿樣本的測值對比

本次臨床試驗(yàn)對52例同一個(gè)體的血清和血漿樣本用達(dá)瑞生物公司核試劑盒進(jìn)行檢測，結(jié)果52例樣本判定結(jié)果一致（表3）。與血清檢測結(jié)果相比，血漿的檢測結(jié)果Kappa值為1.00（P＜0.01），線性回歸方程為Y=0.120+0.966X，相關(guān)系數(shù)r值為0.999（P＜0.01）（圖3）。

2.3 特異性樣本試驗(yàn)分析

本次臨床試驗(yàn)共納入了90例特異性樣本，分別為促卵泡生成激素（FSH）10例、促甲狀腺激素（TSH）10例、人絨毛膜促性腺激素（HCG）10例、類風(fēng)濕因子（RF）10例、抗核抗體（ANA）10例、人抗鼠抗體（HAMA）10例、溶血10例、脂血10例、黃疸10例，均使用達(dá)瑞生物公司試劑盒與對照試劑盒進(jìn)行檢測，兩者檢測結(jié)果均正常。

2.4 可靠性分析

本實(shí)驗(yàn)在對質(zhì)控驗(yàn)證后方進(jìn)行測試，質(zhì)控結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)差及濃度測值均符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)要求，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確可靠。

表2 差異樣本復(fù)核實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2Results of re?experiment in differences samples

表3 同一病例血清血漿對比表Table 3Comparison of serum and plasma level of the same case

3 討論

圖3 血漿與對應(yīng)血清測值相關(guān)性分析散點(diǎn)圖Figure 3Correlation scatter plot of plasma and the corresponding measuring serum value

在男性和女性體內(nèi)，由正、負(fù)反饋機(jī)制對促黃體生成素穩(wěn)態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)過程涉及到下丘腦、垂體、生殖器官、以及垂體和類固醇激素。促黃體生成素和其他垂體促性腺激素，卵泡刺激素在維護(hù)男性和女性的生殖系統(tǒng)的正常功能方面都發(fā)揮著非常重要的作用。一旦穩(wěn)態(tài)失衡可導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，因此，檢測促黃體生成素體內(nèi)含量，對疾病診斷、預(yù)防及治療都有重要的意義［11?12］。

化學(xué)發(fā)光免疫分析法是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與化學(xué)發(fā)光作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)［13?14］，其具有靈敏度高、線性范圍寬、操作簡單及容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等特點(diǎn)，受到廣大科研工作者和臨床分析工作者的注意，顯示了該技術(shù)將在現(xiàn)在及未來的免疫分析檢測領(lǐng)域極其重要的作用。本研究中達(dá)瑞生物公司的促黃體生成素定量測定試劑盒（化學(xué)發(fā)光免疫分析法）是采用雙抗體夾心免疫分析方法，利用化學(xué)發(fā)光磁微球免疫技術(shù)，定量測定人血清或血漿中的LH含量，試劑盒采用吖啶鹽化合物作為標(biāo)記物，無放射性污染，不會(huì)造成對環(huán)境的危害15］。

本研究以美國雅培公司的促黃體生成素測定試劑盒（化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法）作為對照試劑盒，對自行研發(fā)的試劑盒進(jìn)行臨床檢測性能評價(jià)。一致性分析結(jié)果和Bland?Altman分析結(jié)果表明達(dá)瑞生物公司試劑盒與美國雅培試劑盒兩種測量方法結(jié)果具有較好的一致性，兩種方法在臨床上可以互相代替使用。但可能由于差異樣本的LH測值在正常參考值的臨界值附近，導(dǎo)致了有些樣品不同試劑盒判斷結(jié)果的不一致，故需要多次重復(fù)測定或進(jìn)行第三方檢測并作臨床追蹤檢測，才可明確真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和臨床意義，用達(dá)瑞生物公司試劑盒和復(fù)核試劑盒進(jìn)行差異樣本分析，由于樣本數(shù)較少，故與美國雅培試劑盒檢測比較，達(dá)瑞生物公司試劑盒檢測結(jié)果是否更為準(zhǔn)確可靠還需進(jìn)一步深入研究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)達(dá)瑞生物公司試劑盒對血清和血漿的檢測結(jié)果一致性好，可適用于血清及血漿樣本的檢測，而且特異性樣品實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果表明達(dá)瑞生物公司試劑盒檢測血樣時(shí)不受促卵泡生成激素、促甲狀腺激素、人絨毛膜促性腺激素、類風(fēng)濕因子、抗核抗體、人抗鼠抗體、溶血、脂血、黃疸的干擾，特異性較好。綜上所述，達(dá)瑞生物公司試劑盒與目前臨床廣為應(yīng)用的進(jìn)口試劑盒在指標(biāo)檢測性能上具有很好的等效性，可替代國外昂貴試劑應(yīng)用于臨床檢測和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的研究。

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Clinical research of luteinizing hormone(LH)quantitative diagnostic kit by chemiluminescent immunoassay(CLIA)

ZHOU Ying1,FANG Wanxian2,WU Yingsong3★
(1.Guangzhou Center for Disease Control and Prevention,Guangzhou,Guangdong,China,510440;2. Guangzhou Darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong,China,510663;3.Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515)

ObjectiveTo investigate the clinical value of the new Luteinizing Hormone Quantitative Diagnostic Kit by Chemiluminescent Immunoassay(LH?CLIA kit)produced by Darui Biotechnology Co.,Ltd. for detection of LH by CLIA.MethodsIn a double blind controlled trial,the Darui LH?CLIA kit was compared against the Abbot LH?CLIA kit by measuring the LH levels of 335 serum samples.With LH?CLIA kit produced by Abbott(Chemiluminescence particles immunoassays)as a control,and with LH?CLIA kit produced by Roche(electrochemical luminescence method)as an inspection test.According to the kit instructions to operate,to calculate and analysis the coincidence rate and correlation of LH?CLIA kit produced by Darui Biotechnology Co.,Ltd.ResultsCompared with the Abbott LH?CMIA kit,the abnormal coincidence rate was 95.8％,and the normal coincidence rate was 95.2％,the total coincidence rate was 95.4％,the Kappa value was 0.898(P＜0.01).The analysis of quantitative determination indicated that measured serum sample value by Darui LH?CLIA kit is close to Abbott LH?CMIA kit.The linear regression equation was Y=0.358+0.961X,the correlation coefficient was 0.988(P＜0.01),which showed good correlation.Compared with the serums,the Kappa value of the plasmas was 1.000(P＜0.01),the correlation coefficient was 0.999(P＜0.01),the linearregression equation was Y=0.120+0.966X.The specificity samples test result was normal.Conclusion Darui LH?CLIA Kit is a valuable diagnostic kit for clinic application.

Luteinizing hormone(LH);Chemiluminescent immunoassay(CLIA);Kit

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2011AA02A101）

1.廣州市疾病預(yù)防控制中心，廣東，廣州510440 2.廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東，廣州510663 3.南方醫(yī)科大學(xué)，廣東，廣州510515

★通訊作者：吳英松，E?mail：wg@smu.edu.cn