外泌體在缺血性腦卒中的研究進(jìn)展

瞿笑豐，陳麗欣，蕭文澤

·綜述·

外泌體在缺血性腦卒中的研究進(jìn)展

瞿笑豐a，陳麗欣b，蕭文澤c

外泌體是一種新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外小分子囊泡，其參與調(diào)節(jié)缺血性卒中后神經(jīng)細(xì)胞重塑以及血管新生。本文總結(jié)了外泌體在缺血性卒中修復(fù)過程中的研究進(jìn)展，并探討缺血性卒中治療中干細(xì)胞來源外泌體的潛在應(yīng)用價(jià)值。

外泌體；缺血性卒中；血管新生；神經(jīng)細(xì)胞可塑性；造血干細(xì)胞治療

外泌體（exosomes）存在于體液如血液和腦脊液中[1]，是內(nèi)體衍生的小膜泡，直徑約 30～100 nm，由細(xì)胞釋放到細(xì)胞外液[1]。其內(nèi)攜帶有蛋白質(zhì)、脂類和遺傳物質(zhì)，在源細(xì)胞和受體細(xì)胞間起著關(guān)鍵的細(xì)胞間通訊作用[1]。數(shù)據(jù)表明，外泌體也參與調(diào)節(jié)卒中后神經(jīng)血管單元組件細(xì)胞間的通訊。筆者總結(jié)了外泌體在卒中后修復(fù)中的研究進(jìn)展，并探討腦卒中治療中外泌體的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 外泌體調(diào)節(jié)缺血性卒中相關(guān)miRNA水平

在局灶性腦缺血小鼠模型中下調(diào)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞 miRNA-15a，可以促進(jìn)缺血周邊區(qū)的血管新生[3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可與神經(jīng)祖細(xì)胞的血 管 內(nèi) 皮 生 長 因 子 受 體 2（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR-2）結(jié)合，促進(jìn)其增殖和分化。此外，腦白質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞通過腦源性神經(jīng)營養(yǎng) 因 子（brain derived neurophic factor，BDNF）和 腦源性成纖維細(xì)胞生長因子 2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）參與髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞的再生[2]。卒中誘發(fā)的有限的神經(jīng)芽生和缺血周邊區(qū)軸突的髓鞘再生也受到 miRNA 的調(diào)控[4]。而反應(yīng)性增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycan，CSPG）則抑制軸突再生[5]。皮質(zhì)神經(jīng)元過表達(dá) miR-17-92 基因簇或 miR-27a，可激活神經(jīng)元的內(nèi)在生長信號通路，這主要通過抑制磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tension homolog，PTEN）和 Ras同源家族成員（RhoA）信號，從而克服 CSPG 的抑制作 用[6]。 因此，miRNA 和 mRNA的介導(dǎo)信號網(wǎng)絡(luò)在卒中腦修復(fù)過程中起到關(guān)鍵性作用[7]。外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊通過將生物分子從源細(xì)胞轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞也參與神經(jīng)功能的修復(fù)。外泌體通常富含 tetraspanin 蛋白（CD63、CD81），核內(nèi)體調(diào)節(jié)器 Alix，和伴侶蛋白 HSP70，其攜帶的成分有脂類、蛋白和 RNA，包括 mRNA 和 miRNA[1]。

2 外泌體調(diào)節(jié)缺血性腦卒中后血管新生

循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞分泌的外泌體可將其包含物轉(zhuǎn)移到受體內(nèi)皮細(xì)胞，其中包含 PI3K/Akt信號通路相關(guān) miRNA 和促血管生成相關(guān)的 miRNA，如 miR-126 和 miR-296。在大腦，培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的外泌體提供促血管生成的蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA給腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)新生血管生成。此外，人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞也分泌外泌體[8]。小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激和細(xì)胞因子刺激下轉(zhuǎn)移miRNA、mRNA和受體至小鼠腦血管周細(xì)胞，提高了VEGF-B及其受體VEGFR-1 蛋 白 水 平[9]，介 導(dǎo) 血 管 生 成 。 Delta-like 4（DLL4），一種腦內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的膜結(jié)合 Notch 配體，通過與周細(xì)胞的 Notch3 受體結(jié)合，保持腦血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[10]。人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞釋放的外泌體含有DLL4蛋白，參與調(diào)節(jié)血管生成[11]。

蛋白質(zhì)組學(xué)和基因芯片分析顯示，與非缺血組相比，缺血性卒中從本質(zhì)上改變了外泌體所裝載的miRNA 與蛋白成分[12]。 缺血性神經(jīng)祖細(xì)胞來源的外泌體促進(jìn)初級內(nèi)皮細(xì)胞遷移和毛細(xì)血管的形成，而缺血性腦血管內(nèi)皮細(xì)胞外泌體促進(jìn)了神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖和分化[12]。這表明，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的外泌體共同參與了卒中后大腦修復(fù)過程中的神經(jīng)和血管生成過程。

3 外泌體促進(jìn)缺血性腦卒中后神經(jīng)再生

成年老鼠大腦神經(jīng)干細(xì)胞存在于腦室/腦室旁區(qū)（ventricular/subventricular,V/SVZ），此 區(qū) 域 毗 鄰血管和腦脊液，不斷地交換分子信號[13]。腦脊液和神經(jīng)干細(xì)胞釋放的外泌體各自通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號途徑，介導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞的功能和免疫功能[14]。腦脊液來源外泌體激活胚胎神經(jīng)干細(xì)胞 IGF/mTORC1通路，促進(jìn)干神經(jīng)細(xì)胞的增殖[14]。將成年老鼠的胚胎神經(jīng)干細(xì)胞暴露在促炎性因子環(huán)境中，促使其釋放干擾素信號通路γ相關(guān)成分。這些外泌體通過所裝載的干擾素 γ及其受體 IFNGR1 激活靶細(xì)胞內(nèi)STAT1 信號通路[15]。卒中可以激活先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，因此，神經(jīng)干細(xì)胞釋放的外泌體也可能參與了卒中后免疫系統(tǒng)細(xì)胞相互作用。

4 外泌體調(diào)節(jié)缺血性腦卒中后神經(jīng)細(xì)胞可塑性

神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相互作用來協(xié)調(diào)軸突生長和髓鞘形成，這兩者釋放的外泌體也參與這些過程[16]。神經(jīng)元釋放的外泌體含有α-氨基羥甲基惡唑丙酸（AMPA）受體，而去極化神經(jīng)元其突起釋放的外泌體富含微管相關(guān)蛋白 1B（MAP1B）和 miRNA 靶 基 因 ，這 些 成 分 均 參 與 了 神 經(jīng) 可 塑 性[17]。 維 甲 酸 受 體RARβ2激動(dòng)劑通過釋放富含PTEN蛋白的外泌體抑制皮質(zhì)神經(jīng)元PTEN信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。同時(shí)，這些PTEN蛋白的外泌體與PTEN星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)合，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖[18]。此外，皮質(zhì)神經(jīng)元外泌體轉(zhuǎn)移 miR-124 至星形膠質(zhì)細(xì)胞，促使星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)興奮性氨基酸谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1（glutamate transporter-1，GLT-1）表達(dá)，調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能[19]。AMPA 受體和 MAP1B 是突觸可塑性和軸突出芽的關(guān)鍵調(diào)節(jié)受體[17]。而在嚙齒動(dòng)物，星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞外谷氨酸水平和調(diào)節(jié)突觸活化[19]。AMPA 受體的激活有助于腦卒中后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[20]。總之，外泌體介導(dǎo)了神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間突觸傳遞和生物分子的交流[17]，參與調(diào)節(jié)了神經(jīng)元突觸和軸突可塑性。

5 外泌體影響缺血性腦卒中模型中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能

高濃度氯化鉀導(dǎo)致新生小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放外泌體，他們富含突觸囊泡相關(guān)蛋白 synapsin，促進(jìn)軸突生長和神經(jīng)元的存活[21]，不同濃度的氯化鉀均可誘導(dǎo)缺血腦組織的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體[21]。

體外培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞同樣分泌外泌體，其外泌體的分泌受到細(xì)胞內(nèi)鈣水平調(diào)節(jié)。興奮性神經(jīng)元來源的谷氨酸刺激少突膠質(zhì)細(xì)胞釋放攜帶 MBP、PLP 和 sirtuin-2 的外泌體[22]，這些蛋白通過激活靶細(xì)胞 Rho/ROCK/myosin 受體的信號蛋白抑制髓鞘 形 成[23]。 透 射 電 鏡 分 析 表明 ，在 軸 突 周 圍 存 在 PLP+ 多 泡體[24]，表明外泌體有助于協(xié)調(diào)神經(jīng)元介導(dǎo)的髓鞘形成[24]。少突膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體可以被神經(jīng)元內(nèi)化，從而提高神經(jīng)元在細(xì)胞應(yīng)激環(huán)境下的生存能力[22]。在腦缺血體外試驗(yàn)中，對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元進(jìn)行氧/葡萄糖剝奪，少突膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體通過激活的超氧化物歧化酶，過氧化氫酶和其他抗氧化酶，減少缺血性神經(jīng)元死亡[25]。

原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系釋放的外泌體均含有氨肽酶 CD13 和乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 1（monocarboxylate transporter 1，MCT-1）。 小 膠 質(zhì) 細(xì) 胞 外 泌 體 可 以 轉(zhuǎn) 移CD13至神經(jīng)元，引起神經(jīng)肽降解。小膠質(zhì)細(xì)胞還可接收其他腦細(xì)胞分泌的外泌體。少突細(xì)胞祖細(xì)胞（oligodendrocyte progenitor cells，OPCs）來源的外泌體優(yōu)先被小膠質(zhì)細(xì)胞通過大吞飲作用機(jī)制內(nèi)化[26]。與初始小膠質(zhì)細(xì)胞不同，被干擾素-γ（interferonγ，IFN-γ）刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞大幅減少對 OPCs來源的外泌體的吸收[26]。

6 MSC 來源的外泌體可能將應(yīng)用于缺血性腦卒中的治療

包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSCs）在內(nèi)的細(xì)胞療法已被證明可改善卒中和腦外傷后神經(jīng)功能。臨床前研究表明，MSCs促進(jìn)血管生成，神經(jīng)發(fā)生和腦白質(zhì)重塑，通過分泌因子觸發(fā)參與腦修復(fù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

體外培養(yǎng)的MSCs分泌大量的外泌體，通過調(diào)節(jié)大腦微環(huán)境改善了卒中和腦外傷的治療效果[27]。對局灶性腦缺血大鼠模型，靜脈注射MSCs來源的外泌體后，極大促進(jìn)血管重塑，神經(jīng)功能的改善[27]。MSCs 來源外泌體的全身給藥明顯降低缺血小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)障礙，增強(qiáng)血管和神經(jīng)再生，而人類MSCs來源外泌體治療腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）小鼠基本上保存其空間識別能力[28]。這些提示 MSCs介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊的來源可能決定了MSCs的療效。

外泌體把其裝載的miRNA轉(zhuǎn)移給受體細(xì)胞。MSCs來源的外泌體含有超過 700 種 miRNA，他們與 Argonaute2（Ago2）結(jié)合，形成miRNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體。MSCs來源外泌體所裝載的特定miRNA水平對腦卒中后神經(jīng)重塑的影響，已有體外和體內(nèi)研究[27]。用 MSCs治療卒中模型動(dòng)物，可以消除缺血性腦卒中誘導(dǎo)的 miR-133b 的水平下調(diào)[27]。將 MSCs與缺血腦組織提取物混合培養(yǎng)，MSCs釋放的 exosomes富含 miR-133b。慢病毒載體轉(zhuǎn)染 MSCs來源的外泌體可上調(diào)或下調(diào)外泌體中miR-133b水平。結(jié)締組織生長因子和 RhoA 是被 miR-133b 調(diào)控，并抑制軸突生長[27]。在體外，皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞與 miR-133b 上調(diào)的外泌體共培養(yǎng)，下調(diào) RhoA 并促進(jìn)軸突生長，星形膠質(zhì)細(xì)胞與 miR-133b上調(diào)的外泌體共培養(yǎng)，則抑制結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）的表達(dá)?？傊?，MSCs來源的外泌體可作為載體輸送miRNA至受體神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)其基因的表達(dá)。

卒中可抑制外周血免疫細(xì)胞的功能，導(dǎo)致卒中結(jié)局的惡化。除了與腦細(xì)胞之間的相互作用，MSCs來源的外泌體也可與卒中后小鼠外周血自然殺傷細(xì)胞和淋巴細(xì)胞進(jìn)行相互作用，減輕缺血后免疫抑制[28]。

7 造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSC）來源的外泌體用于缺血性腦卒中的治療

來自心肌缺血的研究表明，CD34+HSC來源的外泌體，經(jīng)人工修飾富含音猬因子（sonic hedgehog，SHH），可轉(zhuǎn)移功能化SHH至受體細(xì)胞并激活SHH信號通路，促進(jìn)梗死邊緣區(qū)血管生成和保護(hù)心臟功能[29]。這些實(shí)驗(yàn)表明，HSCs來源的外泌體，通過提供功能蛋白調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的功能，很可能可促進(jìn)腦卒中后的重塑。外泌體可穿越血腦屏障[30]。奧德賽 800 染料標(biāo)記膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分泌的外泌體并鼻腔給藥，可觀察到熒光顆粒分布于整個(gè)大腦，主要在小鼠嗅球[30]。利用 Cre-loxP 系統(tǒng)注射含Cre 重組酶 mRNA 的外泌體，至攜帶 ROSA26-lacZ 報(bào)告基因的小鼠海馬，在海馬神經(jīng)元觀察到 LacZ 報(bào)告基因激活[22]，表明含Cre重組酶的外泌體激活了受體神經(jīng)元的報(bào)告基因。

8 展望

越來越多的數(shù)據(jù)表明，外泌體是卒中后神經(jīng)修復(fù)和神經(jīng)損傷活動(dòng)中重要的細(xì)胞間介質(zhì)，有利于患者功能的恢復(fù)[31]。但仍然存在許多問題和挑戰(zhàn)：如需要明確卒中后腦組織及遠(yuǎn)處器官以何種途徑來影響腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞外泌體的表達(dá)？外泌體裝載的內(nèi)容物通過何種途徑來調(diào)節(jié)受體腦細(xì)胞的基因表達(dá)？不同腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體其類型應(yīng)如何劃分？以及不同性別、年齡和合并癥對外泌體及其裝載的內(nèi)容物有何影響？今后的研究，通過探討外泌體作為缺血性腦細(xì)胞間的通訊介質(zhì)，將有助于對卒中后神經(jīng)功能修復(fù)機(jī)制的理解以及探索出基于外泌體的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新療法。

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（本文編輯：唐穎馨）

R741；R741.02；R743

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.03.014

復(fù)旦附屬浦東醫(yī)院/上海市浦東醫(yī)院a.急診內(nèi)科；b.全科醫(yī)學(xué)科；c.內(nèi)分泌科上海 201399

2017-02-10

蕭文澤wenzexiao@yahoo. com

注：瞿笑豐和陳麗欣為并列第一作者