高產(chǎn)磷脂酶D菌株的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

楊學(xué)利++張璐++王一丁

摘要：利用平板篩選法、薄層色譜（thin layer chromatogrophy，簡稱TLC）層析及高效液相色譜（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）定量分析，從土壤中分離得到1株具有較高磷酰基轉(zhuǎn)移活性的菌株。對該菌株進行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定及16S rRNA序列分析，鑒定其為鏈霉菌屬（Streptomyces），與李色鏈霉菌（Streptomyces prunicolor）同源性最高。針對該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件進行單因素試驗、Plackett-Burman試驗、響應(yīng)面法（response surface methodology，簡稱RSM）分析，最終確定菌株最佳產(chǎn)酶條件為可溶性淀粉15.0 g/L、牛肉膏+蛋白胨（1 ∶[KG-*3]1）15.0 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、初始pH值7.3、發(fā)酵溫度30.5 ℃、發(fā)酵周期99 h；在該條件下菌株的酶活達到36.06 U/L，比原始發(fā)酵培養(yǎng)基提高了65.3%。

關(guān)鍵詞：磷脂酶D；篩選；鑒定；薄層色譜法；響應(yīng)面法分析；酶活性；李色鏈霉菌

中圖分類號： TQ920.1文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0521-05

收稿日期：2015-10-28

作者簡介：楊學(xué)利（1985—），女，山東省聊城人，碩士，研究方向為應(yīng)用微生物學(xué)。E-mail：yangxueli2007@126.com。

通信作者：王一丁，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)。E-mail：wangyiding@sicnu.edu.cn。

磷脂酶D（phospholipase D，簡稱PLD）催化磷脂質(zhì)的磷酸二酯鍵水解生成磷脂酸和羥基化合物，此外PLD還通過磷?；D(zhuǎn)移作用催化磷脂質(zhì)的極性頭部基團轉(zhuǎn)移。其中尤為重要的是PLD的磷?；D(zhuǎn)移作用，它可以將自然界大量存在的磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，簡稱PC）催化合成為其他的稀有磷脂，如磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，簡稱PG）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，簡稱PS）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，簡稱PE）等[1]。PS因獨特的理化性質(zhì)和營養(yǎng)價值在食品、化妝品、藥品中有重要作用，并受到了國際社會的認可。2015年4月，石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司率先推出國內(nèi)首款添加磷脂酰絲氨酸的兒童奶粉，開創(chuàng)了國內(nèi)高端兒童奶粉的先河。

來源于微生物的PLD具有較強的轉(zhuǎn)磷脂能力和較廣泛的底物專一性，近年來國內(nèi)外學(xué)者報道的微生物種類主要集中于芽孢桿菌、假單胞菌、鏈霉菌、大腸桿菌[2-5]，其中又以來源于鏈霉菌屬的PLD的轉(zhuǎn)磷脂活性最高。

本研究從菜籽油廠土樣中篩選高產(chǎn)PLD菌株，并從形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rRNA序列分析對菌株進行鑒定；對該菌株發(fā)酵條件進行優(yōu)化，通過響應(yīng)面法[6]分析影響發(fā)酵因素的交互作用，尋找最優(yōu)的發(fā)酵條件。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品

土壤采自四川省眉山市彭山區(qū)某菜籽油廠廠區(qū)。

1.1.2試劑

磷脂酰膽堿標(biāo)品、磷脂酰絲氨酸標(biāo)品均購自美國Sigma公司；色譜純乙腈、色譜純甲醇、色譜純磷酸均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；DNA提取試劑盒、PCR試劑均購自北京天根生化科技有限公司；PCR測序引物由上海生工生物工程有限公司合成；其他試劑均為分析純。

1.1.3培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：磷脂酰膽堿（PC）5.0 g/L，NaCl 0.25 g/L，pH值自然，121 ℃滅菌15 min。

分離培養(yǎng)基：磷脂酰膽堿（PC）5.0 g/L，KNO3 5.0 g/L，K2HPO4 0.25 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L，NaCl 0.25 g/L，瓊脂20 g/L，pH值7.0～7.4，121 ℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L，酵母膏20.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L，牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L；基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%瓊脂。

1.2試驗方法

1.2.1菌株富集與分離

采用四分法取土樣1 g，接入 50 mL 的富集培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下活化培養(yǎng) 5 d。富集培養(yǎng)液經(jīng)103～107倍梯度稀釋后，吸取2 mL均勻涂布于分離平板上。挑取長勢良好的菌落分離、純化，直至得到單一菌株的純培養(yǎng)物。

1.2.2粗酶液的制備

將分離得到的單菌落分別在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵條件為30 ℃、200 r/min培養(yǎng) 3 d。培養(yǎng)后的發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液即為粗酶液。

1.2.3磷脂酶D活力的測定

用發(fā)酵提取的粗酶液催化PC與絲氨酸生成PS來測定PLD的活力。反應(yīng)體系：有機相為溶解4 mg/mL PC的乙醚溶液，水相為溶解0.2 g/mL絲氨酸的pH值5.5、0.02 mol/L醋酸緩沖溶液，兩相混合后于 30 ℃、200 r/min下反應(yīng)4 h。待反應(yīng)完畢后將溶液靜置，取有機層進行蒸發(fā)，再將蒸發(fā)后的產(chǎn)物按V三氯甲烷 ∶[KG-*3]V甲醇=2 ∶[KG-*3]1溶解。酶活力單位定義為30 ℃條件下，1 min之內(nèi)由PC轉(zhuǎn)化成 1 μmol PS所需要消耗的酶量。

1.2.3.1TLC定性分析

將V三氯甲烷 ∶[KG-*3]V甲醇 ∶[KG-*3]V水按65 ∶[KG-*3]25 ∶[KG-*3]4的比例配制搖勻，將展開劑在層析缸中預(yù)飽和20 min。將硅膠GF254板在105 ℃下活化30 min后取出，放入干燥器中冷卻待用。用點樣毛細管在距離底端約1 cm的同一水平上依次點磷脂酰膽堿標(biāo)品、磷脂酰絲氨酸標(biāo)品、待測樣品溶液，放入展開缸中展開45 min后將層析板取出，自然晾干后在 254 nm 下進行熒光觀察。

1.2.3.2HPLC定量分析

按V流動相乙腈 ∶[KG-*3]V甲醇 ∶[KG-*3]V磷酸=85 ∶[KG-*3]15 ∶[KG-*3]1.5 配制搖勻；流速為1.0 mL/min，在205 nm下進行檢測。利用外標(biāo)法，以PS標(biāo)品為標(biāo)準，定量分析檢測結(jié)果。

1.2.4菌體濃度測定

取一定體積的發(fā)酵液在10 000 r/min條件下離心10 min，再用dd H2O沖洗，離心2次后得到菌體。離心管在裝發(fā)酵液前置于105 ℃烘箱烘至恒質(zhì)量（m0），離心后再將離心管置于同樣條件下烘至恒質(zhì)量（m1），菌體濃度計算公式：菌體濃度=（m1-m0）/V。

1.2.5菌株培養(yǎng)特征及生理生化鑒定

菌落培養(yǎng)特征和生理生化特征參照文獻[7]進行。

1.2.616S rRNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

按照試劑盒的操作步驟提取菌株DNA，然后進行16S rRNA PCR擴增，將PCR產(chǎn)物送往華大基因檢測有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI上Blast序列分析及EzTaxon（http：//www.ezbiocloud.net/）比對。根據(jù)序列分析及比對結(jié)果構(gòu)建篩選菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.7菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化

分別選取碳源、氮源、接種量、初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間6個方面進行菌株發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗。對優(yōu)化后的發(fā)酵條件再進行Plackett-Burman（PB）試驗，選取3個對發(fā)酵條件影響最顯著的因素，進行響應(yīng)面法分析，從而得到最佳的發(fā)酵條件。

2結(jié)果與分析

2.1菌株初篩結(jié)果

以磷脂酰膽堿為唯一碳源進行產(chǎn)磷脂酶D菌株的篩選，篩選得到平板上3株長勢良好的菌株，分別為ML-Y002、ML-Y005、ML-Y006；再將這3株菌株進一步采用搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，比較各菌株的產(chǎn)酶能力。

2.2菌株復(fù)篩結(jié)果

2.2.1TLC檢測

將初篩到的3株菌株進行搖瓶發(fā)酵，檢測是否具有磷?；D(zhuǎn)移活性，即是否能催化PC和絲氨酸生成PS。由圖1可以看出，篩選出的3株菌株均有磷?；D(zhuǎn)移能力，進一步通過HPLC測定其磷?；霓D(zhuǎn)移能力。

[TPYXL1.tif]

2.2.2HPLC活性檢測

用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基對ML-Y002、ML-Y005、ML-Y006等3株菌株進行發(fā)酵，取上清液檢測PLD活性，活性分別為（18.66±0.21）、（12.23±0.49）、（2181±0.34）U/L。選取活性最高的ML-Y006做進一步研究。

2.3電鏡鑒定

菌株ML-Y006在燕麥粉瓊脂（ISP-3）培養(yǎng)基上長勢良好，形成具有高度分化的氣生菌絲和基內(nèi)菌絲，菌絲有橫隔、不斷裂。菌落表面呈皺褶狀，顏色呈灰白色；基內(nèi)菌絲呈紫褐色，產(chǎn)生淺褐色可溶性色素。在掃描電鏡下發(fā)現(xiàn)，孢子絲長，呈直或略柔曲；孢子橢圓形、長圓形，表面光滑（圖2）。

[TPYXL2.tif]

2.4菌落培養(yǎng)特征及生理生化檢測

培養(yǎng)特征：菌株ML-Y006在ISP-3培養(yǎng)基、無機鹽-淀粉瓊脂培養(yǎng)基、酵母膏-麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上長勢良好，氣生菌絲均為灰白色，基內(nèi)菌絲淺黃色或灰白色，無可溶性色素。生理生化特征：經(jīng)試驗，菌株ML-Y006能使酯酶、淀粉水解；不產(chǎn)生H2S；牛奶胨化；硝酸鹽不還原，不能分解色氨酸，甲基紅（M-R）試驗陰性。生長溫度為9～40 ℃，最適溫度為30 ℃。

2.5系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及菌株鑒定結(jié)果

對菌株ML-Y006進行16S rRNA分子鑒定，采用通用引物進行PCR擴增后，獲得約1 500 bp的片斷，將測序得到的序列通過Blast與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道序列進行同源性對比，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖3可以看出，ML-Y006菌株經(jīng)鑒定屬于鏈霉菌屬，與李色鏈霉菌（Streptomyces prunicolor）相似度為100%且在同一分支。根據(jù)生理生化及16S rRNA綜合分析鑒定該菌株為李色鏈霉菌（Streptomyces prunicolor）。

2.6發(fā)酵條件優(yōu)化

2.6.1碳源對菌體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，30 ℃、初始pH值6.0、200 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h后測菌株酶活和菌體濃度。分別添加質(zhì)量濃度均為10.0 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油作為唯一碳源，并以不加碳源作為空白對照。由圖4可以看出，當(dāng)碳源為可溶性淀粉時，ML-Y006菌株酶活最高；葡萄糖為碳源時，酶活次之，其他3種碳源對酶活提高較少。還可以看出，酶活的高低和菌體濃度的大小基本成正比關(guān)系，故選用可溶性淀粉為最佳碳源。

其他培養(yǎng)基成分不變，分別加入不同質(zhì)量濃度的可溶性淀粉作為碳源來做單因素試驗，并設(shè)置空白對照，考察其對酶活及菌體生長的影響。由圖5可以看出，隨著可溶性淀粉質(zhì)量濃度的增加，酶活快速增加，當(dāng)可溶性淀粉質(zhì)量濃度為 15 g/L 時，酶活最高；當(dāng)質(zhì)量濃度再增加到20 g/L后，菌體濃度和酶活逐漸降低。因此選取15 g /L作為可溶性淀粉的最佳添加量。

2.6.2氮源對菌體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，30 ℃、初始pH值6.0、200 r/min條件下?lián)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)72 h，測菌株酶活和菌體濃度，分別添加質(zhì)量濃度為10 g/L的牛肉膏、蛋白胨、牛肉膏+蛋白胨（質(zhì)量比為1 ∶[KG-*3]1）、酵母浸粉、NaNO3、NH4NO3、（NH4）2SO4作為唯一氮源，并以不添加氮源作為空白對照。由圖6可以看出，有機氮有利于菌體生長及酶活提高，而無機氮不利于酶活的提高或提高較少，且不利于菌體生長。對酶活提高最多的為牛肉膏+蛋白胨，其次為蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉。由圖6還可以看出，酶活的高低和菌體濃度的大小基本成正比關(guān)系。因此，選用牛肉膏+蛋白胨為最佳氮源。

其他培養(yǎng)基成分不變，分別加入不同質(zhì)量濃度的牛肉膏+蛋白胨（1 ∶[KG-*3]1）作為氮源做單因素試驗，并設(shè)置空白對照，考察其對酶活及菌體生長的影響。由圖7可以看出，氮源濃度對酶活和菌體生長影響較大，濃度小于15 g/L時，隨濃度提高酶活和菌體濃度均為上升趨勢，大于15 g/L時，酶活開始下降，菌體濃度變化較小，故選擇牛肉膏+蛋白胨（1 ∶[KG-*3]1）濃度為 15 g/L 作為最佳氮源。

2.6.3接種量對菌體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，其他條件不變對接種量進行優(yōu)化，由圖8可以看出，接種量對酶活影響不明顯，接種量在1%～2%時，酶活提升較快；當(dāng)接種量大于2%時，酶活和菌體溶度逐漸降低。依照酶活大小，確定2%為最適接種量。同樣可以看出，酶活的高低與菌體濃度的大小基本成正比關(guān)系。

2.6.4培養(yǎng)基初始pH值對菌體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，其他條件不變對發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值進行優(yōu)化。由圖9可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對酶活影響較為顯著，當(dāng)pH值在4～7時，酶活有大幅度提高，pH值在8～11時，酶活大幅下降。依照酶活的大小，確定pH值7為最適發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值。

2.6.5發(fā)酵溫度對菌體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，其他條件不變，對發(fā)酵溫度進行優(yōu)化。由圖10可以看出，發(fā)酵溫度在18～30 ℃時，酶活緩慢增加，并達到最大值，發(fā)酵溫度大于30 ℃時，酶活開始下降。還可以看出，酶活與菌體濃度之間仍呈正相關(guān)性。依照酶活的大小，確定 30 ℃ 為最適發(fā)酵溫度。

2.6.6培養(yǎng)時間對菌體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，其他條件不變，對發(fā)酵周期進行優(yōu)化。由圖11可以看出，發(fā)酵24～96 h時，酶活一直處于增加狀態(tài)，并在 96 h 時達到最大值；當(dāng)發(fā)酵超過96 h時，酶活快速下降而菌體濃度變化較弱。依照酶活的大小，確定96 h為最適發(fā)酵周期。

2.6.7菌株發(fā)酵條件的響應(yīng)面分析

經(jīng)Design Expert 8.0中Plackett-Burman分析，篩選對酶活影響顯著的發(fā)酵條件。如果P<0.05，說明該因素在模型中具有顯著性影響。由表1可以看出，影響最為顯著的3個因素由大到小分別為初始pH值>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時間。

將影響最為顯著的3個因素，以單因素試驗最優(yōu)條件為中心點，進行3水平試驗，再進行響應(yīng)面Box-Behnken分析。分析結(jié)果如表2、圖12，根據(jù)分析顯示R2=0.919 4，回歸系數(shù)較[CM（25]好，結(jié)果可信；P值為0.004 4，模型顯著。運用該模型求得[CM）]

各因素最佳取值：初始pH值為7.29、發(fā)酵溫度為30.52 ℃、發(fā)酵周期為99.37 h，預(yù)測酶活為35.476 2 U/L。應(yīng)用該發(fā)酵條件：可溶性淀粉15.0 g/L、牛肉膏+蛋白胨（1 ∶[KG-*3]1）15.0 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、初始pH值 7.3、發(fā)酵溫度30.5 ℃、發(fā)酵周期99 h，進行3個批次試驗，試驗結(jié)果平均為（3606±0.61）U/L，預(yù)測結(jié)果與試驗結(jié)果非常接近。

3結(jié)論與討論

本研究經(jīng)過大量試驗分析篩選得到1株磷?；D(zhuǎn)移能力較強的菌株ML-Y006，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗和16S rRNA分析鑒定，確定該菌株為李色鏈霉菌。通過單因素試驗、PB試驗及響應(yīng)面分析，確定了該菌株的最佳產(chǎn)酶條件為可溶性淀粉15.0 g/L、牛肉膏+蛋白胨（1 ∶[KG-*3]1）15.0 g/L、K2HPO4 2 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、初始pH值7.3、 發(fā)酵溫度30.5 ℃、發(fā)酵周期99 h，在該條件下菌株酶活達到3606 U/L，較優(yōu)化前酶活提高了65.34%，效果較為顯著，為后續(xù)擴大應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。

PLD菌株多從富含有卵磷脂的環(huán)境中篩選，如大豆油土樣、香油土樣以及豆瓣中[2，8-9]，本研究首次從菜籽油土樣中進行PLD菌株的篩選。據(jù)報道，高產(chǎn)的PLD菌株多為放線菌，尤其是產(chǎn)酶較豐富的鏈霉菌屬，與本研究篩選結(jié)果一致。大部分文獻報道的產(chǎn)PLD菌株的活性測定多以PLD水解活性為測定指標(biāo)，如董丹等測定PLD產(chǎn)生的游離脂肪酸[9]，梁麗敏等測定PLD產(chǎn)生的膽堿[10]，但PLD水解活性高的菌株或酶不一定具有同樣高的轉(zhuǎn)酯酶活性。本研究直接以PC與絲氨酸合成PS的轉(zhuǎn)酯酶活性為檢測指標(biāo)來篩選菌株及優(yōu)化培養(yǎng)基，為進一步研究酶法轉(zhuǎn)化PS的擴大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

常規(guī)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件多采用將其他因素固定的單一因素試驗，容易忽略因素間的交互作用而得出錯誤的結(jié)論，不能實現(xiàn)真正的最優(yōu)化。響應(yīng)面法是多變量系統(tǒng)尋優(yōu)的試驗策略：首先確定對發(fā)酵最可能具有影響的營養(yǎng)和培養(yǎng)條件，然后用Plackett-Burman試驗進行影響因素篩選，尋找到對發(fā)酵影響顯著的因素，對影響顯著因素用響應(yīng)面法進行優(yōu)化，建立的模型用于預(yù)測獲得最大期望響應(yīng)的水平[11]。本研究對篩選菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman試驗找到影響顯著的因素，進而進行響應(yīng)面法分析，預(yù)測的最優(yōu)發(fā)酵條件與實際接近，發(fā)酵酶活提升較大。

在發(fā)酵培養(yǎng)基的研究中，當(dāng)可溶性淀粉濃度大于15 g/L或牛肉膏+蛋白胨（1 ∶[KG-*3]1）濃度大于15 g/L時，酶活逐漸下降，可能的原因是可溶性淀粉或牛肉膏+蛋白胨的增多會增加培養(yǎng)基的黏度和滲透壓，黏度會影響發(fā)酵液中溶解氧的濃度，高的滲透壓可能導(dǎo)致細胞脫水死亡，從而影響菌體生長和酶活產(chǎn)物的合成[12]。氮源的優(yōu)化中，有機氮測定的酶活遠遠高于無機氮，可能有機氮在提供氮源的同時，還可以提供一些微生物生長的營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、氨基酸、肽類、維生素、微量元素等[13]。

本研究所用的粗酶液即為發(fā)酵上清液，酶含量較低，且含有培養(yǎng)基等成分，可能對酶活反應(yīng)有一定影響。在接下來的研究中，首先將發(fā)酵產(chǎn)生的PLD進行純化，用提純的酶研究合成PS反應(yīng)條件，找到最優(yōu)的PS合成工藝，為擴大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)；再者擴大反應(yīng)底物，來合成價值較高的磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）等反應(yīng)產(chǎn)物，擴大PLD的使用范圍。

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