轉(zhuǎn)基因成分定量檢測技術(shù)研究進(jìn)展

杜智欣,焦 悅,張亮亮,朱鵬宇,付 偉,*

(1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100029;2.廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣西南寧 530021;3.農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心,北京 100125;4.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,海南海口 570311)

?

轉(zhuǎn)基因成分定量檢測技術(shù)研究進(jìn)展

杜智欣1,2,焦 悅3,張亮亮4,朱鵬宇1,付 偉1,*

(1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100029;2.廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣西南寧 530021;3.農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心,北京 100125;4.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,海南海口 570311)

轉(zhuǎn)基因作物的種類以及含有轉(zhuǎn)基因成分的產(chǎn)品在日益增長,轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性也越來越被社會公眾廣泛關(guān)注。世界各國均頒布轉(zhuǎn)基因安全管理、標(biāo)識法規(guī),對轉(zhuǎn)基因生物及其加工產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識和管理。如何準(zhǔn)確、穩(wěn)定地對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定量,已成為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)研究的重要方向。本文綜述了競爭性PCR、熒光定量PCR以及數(shù)字PCR等定量檢測技術(shù)在轉(zhuǎn)基因成分檢測中應(yīng)用及研究進(jìn)展,討論了目前各類轉(zhuǎn)基因定量檢測技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn),并在此基礎(chǔ)上展望了定量檢測技術(shù)在轉(zhuǎn)基因成分檢測領(lǐng)域的發(fā)展前景。

轉(zhuǎn)基因,定量檢測,PCR,數(shù)字PCR

基因工程的飛速發(fā)展使越來越多地轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)入人們的日常生活。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品食用和環(huán)境安全性的爭議也越來越強(qiáng)烈[1-2]。包括歐盟國家在內(nèi)超過60個(gè)國家地區(qū)以及國際組織已經(jīng)制定了相關(guān)的法律法規(guī)[3],要求對轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識管理,用以維護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)。

標(biāo)識的閾值是指產(chǎn)品中含有的轉(zhuǎn)基因作物的百分比。世界各國在設(shè)定轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識閾值時(shí),除了考慮科學(xué)因素外,還要結(jié)合經(jīng)濟(jì)、社會、人文等因素,進(jìn)而通過閾值來集中體現(xiàn)一個(gè)國家和地區(qū)對轉(zhuǎn)基因安全風(fēng)險(xiǎn)的相應(yīng)忍受程度[4]。其中,歐盟新頒布EC No 1829/2003和No 1830/2003中規(guī)定所有轉(zhuǎn)基因成分含量超過0.9%的食品和飼料都必須進(jìn)行強(qiáng)制性標(biāo)識;澳大利亞、新西蘭、以色列、捷克共和國、沙特阿拉伯等國家的閾值為1%;智利的閾值是2%;韓國、馬來西亞等閾值為3%;日本、泰國、印尼、中國臺灣等國家和地區(qū)規(guī)定的標(biāo)識閾值為5%[5-6]。以美國為代表,加拿大、阿根廷等國家對于轉(zhuǎn)基因食品的標(biāo)識管理施行自愿性標(biāo)識。中國目前采取的是零容忍的強(qiáng)制性標(biāo)簽制度,沒有設(shè)定具體的閾值,只要是符合2002年頒布《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》中規(guī)定的5類17種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品必須進(jìn)行標(biāo)識。但是不可否認(rèn),我國轉(zhuǎn)基因安全管理實(shí)施定量標(biāo)識和閾值管理是未來發(fā)展的必然趨勢[7]。因此我國需提高定量檢測技術(shù)水平以達(dá)到國際社會對轉(zhuǎn)基因作物及其相關(guān)產(chǎn)品的檢測水平。

標(biāo)識制度不斷發(fā)展和完善也促使轉(zhuǎn)基因檢測方法從定性到定量的發(fā)展,快速、靈敏、準(zhǔn)確的定量檢測技術(shù)已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品檢測方法研究的重點(diǎn),是安全管理和標(biāo)識法規(guī)實(shí)施的技術(shù)支撐。目前在轉(zhuǎn)基因定量檢測過程中,由于核酸的穩(wěn)定性要高于蛋白質(zhì),因此以核酸為靴標(biāo)的檢測技術(shù)成為定量轉(zhuǎn)基因成分檢測的首選技術(shù)。本文主要通過探討定量檢測技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域方面的應(yīng)用,旨在提出轉(zhuǎn)基因定量檢測技術(shù)未來發(fā)展的趨勢和研究方向。

1 定量PCR檢測技術(shù)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測中的應(yīng)用

1.1 競爭性定量PCR檢測技術(shù)

競爭性定量PCR(competitive quantitative PCR,QC-PCR)采用同目標(biāo)DNA相同動力學(xué)特點(diǎn)和擴(kuò)增效率的DNA模板(DNA競爭模板)與樣品混合在同一體系中,使它們競爭反應(yīng)體系中相同的底物與引物,同時(shí)以不同稀釋梯度的競爭DNA模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算待測DNA的含量[8]。該方法初期主要針對單一外源基因進(jìn)行定量檢測,如針對一代抗草甘膦大豆農(nóng)達(dá)和玉米Bt11、Bt176品系建立了啟動子和終止子的QC-PCR方法[9],以及Hardegger等建立了針對35S啟動子和NOS終止子的競爭性PCR檢測體系[10]。隨后,QC-PCR方法經(jīng)毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)(Capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence,CE-LIF)進(jìn)行檢測,實(shí)現(xiàn)了玉米Bt176品系的雙重定量檢測[11]。Mavropoulou等[12]將PCR產(chǎn)物與微孔板中預(yù)先包被的靶基因雜交用以代替凝膠電泳可以同時(shí)檢測轉(zhuǎn)基因大豆的內(nèi)源基因lectin與外源35S啟動子,其中外源35S啟動子的檢測限可達(dá)24拷貝。此外,基于光譜自編碼微球的高通量篩選技術(shù)也被引入QC-PCR檢測體系中,并應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因成分定量檢測分析,可同時(shí)檢測包含內(nèi)源基因在內(nèi)的4個(gè)靶基因,檢測限可達(dá)500拷貝[13]。競爭性定量PCR實(shí)驗(yàn)原理巧妙而嚴(yán)謹(jǐn),可以有效地降低實(shí)驗(yàn)室間的誤差,進(jìn)而得到較為可靠的定量結(jié)果,但是競爭性DNA制作工序復(fù)雜,需要進(jìn)行反復(fù)測試進(jìn)而達(dá)到一定的穩(wěn)定性。同時(shí)每次實(shí)驗(yàn)都要針對檢測目標(biāo)的不同而做多種標(biāo)準(zhǔn)品對照,工作量大。此外,競爭性模板與目的模板擴(kuò)增效率很難做到完全一致,這對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性會產(chǎn)生一定的影響。故此該方法受到初始標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量的影響非常大,如果不能把前期競爭性DNA制作轉(zhuǎn)化為商業(yè)化運(yùn)作,將很難適應(yīng)日常大批量高通量的檢測應(yīng)用。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time Quantitative PCR or Taqman PCR or qPCR)是現(xiàn)如今得到廣泛認(rèn)可和應(yīng)用的定量PCR檢測技術(shù)[14-15]。該技術(shù)建立在熒光能量傳遞技術(shù)(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)的基礎(chǔ)之上,在PCR反應(yīng)體系中加入非特異性熒光染料(如:SYBR Green I、Eva Green、LC Green和SYTO9等)或者特異性的熒光探針(如TaqMan探針、TaqMan-MGB探針、Allglo探針、LNA、FRET、分子信標(biāo)等),通過實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光量的變化,獲得待測樣品達(dá)到熒光檢測閾值的循環(huán)數(shù)(cycle threshold,Ct值)。再根據(jù)已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值與其濃度對數(shù)成負(fù)線性相關(guān)關(guān)系這一原理,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。進(jìn)而計(jì)算出樣品中模板DNA的濃度[16]。Vaitilingom等[17]于1999年首次將該技術(shù)應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量檢測上。近年來,實(shí)時(shí)熒光定量PCR被廣泛應(yīng)用于大豆[18]、玉米[19]、水稻[20]、番茄[21]、小麥[22]、棉花[23]、柑橘[24]等轉(zhuǎn)基因植物的目的基因定量檢測。同時(shí),DNA提取技術(shù)的不斷更新?lián)Q代,促進(jìn)了熒光定量PCR技術(shù)在深加工產(chǎn)品中的應(yīng)用,如發(fā)酵豆制品[25-26]、糧油[27]、飼料[28]等。而隨著規(guī)模化、實(shí)用化轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展,多重?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)整合到一起,可對多個(gè)目的基因進(jìn)行同時(shí)檢測。但是在同一反應(yīng)體系中,多對引物和探針之間存在相互抑制以及熒光通道的限制,目前建立的多是應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的篩選檢測方法,Cottenet等針對47個(gè)檢測目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因成分最多可以做到24重實(shí)時(shí)熒光PCR篩選技術(shù)[29],而已報(bào)道的實(shí)時(shí)熒光多重PCR定量檢測方法大多僅限于三重[30-31]。我國汪秀秀[32]采用錨定核苷酸探針(Locked Nucleic Acid,LNA)結(jié)合四個(gè)熒光通道(FAM、HEX、ROX和CY5)的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增技術(shù),建立了可以最多同時(shí)定量檢測轉(zhuǎn)基因棉花品系GHB119、T304-40、棉花內(nèi)源基因ACP1與Cry2Ae蛋白基因的四重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法。不可否認(rèn)經(jīng)過多年的發(fā)展,實(shí)時(shí)熒光定量PCR已經(jīng)是現(xiàn)階段轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測方法中快速、高效、準(zhǔn)確的代表。但從定量原理上來講,實(shí)時(shí)熒光定量PCR對于目標(biāo)DNA模板的定量主要分為絕對定量和相對定量兩種。絕對定量是指用己知標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知樣品的模板量。相對定量則是指是在目標(biāo)模板序列相對于另一參照樣品序列的變化。不難看出,兩種定量方法都極度依賴于標(biāo)準(zhǔn)品,故此針對現(xiàn)行商品化轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品大力開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并建立相關(guān)質(zhì)量評估組織是保持該定量方法更為廣泛應(yīng)用的主要手段。另一方面,還有一些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品沒有經(jīng)過任何批準(zhǔn)混入市場。這些未知轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中修飾DNA序列的相關(guān)信息一般由研究院所以及公司作為不公開信息保存,很難有針對性對其進(jìn)行有效的檢測,這將是現(xiàn)行主流定量檢測發(fā)展的一個(gè)最大的挑戰(zhàn)。此外,在實(shí)際檢測過程中,由于熒光定量PCR體系較為封閉,耐受性差等因素,擴(kuò)增閾值變化幅度較大,因此無論是準(zhǔn)確度還是重現(xiàn)性在某些時(shí)候仍然存在誤差較大的問題。

1.3 數(shù)字PCR定量檢測技術(shù)

數(shù)字PCR(digital PCR,dPCR)是繼普通PCR技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)之后的第三代PCR技術(shù),是一項(xiàng)針對單分子目標(biāo)DNA的絕對定量分析技術(shù)。該技術(shù)一般需要先將核酸模板稀釋,并平均分配到幾十至幾萬個(gè)單元中進(jìn)行反應(yīng),理論上使每個(gè)反應(yīng)單元中只有單個(gè)模板分子,然后在每個(gè)反應(yīng)單元中獨(dú)立地進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增結(jié)束采用泊松概率分布公式等統(tǒng)計(jì)學(xué)公式分析熒光信號陽性的反應(yīng)單元占所有反應(yīng)單元的比例來計(jì)算初始樣品中目標(biāo)核酸的精確拷貝數(shù)[33-35]。相較于傳統(tǒng)PCR,數(shù)字PCR的靈敏度很大程度上取決于反應(yīng)單元的數(shù)目。反應(yīng)單元的數(shù)目越多,數(shù)字PCR的靈敏度和準(zhǔn)確度也越高。目前,根據(jù)反應(yīng)單元形成的不同方式,商業(yè)化的數(shù)字PCR技術(shù)主要包括芯片式數(shù)字PCR(chip digital PCR,cdPCR)和微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)兩類數(shù)字PCR系統(tǒng)。ddPCR源于乳液PCR(emulsion PCR)技術(shù)[36-37],主要由Bio-Rad和RainDance公司進(jìn)行商業(yè)化開發(fā),利用微滴發(fā)生器可以一次生成2萬個(gè)納升級(QX200TMDroplet Digital PCR System)或1千萬個(gè)皮升級(RainDropTMDigital PCR System)的微滴。cdPCR則通過微流控等技術(shù)被均勻?qū)胄酒系姆磻?yīng)倉或微孔中進(jìn)行PCR反應(yīng),然后通過類似于基因芯片的方法掃描每個(gè)反應(yīng)倉或者通孔的熒光信號,進(jìn)而計(jì)算目的序列的含量。以Fluidigm公司的BioMarkTMHD System系統(tǒng)(1萬～4萬反應(yīng)倉)以及ThermoFisher Scientific公司的QuantStudioTM3D Digital PCR System系統(tǒng)(2萬微孔)為代表。

cdPCR和ddPCR這兩類主流的商業(yè)化數(shù)字PCR技術(shù)都已應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因成分定量檢測。Burns等[38]利用cdPCR進(jìn)行轉(zhuǎn)基因樣品含量分析并發(fā)現(xiàn)該平臺檢測限達(dá)到5拷貝;Pérez Urquiza等[39]應(yīng)用Fluidigm與ThermoFisher兩個(gè)公司cdPCR系統(tǒng)平臺對玉米MON 810、大豆GTS 40-3-2、小麥DREB1A/acc1三個(gè)轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行對量分析。胡佳瑩等[40]以轉(zhuǎn)基因玉米MON863混合樣品為例建立了基于單重和雙重cdPCR體系的轉(zhuǎn)基因樣品含量分析方法。ddPCR在實(shí)際應(yīng)用方面更為廣泛,已在玉米[41-44]、水稻[45-46]、大豆[42,47]、深加工產(chǎn)品[48-49]中的轉(zhuǎn)基因成分定量檢測中進(jìn)行驗(yàn)證。另一方面,dPCR特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好,是良好的計(jì)量平臺。常被用作評估質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品以及其他標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因成分拷貝數(shù)比例[50-53]。數(shù)字PCR作為最新的絕對定量方法能準(zhǔn)確定量單分子目標(biāo)DNA,可以說該方法的出現(xiàn),有效彌補(bǔ)了熒光定量PCR方法在定量檢測方面高度依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及擴(kuò)增效率不一致等不足,為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測限量或閾值設(shè)定提供了新的度量標(biāo)尺[54]。

但是,當(dāng)前的數(shù)字PCR技術(shù),無論是微滴還是芯片,由于內(nèi)部設(shè)計(jì)精密和復(fù)雜的特征導(dǎo)致其每次檢測成本極其昂貴,長期大規(guī)模使用費(fèi)用太高,非一般實(shí)驗(yàn)室或者公司能夠承受,這也是該方法不能普及的最主要限制因素。相信未來隨著技術(shù)的不斷更新,低成本的數(shù)字PCR產(chǎn)品被開發(fā)出來,應(yīng)用范圍會越來越廣泛。

2 酶聯(lián)免疫吸附法在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測中的應(yīng)用

酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)是以抗原、抗體為基礎(chǔ)的免疫學(xué)方法,通過特異性檢測外源蛋白來定性、定量檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。該方法借助于酶標(biāo)儀可根據(jù)已知標(biāo)注物質(zhì)的一系列濃度梯度與吸光度值來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,以此確定樣品中轉(zhuǎn)基因蛋白的含量,但只能達(dá)到半定量檢測的水平[55]。Roland等[56]早在1992年就將ELISA技術(shù)用于轉(zhuǎn)基因植物中nptII基因表達(dá)產(chǎn)物的定量分析。白衛(wèi)濱等[57]以抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆為材料,建立了檢測表達(dá)CP4EP-SPS蛋白的ELISA定量方法。Kim等[58]采用ELISA檢測技術(shù)對轉(zhuǎn)基因胡椒中外源基因不同時(shí)間表達(dá)效率進(jìn)行了定量比較研究。Kamle以及王新桐等分別針對轉(zhuǎn)基因棉花Bt基因表達(dá)蛋白和nptII基因表達(dá)蛋白建立了雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附定量檢測方法[59-60]。

ELISA法具備酶反應(yīng)的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的特異性,同時(shí)還可以與PCR相結(jié)合,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)記探針進(jìn)行雜交,再與抗體特異性結(jié)合,并使底物顯色,可以根據(jù)吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行半定量分析,具有操作簡單,費(fèi)用低、特異性好,可實(shí)現(xiàn)高通量檢測的優(yōu)點(diǎn)。但ELISA法本身易出現(xiàn)本底過高,以及如保溫時(shí)間的差異、洗滌方法不同等相關(guān)因素都有可能導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差,在實(shí)際操作中只能檢測有限種類未加工的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品[61]。

3 討論與展望

轉(zhuǎn)基因生物的安全性管理是一個(gè)全球性的問題,特別是隨著經(jīng)濟(jì)全球化和國際貿(mào)易的不斷發(fā)展,各個(gè)國家和地區(qū)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的閾值范圍、標(biāo)識方式等管理制度上的差異已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品國際貿(mào)易中最主要的技術(shù)貿(mào)易壁壘之一[54]。因此,如何精確地對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定量,在國際上推行統(tǒng)一含義的閾值,是許多國際組織努力的目標(biāo)[62]。從定量的角度來看,基于外源蛋白質(zhì)檢測方法由于缺乏成熟轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的內(nèi)源蛋白作對照,不能精確測定轉(zhuǎn)基因含量[63],此外,蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上檢測方法存在操作繁瑣、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn),比如說轉(zhuǎn)基因深加工產(chǎn)品,由于經(jīng)過高溫,外源蛋白在加工過程中容易失活或分解,造成檢測結(jié)果假陰性概率大大增加。因此以核酸為靴標(biāo)的檢測技術(shù)成為定量轉(zhuǎn)基因成分檢測的主要研究和使用的方法[64-65]。

PCR方法是目前最準(zhǔn)確的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物檢測的方法[66-68],定量PCR方法經(jīng)歷了競爭性定量PCR到熒光定量PCR以及現(xiàn)如今數(shù)字PCR的過程,其中競爭性定量PCR從嚴(yán)格意義上講是一種半定量的方法,雖然對實(shí)驗(yàn)儀器的要求不高,但實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵技術(shù)需要利用基因重組技術(shù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)競爭DNA,每次檢測需要多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品作對照[61],既不適合檢測高通量的樣品,同時(shí)對于一般實(shí)驗(yàn)室來說有很大難度。熒光定量PCR技術(shù)作為目前現(xiàn)行的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量的核心技術(shù)而被廣泛使用[70-71]。但是也不能忽視其方法應(yīng)用的限制,該方法主要是依靠參照標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行拷貝數(shù)定量分析[72],僅能實(shí)現(xiàn)相對定量分析,這就必然會受到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)發(fā)展以及質(zhì)量評估建立滯后的限制[73],另外,熒光定量PCR對DNA模板純度和PCR抑制因子等因素很敏感,在復(fù)雜體系中會導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確[72],定量分析通量較低[48]。此外,實(shí)時(shí)定量PCR的定量并不夠直接,它一般需要標(biāo)準(zhǔn)曲線來將含量轉(zhuǎn)化為絕對的濃度,而這些濃度不同實(shí)驗(yàn)室間不確定度較大。實(shí)時(shí)定量PCR也難以檢測那些微小的拷貝數(shù)目變化,靈敏度有限[74]。數(shù)字PCR不像熒光定量PCR技術(shù)需要全程收集熒光信號,而是分成兩部分,前期PCR擴(kuò)增和后期熒光信號分析,即在PCR終點(diǎn)進(jìn)行熒光信號的檢測和計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì),整個(gè)過程既不依賴擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值,也不需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的參與便可實(shí)現(xiàn)絕對定量檢測,避免了因?yàn)閺?fù)雜樣品與純的標(biāo)準(zhǔn)品之間核酸提取效率和擴(kuò)增效率不一致而引起的偏差[48,50,75];同時(shí)數(shù)字PCR將傳統(tǒng)PCR指數(shù)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號,能減小普通定量PCR反應(yīng)的影響因素[50,76],對樣品DNA純度的要求更低[38];靈敏度和重復(fù)性相對普通定量PCR都有較大提高[38,77-80]。

綜上所述,轉(zhuǎn)基因生物安全不斷拔高的關(guān)注度以及閾值管理的不斷完善直接推動著轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)由半定量到精確定量、絕對定量,檢測效率及自動化程度越來越高。現(xiàn)階段,熒光定量PCR技術(shù)在國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測方法中仍然占主導(dǎo)地位,但是隨著全球已商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物逐年增加,部分制定的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)根本無法完全覆蓋到所有的轉(zhuǎn)基因作物品系,對于一些已研制出來即將通過安全認(rèn)證的轉(zhuǎn)基因新品種的檢測,更是缺乏相關(guān)的序列信息和相關(guān)技術(shù)規(guī)程。因此,相對于轉(zhuǎn)基因新品種及轉(zhuǎn)化事件的不斷增多,其針對性的背景信息收集和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的發(fā)展則顯得格外重要。另一方面,數(shù)字PCR在已經(jīng)報(bào)道的轉(zhuǎn)基因定量檢測研究中表現(xiàn)出更高的靈敏度和穩(wěn)定性,是未來轉(zhuǎn)基因定量檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢。

[1]Kramkowska M,Grzelak T,Czyz·ewska K. Benefits and risks associated with genetically modified food products[J]. Annals of Agricultural and Environmental Medicine,2013,20(1):413-419.

[2]Qaim M,Kouser S. Genetically Modified Crops and Food Security[J]. Plos One,2013,8(6):1-7.

[3]James C. Global Status of Commercialised Biotech/GM Crops:2013. ISAAA Briefs No. 46.

[4]張忠民. 歐盟轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識制度淺析[J].世界經(jīng)濟(jì)與政治論壇,2007(6):80-83.

[5]Mayer R. Development and application of DNA analytical methods for the detection of GMOs in food[J]. Food Control,1999,10:391-399.

[6]金蕪軍,賈士榮,彭于發(fā).不同國家和地區(qū)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識管理政策的比較[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2004,12(1):1-7.

[7]盧長明.我國實(shí)施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量標(biāo)識的對策與建議[J].科技導(dǎo)報(bào),2011,29(24):11.

[8]Gilliland G,Perrin S,Bunn HF,et al. Analysis of cytokine mRNA and DNA:detection and quantition by competitive polymerase chain reaction[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:2725.

[9]Studer E,Rhyner C,Lüthy J,et al. Quantitative competitive PCR for the detection of genetically modified soybean and maize[J]. Eur Food Res Technol,1998,207:207-213.

[10]Hardegger M,Brodmann P,Herrmann A. Quantitative detection of the 35S promoter and the NOS terminator using quantitative competitive PCR[J]. Eur Food Res Technol,1999,209:83-87.

[12]Mavropoulou AK,Koraki T,Ioannou PC,et al. High-throughput double quantitative competitive polymerase chain reaction for determination of genetically modified organisms[J]. Anal Chem,2005,77(15):4785-4791.

[13]Kalogianni DP,Elenis DS,Christopoulos TK,et al. Multiplex quantitative competitive polymerase chain reaction based on a multianalyte hybridization assay performed on spectrally encoded microspheres[J]. Anal Chem,2007,79:6655-6661.

[14]蘇長青,謝家建,王奕海,等.轉(zhuǎn)基因水稻Bt汕優(yōu)63的整合結(jié)構(gòu)和品系特異性定量PCR方法[J].農(nóng)業(yè)生物術(shù)學(xué)報(bào),2011,19(3):434-441.

[15]Broeders S,Huber I,Grohmann,L,et al. Guidelines for validation ofqualitative real-time PCR methods[J]. Trends Food Sci Tech,2014,37(2):115-126.

[16]朱建楚,胡銀崗,奚亞軍,等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在檢測外源基因拷貝數(shù)中的應(yīng)用[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2005,14(6):78-82.

[17]Vaitilingom M,Pijnenburg H,Gendre F,et al.Real-time quantitative PCR detection of genetically modified Maximizer maize and Roundup Ready soybean in some representative foods[J]. J Agric Food Chem,1999,47(12):5261-5266.

[18]于曉帆,高宏偉,孫敏,等.熒光PCR和數(shù)字PCR法檢測轉(zhuǎn)基因DAS-44406-6品系大豆[J].食品科學(xué),2016,37(16):235-241.

[19]孫紅煒,李凡,楊淑珂,等.轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的定量檢測中國農(nóng)學(xué)通報(bào)[J].2014(6):101-107

[20]張麗,劉麗麗,梁曉聲,等.實(shí)時(shí)定量PCR鑒定轉(zhuǎn)基因作物純合體[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2015(1):43-46.

[21]蘇慧慧,李濤,謝雯琦,等. 基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR對轉(zhuǎn)基因櫻桃番茄外源基因拷貝數(shù)的檢測[J]. 分子植物育種,2015(2):345-354.

[22]甄貞,段俊枝,于艷波,等.轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1外源基因拷貝數(shù)的確定[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,45(4):19-22.

[23]汪秀秀,楊捷琳,宋青,等. 轉(zhuǎn)基因棉花GHB119 品系特異性定量PCR檢測方法的建立[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2014,22(3):380-388.

[24]許蘭珍,何永睿,雷天剛,等.轉(zhuǎn)基因柑橘外源基因拷貝數(shù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測[J].園藝學(xué)報(bào),2016,43(6):1186-1194.

[25]焦新萍,曾金紅,鄭云峰,等.發(fā)酵豆制品中轉(zhuǎn)基因成分的熒光定量PCR研究[J].食品研究與開發(fā),2013(13):79-83.

[26]張文志,魯緋,閆紅.醬油中抗草甘膦大豆轉(zhuǎn)基因多種成分的檢測:實(shí)時(shí)熒光定量PCR和傳統(tǒng)PCR的比較[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(6):372-376.

[27]許安君.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在糧油轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用[J].糧油食品科技,2013,21(2):68-70.

[28]袁建琴,趙江河,史宗勇,等.動物飼料中轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆GTS40-3-2成分的檢測[J].大豆科學(xué),2016(2):295-300.

[29]Cottenet G,Blancpain C,Sonnard V,et al. Development and validation ofa multiplex real-time PCR method to simultaneously detect 47 targets forthe identification of genetically modified organisms[J]. Anal Bioanal Chem,2013,405(21):6831-6844.

[30]Pansiot J,Chaouachi M,Cavellini L,et al. Development of two screening duplex PCR assays for genetically modified organism quantification using multiplex real-time PCR master mixes[J]. Eur Food Res Techno1,2011,232(2):327-334.

[31]Samson M C,Gulli M,Marmiroli N. Multiplex real-time PCR assays for simultaneous detection of maize MON8IO and GA21 in food samples[J]. Food Control,2013,30(2):518-525.

[32]汪秀秀. 基于鎖核酸技術(shù)轉(zhuǎn)基因棉花多重PCR定量檢測方法的研究以及標(biāo)準(zhǔn)分子的研制和驗(yàn)證[D].上海:華東理工大學(xué),2014.

[33]Sanders R,Huggett JF,Bushell CA,et al. Evaluation of digital PCR for absolute DNA quantification[J]. Anal Chem,2011,83(17):6474-6484.

[34]Pinheiro L B,Coleman V A,Hindson C M,et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification[J]. Analytical Chemistry,2012,84(2):1003-1011.

[35]李春勇. 數(shù)字PCR技術(shù)原理及應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)世界,2014(11):10-13.

[36]Margulies M,Egholm M,Altman WE.Genome Sequencing in Open Microfabricated High Density Picoliter Reactors[J]. Nature,2005,437(7057):376-380.

[37]Tawfik DS,Griffiths AD.Man-made cell-like compartments for molecular evolution[J]. Nature Biotechnology,1998,16:652-656.

[38]Burns M J,Burrell A M,Foy C A.The applicability of digital PCR for the assessment of detection limits in GMO analysis[J]. European Food Research and Technology,2010,231(3):353-362.

[39]Pérez Urquiza M,Acatzi Silva AI. Copy number ratios determined by two digital polymerase chain reaction systems in genetically modified grains[J]. Metrologia,2014,51(1):61-66.

[40]胡佳瑩,姜羽,楊立桃.利用QuantStudioTM 3D數(shù)字PCR分析轉(zhuǎn)基因玉米MON863含量[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2016(8):1216-1224.

[41]Dobnik D,Spilsberg B,Bogo?alec A,et al. Multiplex quantification of twelve EU authorized GM maize lines with droplet digital PCR[J]. Anal Chem,2015,87(16):8218-8226.

[42]K?ppel R,Bucher T. Rapid establishment of droplet digital PCR for quantitative GMO analysis[J]. Eur Food Res Tech,2015,241(3):1-13.

[43]潘廣,章桂明,黃新,等.應(yīng)用雙重?cái)?shù)字PCR對轉(zhuǎn)基因玉米成分進(jìn)行定量方法研究[J]. 植物檢疫,2016(3):65-71.

[44]姜志軍,江穎,徐搖光,等.利用微滴數(shù)字PCR方法快速分析轉(zhuǎn)基因玉米中外源基因的拷貝數(shù)[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展,2016,6(4):288-294.

[45]任怡菲,高琴,鄧婷婷,等.基于數(shù)字 PCR 的轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系精準(zhǔn)定量檢測方法建立[J]. 生物技術(shù)通報(bào),2016,32(8):69-76.

[46]姜羽,胡佳瑩,楊立桃.利用微滴數(shù)字PCR分析轉(zhuǎn)基因生物外源基因拷貝數(shù)[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2014,22(10):1298-1305.

[47]于曉帆,高宏偉,孫敏,等.熒光PCR和數(shù)字PCR法檢測轉(zhuǎn)基因DAS-44406-6品系大豆[J].食品科學(xué),2016(16)235-240.

[48]Morisset D,Stebih D,Milavec M,et al.Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR[J].PLoS One,2013,8:e62583.

[49]Baker M. Digital PCR hits its stride[J]. Nature Methods,2012,9(6):541-544.

[50]Bhat S,Herrmann J,Armishaw P,et al. Single molecule detection in nanofluidic digital array enables accurate measurement of DNA copy number[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2009,394(2):457-467.

[51]Philippe C,Somanath B,Lina P,et al.Absolute quantificationof genetically modified MON810 maize(Zea mays L.)by digital polymerase chain reaction[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2010,396:2143-2150.

[52]隋志偉,余笑波,王晶,等. 轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制[J].計(jì)量學(xué)報(bào),2013,33(5):467-471.

[53]Urquiza M P,Silva A A. Copy number ratios determined by two digital polymerase chain reaction systems in genetically modified grains[J]. Metrologia,2014,51:61-66.

[54]劉津,劉二龍,謝力,等.數(shù)字PCR在食品安全檢測領(lǐng)域的研究應(yīng)用進(jìn)展[J].食品科學(xué),2016,37(17):275-280.

[55]Engvall E,Jonsson K,Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay.II.Quantitative assay of protein antigen immunoglobulin G,by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes[J].Biochim Biophys Acta,1973,28:251,427-434.

[56]Roland JN,John MM,Robert GB. Evaluation of an ELISA assay for rapid detection and quantification of neomycin phosphotransferase II in transgenic plants[J].Plant Molecular Biology Rep,1992,10:263-272.

[57]白衛(wèi)濱,孫建霞,姜桂傳,等. ELISA方法定量檢測轉(zhuǎn)基因大豆及其產(chǎn)品的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33(11):103-106.

[58]Kim HJ,Lee SM,Kim JK,et al. Expression of PAT and NPT II proteins during the developmental stages of a genetically modified pepper developed in Korea[J]. J Agric Food Chem,2010,58(20):10906-10910.

[59]Kamle S,Ojha A,Kumar A. Development of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of Bt protein in transgenic cotton[J]. Method Mol Boil,2013,958:131-138.

[60]王新桐,孫佳芝,高麗麗,等.轉(zhuǎn)基因棉花中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTⅡ)雙抗體夾心ELISA定量檢測方法的建立[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2014,22(3):372-379.

[61]龔宏偉. 轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測前沿技術(shù)及應(yīng)用[J]. 甘肅農(nóng)業(yè),2010(12):34-35.

[62]厲建萌,宋桂文,劉信,等. 淺談轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品閾值管理[J]. 農(nóng)業(yè)科技管理,2009,28(3):29-32.

[63]柴曉芳,趙宏偉,肖長文. 淺析轉(zhuǎn)基因作物檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 種子世界,2012(11):15-17.

[64]林清,彭于發(fā),吳紅,等.轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,22(2):513-517.

[65]張瑩,張永軍,吳孔明,等.轉(zhuǎn)基因植物的檢測策略和檢測技術(shù)[J].植物保護(hù),2007,33(1):11-14.

[66]Holst-Jensen A. Testing for genetically modified organisms(GMOs):Past,present and future perspectives[J]. Biotechnol Adv,2009,27:1071-1082.

[67]Querci M,Van den Bulcke M,Zel J,et al. New approaches in GMO detection[J].Anal Bioanal Chem,2010,396:1991-2002.

[68]Michelini E,Simoni P,Cevenini L,et al. New trends in bioanalytical tools for thedetection of genetically modified organisms:an update[J]. Anal Bioanal Chem,2008,392:355-367.

[69]王廣印,范文秀,陳碧華,等. 轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展Ⅰ.主要檢測技術(shù)及其特點(diǎn)[J]. 食品科學(xué),2008,29(10):698-705.

[70]Michelini E,Simoni P,Cevenini L,et al. New trends in bioanalytical tools for the detection of geneticallymodified organisms:an update[J].Anal Bioanal Chem,2008,392:355-367.

[71]Elenis DS,Kalogianni DP,Glynou K,Ioannou PC,Christopoulos TK. Advances in molecular techniques for the detection and quantification of genetically modified organisms[J]. Anal Bioanal Chem,2008,392:347-354.

[72]Cankar K,Stebih D,Dreo T,et al. Critical points of DNA quantification by Real-time PCR-effects of DNA extraction method and sample matrix on quantification of genetically modified organisms[J]. BMC Biotechnology,2006,6(1):37.

[73]Emons H. GMO analysis-a complex and challenging undertaking[J].Anal Bioanal Chem,2010,396:1949-1950.

[74]Perkel JM.The Digital PCR Revolution. Science[J]. Science,2014,344(6180):212-214.

[75]Corbisier P,Bhat S,Partis L,et al. Absolute quantification of genetically modified MON8IO maize(Zea mays L)by digital polymerase chain reaction[J].Anal Bioanal Chem,2009,10:3200-3207.

[76]Rebecca S,Jim FH,Claire AB,et al. Evaluation of digital PCR for absolute DNA quantification[J]. Anal Chem,2011,10:1021.

[77]Lun F M,Chiu R W,Chan K C,et al. Microfluidics digital PCR reveals a higher than expected fraction of fetal DNA in maternal plasma[J].Clin Chem,2008,54:1664-1672.

[78]Qin J,Jones R C,Ramakrishnan R. Studying copy number variations using a nanofluidic platform[J]. Nucleic Acids Res,2008,26.

[79]Whale A S,Cowen S,Foy C A,et al. Methods for applying accurate digital PCR analysis on low copy DNA samples[J]. PLoS One,2013,8(3):1-10.

[80]Demeke T,Gr?fenhan T,Holigroski M,et al. Assessment of droplet digital PCR for absolute quantification of genetically engineered OXY235 canola and DP305423 soybean samples[J]. Food Control,2014,46:470-474.

Development of quantitative detection techniques of genetically modified organisms

DU Zhi-xin1,2,JIAO Yue3,ZHANG Liang-liang4,ZHU Peng-yu1,FU Wei1,*

(1.The Institute of Plant Quarantine,Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100029,China;2.Guangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanning 530021,China;3.Science and Technology Development Center,MOA,Beijing 100125,China;4.Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Haikou 570311,China)

The concern of public has been more and more focus on the safety of the Genetically Modified Organisms(GMO)as the rapid development of transgenic techniques and uncertain effect to human beings and environment. Different countries and organizations have declared kinds of safety and labeling laws to achieve the proper regulation to the commercialization of the GM products. In this manner,the achievement of stable and accurate quantitation of GMO content within different kinds of commercialized product has become the key point of the development of GMO detection techniques. In this paper,the application and development of different quantitative detection methods were summarized,such as competitive PCR,real-time PCR,digital PCR and etc. Meanwhile,the advantages and drawbacks of different detection methods were discussed and the future of the quantitative detection methods in the area of GMO content quantitation were predicted.

transgenic;quantitative detection;PCR;digital PCR

2016-10-18

杜智欣(1980-),男,博士,農(nóng)藝師,研究方向:轉(zhuǎn)基因生物安全,E-mail:57204302 @qq.com。

*通訊作者:付偉(1983-),女,博士,副研究員,研究方向:轉(zhuǎn)基因生物安全,E-mail:fuwei0212@163.com。

TS201.2

A

1002-0306(2017)10-0379-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.065