miR-96的表達對肝細胞癌細胞遷移和侵襲的影響

趙新陽，肖朝文，鄭小林，蔡常春

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院 肝膽胰外科，湖北 武漢 430014）

在全球范圍內(nèi)，肝細胞癌（HCC）是種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率男多于女，據(jù)2012年數(shù)據(jù)統(tǒng)計，有約782500新診斷HCC病例，745500例HCC死亡病例[1]。HCC尤以東亞、東南亞、北非和西非高發(fā)，僅中國就占了一半病例。HBV、HCV和黃曲霉毒素都是HCC的常見致病因素。得益于HCC綜合治療的進步，5年生存率已由12%～20%上升至35%～50%。但轉移與復發(fā)仍是影響HCC預后的主要因素。深入研究HCC的遷移和侵襲機制，對提高HCC診治水平有重要的意義。小分子核糖核酸（miRNA）是一類非編碼RNA，長度約19～22 nt[2]，其通過在轉錄后水平與mRNA結合而靶向下調(diào)靶基因的表達[3]，廣泛參與增殖、凋亡、侵襲、轉移等腫瘤生物學過程[4]。miR-96定位于染色體7q32.2[5]，在乳腺癌[6]、非小細胞肺癌[7]、腎細胞癌[8]、甲狀腺癌[9]、膀胱癌[10]等腫瘤中的作用已見報道，但miR-96對HCC細胞遷移和侵襲的影響，尚未見報道，本研究在體外探討miR-96對HCC細胞遷移和侵襲的影響，及其可能的機制。

1　材料與方法

1.1　材料

人HCC細胞系HepG2、7721、huh7及正常肝組織細胞系L02購自中國醫(yī)學科學院，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清及胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，TriZol購自美國BD公司，實驗所需一抗購自美國BD公司，二抗購自美國Invitrogen公司，miR-96模擬物（miR-96 mimics）及抑制物（miR-96 inhibit）均由廣州銳博生物科技公司合成，Lipofectamine 2000 轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司。miR-96模擬物序列：5′-UUU GGC ACU AGC ACA UUU UUG C-3′，miR-96抑制物序列：5′-GCA AAA AUG UGC UAG UGC CAA A-3′。

1.2　細胞培養(yǎng)、轉染及分組

在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下，將HepG2、7721、huh7及L02細胞系培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞分成3組，陰性對照組、miR-96模擬物組及miR-96抑制物組，采用Lipofectamine 2000分別轉染miRNA隨機序列、miR-96模擬物和miR-96抑制物，轉染濃度為20 nmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h行細胞劃痕和Transwell實驗。

1.3　RNA提取和熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測

1.3.1miR-96相對表達量測定按TRIZol reagent說明書，從培養(yǎng)細胞中提取總RNA，然后按照TaqMan RNA reverse transcription kit（ABI，USA）說明書，從5 ng的總RNA逆轉錄合成cDNA。在ABI 7500實時定量PCR儀中，以U6小核RNA作為內(nèi)參，U6序列正義鏈：5′-GTG CTC GCT TCG GCA GCA CATA T-3′，反義鏈：5′-AAA AAT ATG GAA CGC TTC ACG AA-3′；miR-96正義鏈：5′-TGG CCG ATT TTG GCA CTA GC-3′，反義鏈：5′-TTT CCC ATA TTG GCA CTG-3′。使用 2-ΔΔCt方法定量，計算 miR-96的相對表達量。

1.3.2PTPN9 mRNA相對表達量檢測提取細胞總RNA后，用AMV reverse transcriptase反轉錄為 cDNA，按 95 ℃5 min，隨后 95 ℃30 s、55 ℃30 s、 72 ℃30 s，共40個循環(huán)。PTPN9正義鏈：5′-CCT GCC TTA GAC TGG GAC T-3′，反義鏈：5′-TTC GCT TTG TTA GCT TCA CT-3′；GAPDH正義鏈：5′-CGA GCC ACA TCG CTC AGA CA-3′，反義鏈：5′-GTG GTG AAG ACG CCA GTG GA-3′。以 GAPDH 為內(nèi)參，使用 2?ΔΔCt方法定量，計算公式：ΔΔCT=（CT PTPN9-CT GAPDH）實驗組-（CT PTPN9-CT GAPDH）對照組，計算PTPN9 mRNA的相對表達量。

1.4　細胞劃痕實驗

將陰性對照組、miR-96模擬物組及miR-96抑制物組的HepG2細胞用RPMI-1640（含有10%胎牛血清）培養(yǎng)在六孔板上，待融合后，用Tips槍頭劃直線，劃痕后0～24 h，用反轉的Olympus IX50顯微鏡通過10×物鏡和Image-Pro Plus軟件捕獲測量劃痕面積，計算劃痕愈合率，劃痕愈合率越高，表示遷移能力越強。

1.5　Transwell細胞侵襲實驗

陰性對照組、miR-96模擬物組及miR-96抑制物組的HepG2細胞各取2×103個細胞，種在Transwell小室的碳酸磷脂表面，上室BioCoat TM包被Matrigel基質(zhì)膠，37 ℃培養(yǎng)24 h。取出上層小室，將膜下面的細胞與1%多聚甲醛混合，用0.2%結晶紫溶液染色15 min。在200倍視野下計算穿膜細胞數(shù)，隨機取10個視野，計算平均值。實驗重復3次，取平均值。

1.6　Western blot

培養(yǎng)24 h后消化細胞，取細胞總蛋白，蛋白變性、上樣，每泳道上樣量為50 μg蛋白。50 V、100 mA電泳2 h結束后，PVDF膜轉膜。脫脂奶粉液封閉2 h。TBS清洗，分別加入PTPN9一抗（1:200）、GAPDH一抗（1:200），二抗?jié)舛?:1000，ECL顯影。測量條帶的灰度值。目的蛋白的相對數(shù)值=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.7　統(tǒng)計學處理

采用Graphpad 6.0統(tǒng)計作圖軟件，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組均數(shù)采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1　miR-96在HCC細胞及正常肝細胞系中的表達

熒光定量PCR結果示，miR-96在HCC細胞系HepG2、huh7、7721細胞系相對表達量分別為7.1±0.63、4.8±0.31、3.9±0.23，均明顯高于正常肝細胞系L02的相對表達量（1.1±0.15），差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）（圖1）。

圖1　miR-96在HCC和正常肝細胞系中的表達Figure 1　The miR-96 expressions in HCC cell lines and normal hepatic cell line

2.2　轉染效率檢測

轉染HepG2細胞24 h后，設陰性對照組為miR-96的表達量1.0，模擬物組miR-96的相對表達量為6.0±0.3，miR-96抑制物組為0.20±0.09，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）（圖2）。

圖2　不同轉染組HepG2細胞miR-96的表達Figure 2　The miR-96 expressions in different transfection groups of HepG2 cells

2.3　miR-96對HCC細胞遷移與侵襲的影響

細胞劃痕實驗示，陰性對照組細胞劃痕愈合率為（53.47±4.39）%，而miR-96模擬物組細胞劃痕愈合率為（74.73±5.63）%，miR-96抑制物組細胞劃痕愈合率為（24.38±3.74）%，前者劃痕愈合率明顯高于陰性對照組，后者劃痕愈合率明顯低于陰性對照組（P＜0.05）（圖3A-B）。

細胞侵襲實驗示，200倍視野下，陰性對照組侵襲細胞數(shù)為（329±13）個，而miR-96模擬物組侵襲細胞數(shù)為（548±18）個，miR-96抑制物組侵襲細胞數(shù)為（179±9）個，前者侵襲細胞數(shù)明顯多于陰性對照組，后者侵襲細胞數(shù)明顯少于陰性對照組（P＜0.05）（圖3C）。

圖3　miR-96對HCC細胞遷移與侵襲的影響　A-B：細胞劃痕實驗結果；C：侵襲實驗結果Figure 3　Influences of miR-96 on migration and invasion of HCC cells　A–B: Results of wound scratch assay; C: Results of Transwell assay

2.4　miR-96對HCC細胞PTPN9表達的影響

qRT-PCR結果：設陰性對照組PTPN9 mRNA表達量為1.0，miR-96模擬物組PTPN9 mRNA相對表達量為0.32±0.04，miR-96抑制物組PTPN9 mRNA為5.32±0.13，前者明顯降低，后者明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖4A）。

Western blot結果：設陰性對照組PTPN9蛋白表達量為1.0，miR-96模擬物組PTPN9蛋白相對表達量為0.36±0.03，miR-96抑制物組PTPN9蛋白相對表達量為3.42±0.24，前者明顯降低，后者明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖4B-C）。

圖4　miR-96對HCC細胞PTPN9表達的影響　A：qRT-PCR結果；B-C：Western blot結果Figure 4　Influences of miR-96 on PTPN9 expression in HCC cells　A: Results of qRT-PCR; B–C: Results of Western blot

3　討　論

HCC是種高度惡性的腫瘤，雖然手術仍是治療HCC的最有效方法，據(jù)日本對148161例大宗HCC切除術后隨訪報道[11]指出，術后5年生存率由1978—1980年間的5.1%上升到2001—2005年間的42.7%，但肝切術后預后仍較差。轉移與復發(fā)仍是影響HCC預后的主要因素。腫瘤的發(fā)生與進展是個涉及到一系列分子突變或異常表達的結果，比如miRNA[12-15]、P16、P53[16]、轉化生長因子β[17]等。

miR-96在腫瘤中所起的作用不盡相同。在甲狀腺癌細胞中，外源性過表達miR-96，促進了K1和TPC1細胞系增殖和克隆形成能力，并抑制凋亡；反之，下調(diào)miR-96表達，則抑制了K1和TPC1細胞系增殖和克隆形成，并促進凋亡。熒光素酶實驗示，miR-96可與FOXO13′-UTR區(qū)域靶向結合，并下調(diào)FOXO1表達[9]。在乳腺癌細胞系中，miR-96促進細胞增殖、遷移和侵襲，并且miR-96可靶向調(diào)節(jié)PTPN9蛋白的表達，起癌基因的作用[6]。與之相反，在腎癌中，miR-96起抑癌基因的作用，對高侵襲能力的細胞系Caki-1和低侵襲潛能的細胞系786-O轉染miR-96抑制物后，侵襲能力增加，而轉染miR-96模擬物后侵襲能力降低[8]。Yu等[18]報道m(xù)iR-96直接靶向結合K-ras癌基因，抑制胰腺癌細胞遷移和侵襲，并減慢腫瘤生長速度。Vishuamitra等[19]報道m(xù)iR-96抑制漸變性淋巴瘤細胞增殖、克隆形成和遷移能力。表明在不同的腫瘤中，miR-96所起的作用可能完全不同。

蛋白酪氨酸磷酸酶（proteintyrosine phosphatases，PTPs）是細胞發(fā)揮生物學功能的關鍵分子之一，其表達異常常與腫瘤的發(fā)生密切相關[20]。PTPN9是PTPs家族中的一員，其通過對ErbB2和信號轉導及轉錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）脫磷酸化，進而沉默ErbB和STAT3信號通路而發(fā)揮抑癌作用[21-23]。在乳腺癌中，PTPN9在癌組織中低表達，且抑制乳腺癌的增殖和侵襲[6]。

在HCC體外實驗中，本研究發(fā)現(xiàn)miR-96較正常肝臟細胞系L02高表達，通過向HepG2細胞系轉染miR-96模擬物，發(fā)現(xiàn)劃痕愈合率顯著高于陰性對照組，侵襲細胞數(shù)顯著多于陰性對照組；反之，轉染miR-96抑制物后，劃痕愈合率顯著低于陰性對照組，侵襲細胞數(shù)顯著少于陰性對照組，表明miR-96促進HCC細胞的遷移和侵襲，其促癌基因的作用，這與甲狀腺癌、乳腺癌中的結果一致，而與腎癌、胰腺癌及間變性淋巴瘤[19]中的結果相反。

miR-96分子為PTPN9的上游分子，通過熒光素酶實驗，Hong等[6]發(fā)現(xiàn)miR-96可靶向結合PTPN9，并下調(diào)其表達，進而促進乳腺癌的增殖和侵襲。Hu等[24]在HCC中報道PTPN9在HCC組織中低表達，并且PTPN9下調(diào)表達與HCC預后差相關，下調(diào)PTPN9表達促進HCC細胞系增殖，并抑制其凋亡。本研究結果與其相似，miR-96模擬物組較陰性對照組PTPN9下調(diào)表達，反之，轉染miR-96抑制物后，PTPN9上調(diào)表達，其促進HCC細胞遷移和侵襲的機制可能與下調(diào)PTPN9的表達有關。

當然，本研究也存在一定的不足，比如，miR-96在HCC組織中的表達及HCC細胞的增殖和凋亡的影響如何，在動物實驗中結果如何，還需進一步研究和探討。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)miR-96在HCC細胞系中高表達，且miR-96上調(diào)表達可促進HCC細胞遷移和侵襲，miR-96的上調(diào)表達可下調(diào)PTPN9的表達，miR-96在HCC發(fā)生過程中起促癌基因的作用，有可能成為一個新的治療靶點。

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