肝癌患者CD8+CD28-Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化及意義

方大正，吳紅偉，武倫，萬(wàn)光俊，沈豐

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院 肝膽外科，湖北 十堰 442000）

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）在T細(xì)胞亞群中具有重要免疫調(diào)節(jié)功能，它可以改變機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境，和腫瘤細(xì)胞免疫逃逸與腫瘤形成密切相關(guān)[1]。目前，較為常用的特異性檢測(cè)Tregs分子表面標(biāo)記物的是CD8和CD28，基于CD8+CD28-Tregs的免疫活性調(diào)節(jié)，已成為目前腫瘤如黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌等免疫研究的熱點(diǎn)[2-3]。但其在肝細(xì)胞癌（以下簡(jiǎn)稱肝癌）臨床分期、分化程度等方面報(bào)道不一[4]。叉狀頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（forkhead/winged helix transcription factor，F(xiàn)oxp3）在胸腺和外周血CD8+CD28-Tregs中特異性表達(dá)，抑制機(jī)體增殖與活化腫瘤特異性T效應(yīng)細(xì)胞，與機(jī)體荷瘤時(shí)的免疫抑制狀態(tài)有關(guān)[5]。在T細(xì)胞亞群中，CD4+CD25+Tregs具有免疫負(fù)調(diào)控功能，在原發(fā)性肝癌患者中已有研究[6]。而CD8+CD28-Foxp3+Tregs在肝癌患者外周血中和腫瘤組織中研究較少[7]，本研究檢測(cè)肝癌患者外周血和腫瘤組織中CD8+CD28-Foxp3+Tregs的水平，探討其與肝癌的關(guān)系?；谏鲜稣J(rèn)識(shí)，本研究應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析肝癌患者外周血Treg細(xì)胞表面標(biāo)記，觀察肝癌和癌旁組織中CD8+CD28-Foxp3+Tregs的差異性，旨在為肝癌的免疫性治療提供可能的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　研究對(duì)象外周血標(biāo)本

72例肝癌標(biāo)本均為湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院肝膽外科2014—2016年經(jīng)術(shù)后病理確診標(biāo)本，術(shù)前均未經(jīng)過(guò)放、化療處理，術(shù)前取外周血；其中男51例，女21例；年齡41～72歲，平均（49.8±9.5）歲。72例肝癌標(biāo)本按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟（International Union Against Cancer，IUCC）分期標(biāo)準(zhǔn)，高分化肝癌29例患者，中分化肝癌25例，低分化肝癌18例。22名正常對(duì)照者為同期我院健康體檢中心志愿者外周血，其中男15例，女7例；年齡43～70歲，平均（48.6±9.2）歲，對(duì)照組均無(wú)急、慢性疾病史。兩組均知情同意。

1.2　主要試劑和儀器

人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T-reg）檢測(cè)試劑盒包括：抗CD8-PE、CD28-FITC、Foxp3-PE、IgG1-PE、IgG1-FITC等購(gòu)于美國(guó)BD公司；溶血素羊抗人Foxp3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld biotechnology公司（工作濃度1:200），即用型免疫組化兔抗羊二抗和3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司；溶血儀、FACS流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.3　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD8+CD28-Fo xp3+Tregs

參照文獻(xiàn)[8]，抽取入院1 d肝癌患者和健康體檢者（對(duì)照組）外周血1 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。取血標(biāo)本100 μL，分別加入IgGl-FITC、IgGl-PE、CD8-FITC、CD28-APC、Foxp3-PE各10 μL，室溫下靜置避光孵育15 min后，加紅細(xì)胞裂解液1 mL溶解紅細(xì)胞，震蕩數(shù)秒并靜置5 min后，離心1500 r/min×5 min。選取淋巴細(xì)胞群設(shè)門(mén)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Tregs，分析CD8+CD28-Foxp3+Tregs與CD8+T細(xì)胞比值。Cell Quest軟件獲取和分析數(shù)據(jù)，每個(gè)樣本檢測(cè)1×104個(gè)/次。

1.4　免疫組化檢測(cè)肝癌組織中和癌旁組織中Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞

采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)肝癌組織中和癌旁組織中Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞，嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。組織切片處理如下：常規(guī)取肝癌組織和癌旁10 cm以上組織，10%甲醛溶液固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，厚5 μm切片，脫水透明，檸檬酸鈉煮沸，微波抗原修復(fù)，山羊血清封閉，滴加一抗，羊抗人Foxp3多克隆抗體4 oC冰箱孵育過(guò)夜，次日PBS緩沖液洗滌后，滴加兔抗羊二抗，37 oC孵育30 min，PBS緩沖液洗滌，DAB顯色，鏡檢觀察染色程度，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，自來(lái)水返藍(lán)，梯度酒精脫水脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀察、攝片。Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞染色呈棕黃色或黃色顆粒，定位為胞質(zhì)。每張切片任意選取高倍鏡下5個(gè)視野，計(jì)數(shù)Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞，按照視場(chǎng)面積計(jì)算每mm3Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)由與本研究無(wú)關(guān)的2位病理醫(yī)師計(jì)算并確認(rèn)取均值。

1.5　Western blot檢測(cè)肝癌組織中和癌旁組織中Foxp3蛋白的表達(dá)

每例肝癌組織和相應(yīng)癌旁正常肝組織約100 mg，加入1 mL組織細(xì)胞裂解液，冰上剪碎并研磨組織約30 min，研制成組織勻漿，放置于1.5 mL EP管中，4 ℃、離心12000 r/min ×30 min，取上清進(jìn)行蛋白定量，蛋白濃度測(cè)定采取BCA法。100 ℃沸水煮沸變性5 min，取30 μg每個(gè)樣本的總蛋白行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，1:1000稀釋的羊抗人Foxp3多克隆抗體4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌PVDF膜3次，室溫下放入兔抗羊二抗（1:2000稀釋）孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色曝光。以β-actin作為上樣內(nèi)參照，所得結(jié)果以灰度掃描并相對(duì)定量分析，用目的蛋白條帶吸光度值/β-actin條帶吸光度值表示Foxp3蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行多組數(shù)據(jù)比較，t檢驗(yàn)比較兩組均數(shù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1　外周血CD8+CD28-Foxp3+Tregs/CD8+T細(xì)胞表達(dá)情況

流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，外周血CD8+CD28-Foxp3+Tregs/CD8+T細(xì)胞表達(dá)在肝癌患者明顯高于健康對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01），且隨著肝癌患者分化級(jí)別的降低，CD8+CD28-Foxp3+Tregs/CD8+T細(xì)胞表達(dá)逐漸升高，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

圖1　肝癌患者和健康對(duì)照人群外周血CD8+CD28-Foxp3+Tregs/CD8+T檢測(cè)結(jié)果　A：健康對(duì)照組；B：高分化肝癌組；C：中分化肝癌組；D：低分化肝癌組Figure 1　Detection of CD8+CD28–Foxp3+Tregs/CD8+T in peripheral blood of HCC patients and healthy population　A: Healthy control group; B: Well diあerentiated HCC group; C: Moderately HCC group; D: Poorly diあerentiated HCC group

2.2　CD8+CD28-Foxp3+Tregs表達(dá)與肝癌患者臨床病理因素的關(guān)系

流式細(xì)胞分析結(jié)果與肝癌患者臨床病理因素比較顯示，CD8+CD28-Fxop3+Tregs/CD8+T的表達(dá)與性別、年齡無(wú)關(guān)（均P＞0.05），與TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度有關(guān)（P＜0.05）（表1）。

表1　肝癌患者外周血CD8+CD28-Fxop3+Tregs/CD8+T與臨床病理因素的關(guān)系（%，±s）Table 1　Relations of peripheral blood CD8+CD28–Fxop3+Tregs/CD8+T with clinicopathologic factors of HCC patients(%, ±s)

表1　肝癌患者外周血CD8+CD28-Fxop3+Tregs/CD8+T與臨床病理因素的關(guān)系（%，±s）Table 1　Relations of peripheral blood CD8+CD28–Fxop3+Tregs/CD8+T with clinicopathologic factors of HCC patients(%, ±s)

因素　n　C D 8+C D 28-F o x p 3+T r e g s/C D 8+T　t 　P性別男51　8.43±1.18　0.604　0.582女21　8.39±1.20年齡（歲）≤55　39　8.41±1.32　0.862　0.427＞55　33　8.43±1.63 T N M分期I/I I　35　7.12±0.99　3.981　0.009 I I I/I V　37　8.01±7.46淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有41　8.77±1.94　4.536　0.007無(wú)31　8.16±1.67分化程度高分化　29　7.96±1.63　3.627　0.042中、低分化　43　8.78±1.76

2.3　肝癌患者病理組織Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)

在肝癌病理組織中有Foxp3陽(yáng)性表達(dá)，位于肝癌或癌旁正常組織的細(xì)胞胞質(zhì)中。癌旁組織中Foxp3平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為（7.26±1.97）個(gè)/mm2，高分化肝癌平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目為（26.02±8.34）個(gè)/mm2，中分化肝癌平均陽(yáng)性數(shù)目為（28.05±8.86）個(gè)/mm2，低分化為（31.65±8.15）個(gè)/mm2；與癌旁正常組織中Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞比較，肝癌組織中Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；但不同分化程度肝癌組織中Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。

2.4　Foxp3蛋白在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)

Foxp3蛋白在肝癌和癌旁組織中均有表達(dá)，但在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于癌旁細(xì)胞（圖3）。由圖像分析可知，與正常組Foxp3蛋白表達(dá)相比，肝癌組織中Foxp3蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；但不同分化程度的肝癌組織中Foxp蛋白表達(dá)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。

圖2　免疫組化檢測(cè)Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞（×400）　A：癌旁組織（距腫瘤邊緣5 cm）；B：高分化肝癌組織；C：中分化肝癌組織；D：低分化肝癌組織Figure 2　Immunohistochemical staining for Foxp3 positive cells (×400)　A: Tumor adjacent tissue (5 cm away from tumor tissue);B: Well diあerentiated HCC tissue; C: Moderately diあerentiated HCC tissue; D: Poorly diあerentiated HCC tissue

圖3　Western blot檢測(cè)Foxp3蛋白的表達(dá)　1：癌旁組織；2：低分化肝癌組織；3：中分化肝癌組織；4：高分化肝癌組織Figure 3　Western blot analysis of Foxp3 protein expression 1: Tumor adjacent tissue; 2: Well differentiated HCC tissue; 3: Moderately differentiated HCC tissue;4: Poorly differentiated HCC tissue

3　討　論

Tregs是影響腫瘤患者預(yù)后的潛在因素之一，目前，在腫瘤、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、外周血、惡性腹水，胸腔積液中均有發(fā)現(xiàn)[2-3]。手術(shù)、放療和化療是傳統(tǒng)的腫瘤治療手段，隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，對(duì)腫瘤的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)不斷深入，在臨床中，調(diào)動(dòng)患者機(jī)體主動(dòng)免疫功能，進(jìn)行免疫治療已逐步開(kāi)展，但其臨床上對(duì)肝細(xì)胞癌的療效并不確定，可能與患者腫瘤抗原中正常細(xì)胞較多，機(jī)體T細(xì)胞免疫系統(tǒng)對(duì)癌細(xì)胞免疫“豁免”有關(guān)[4]。Tregs的相關(guān)研究如Tregs/CD3、Tregs/CD4、Tregs/CD8等在原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤中的比率已見(jiàn)于很多研究[4-7]。建立Tregs與Foxp3基因或蛋白聯(lián)系，使Tregs的研究有了進(jìn)一步的進(jìn)展[9]。CD8+CD28-Tregs在機(jī)體調(diào)節(jié)機(jī)制中有重要作用，可控制自身反應(yīng)性T細(xì)胞，限制機(jī)體過(guò)度免疫應(yīng)答或破壞自身組織的作用，使機(jī)體免疫平衡穩(wěn)態(tài)得以維持[10-11]。Foxp3在胸腺和外周血CD8+CD28-Tregs中特異性表達(dá)，F(xiàn)oxp3基因編碼該蛋白，阻止細(xì)胞因子分泌[12]。CD8+CD28-Tregs可抑制自身免疫性疾病的發(fā)生，參與調(diào)節(jié)腫瘤免疫。本研究表明，與對(duì)照組比較，肝癌患者外周血中CD8+CD28-Foxp3+Tregs的比率明顯升高，且此改變與患者的年齡和性別比較差異無(wú)關(guān)，這與王徐等[13]研究T細(xì)胞群和性別無(wú)關(guān)相一致。本研究的肝癌患者中，Tregs的比率較正常健康對(duì)照組明顯升高，且Tregs的比率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌患者外周血中明顯升高，這與在消化道腫瘤中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Tregs顯著增高相一致[14-17]。

目前，多數(shù)研究對(duì)Tregs的檢測(cè)基于腫瘤患者外周血進(jìn)行，對(duì)腫瘤病理組織同時(shí)進(jìn)行對(duì)照研究較少[18-19]。本研究通過(guò)石蠟包埋免疫組化法和Western blot的研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者腫瘤組織中Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及Foxp3蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，表明在肝癌患者中，Tregs可能通過(guò)某種途徑向癌周滲透遷移浸潤(rùn)。Foxp3抑制機(jī)體增殖與活化腫瘤特異性T效應(yīng)細(xì)胞，與機(jī)體荷瘤時(shí)的免疫耐受腫瘤抗原和相關(guān)抗原可能有關(guān)[20-21]，有文獻(xiàn)[22-25]報(bào)道Tregs通過(guò)趨化因子介導(dǎo)遷移至腫瘤微環(huán)境中。本實(shí)驗(yàn)中，由于肝癌樣本量相對(duì)較少，不利于在單項(xiàng)TNM分期和腫瘤分化級(jí)別中做Tregs的統(tǒng)計(jì)分析，因此基于III/IV期與I/II期、中低分化與高分化肝癌患者Foxp3+Tregs的比率明顯增高，提示Foxp3+Tregs可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)肝癌患者外周血進(jìn)行檢測(cè)，采用病理組織學(xué)和分子生物學(xué)的對(duì)照研究，更加直觀和準(zhǔn)確為臨床檢測(cè)Tregs提供參考。然而，收集遠(yuǎn)期的完整隨訪資料，術(shù)后檢測(cè)早期外周血T細(xì)胞結(jié)果可能受到抗生素使用等多因素的影響，可能會(huì)改變淋巴細(xì)胞亞群，因此，本研究還需要擴(kuò)大樣本量以獲取準(zhǔn)確的研究結(jié)果。

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