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    肝癌細(xì)胞中miR-376c的表達(dá)及其與高遷移率族蛋白A2的關(guān)系

    2017-04-02 02:26:08王宇鋒劉志奎姚博文李青丁凌龍涂康生楊威
    中國普通外科雜志 2017年7期
    關(guān)鍵詞:普通外科小室細(xì)胞系

    王宇鋒,劉志奎,姚博文,李青,丁凌龍,涂康生,楊威

    (西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽外科,陜西 西安 710061)

    肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1-4]。近年來隨著診療手段的不斷進(jìn)步,HCC患者的預(yù)后已有一定的改善,但是HCC惡性程度高、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)使得HCC患者的預(yù)后仍不能令人滿意[1-2,5-6]。因此,探究HCC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制,尋找新的臨床有效的治療靶點(diǎn)是當(dāng)前提升HCC診療水平的主要任務(wù)之一[1,6-9]。微小RNA(microRNA,miRNA)是近年來在腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一,它是一類長度約18~25個核苷酸序列的不編碼蛋白質(zhì)的單鏈RNA小分子[1,10]。miRNA作為癌基因或者抑癌基因,可以通過與下游靶基因的相互作用來調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1,10-11]。miR-376c的長度為20~24個核苷酸序列,其可以通過參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯來影響基因的表達(dá)水平[12-13]。研究發(fā)現(xiàn),miR-376c在多種腫瘤中的表達(dá)趨勢不一,其在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[14]、膽管癌[15]及子宮頸癌[12]等腫瘤中表達(dá)下調(diào),而在卵巢癌[16]中表達(dá)上調(diào)。并且在關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的不同研究中,其在腫瘤組織中的表達(dá)趨勢也不一致[17-18]。異常表達(dá)的miR-376c可以通過調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)水平來影響腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖、凋亡以及對化療藥物的敏感性等生物學(xué)行為[12,17-19]。但是miR-376c在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及其具體作用目前尚罕有報(bào)道。高遷移率族蛋白A2(high mobility group A2,HMGA2)是由HMGA2基因編碼的蛋白。研究[20-22]發(fā)現(xiàn)HMGA2在HCC中表達(dá)上調(diào),可以受let-7、miR-107以及miR-663a等多種miRNA的調(diào)控從而促進(jìn)HCC細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,但是其是否受miR-376c調(diào)控目前也尚未報(bào)道。本研究首先探討了HCC組織中miR-376c的表達(dá)情況,然后分析miR-376c的臨床意義,并進(jìn)一步應(yīng)用人工合成的miR-376c模擬物過表達(dá)HCC細(xì)胞中的miR-376c從而分析其對HCC細(xì)胞的作用。此外,還在HCC組織中分析了其與HMGA2表達(dá)的相關(guān)性??傊?,本研究主要探究了miR-376c在HCC中的表達(dá)情況及其臨床意義,并初步探究miR-376c對HCC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及潛在機(jī)制,旨在為研發(fā)真正臨床有效的HCC靶向治療藥物以及改善HCC的診治水平提供一定的研究基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 組織標(biāo)本和細(xì)胞

    收集并篩選83例HCC組織和對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本,所有標(biāo)本均來自2012年7月―2013年12月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科接受手術(shù)治療的HCC患者,其中男68例,女15例;年齡30~74歲,中位年齡49歲。所有患者的腫瘤標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為HCC,對應(yīng)的癌旁組織為距腫瘤邊緣>2 cm 的肝組織,術(shù)前均未接受化療、放療等其他輔助治療,所有組織取得后均盡快保存于液氮或者多聚甲醛(40 g/L)中?;颊咝g(shù)后隨訪時間為36個月。本課題經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)并且實(shí)驗(yàn)獲得患者知情同意后開展的。正常永生化人肝細(xì)胞L02與肝癌細(xì)胞株MHCC-97L、SMMC-7721、MHCC-97H、Hep-3B、HepG2均購自中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

    1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

    miR-376c特異性引物、miRNA 內(nèi)參U6引物、miR-376c過表達(dá)模擬物、陰性對照序列、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(All-in-One? miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit)以及miRNA qPCR試劑盒(All-in-One? miRNA qPCR Kit)均購自Genecopoeia公司。TRIzol試劑和脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000)均購自Invitrogen公司。胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購自Gibco公司,DMEM購自ThermoFisher Scientific公司;ECL發(fā)光劑購自Milipore公司;兔抗人HMGA2多克隆抗體購自Abcam公司;BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Matrigel基質(zhì)膠購自BD公司;RIPA裂解液(強(qiáng))購自西安赫特生物科技有限公司;Transwell小室購自Becton Dickinson Labware公司;小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染正常肝細(xì)胞L02與MHCC-97H、HepG2、MHCC-97L、Hep-3B、SMMC-7721細(xì)胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于50 mL/L CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染操作按照LipofectamineTM2000試劑說明書上的步驟進(jìn)行。首先用6孔板將細(xì)胞培養(yǎng)至融合度為50%~70%時,然后將100 nmol miR-376c模擬物及100 nmol陰性對照序列分別加入6孔板中,用無雙抗100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)8 h后換成正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),后續(xù)轉(zhuǎn)染效果檢測及相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)染48 h后收取細(xì)胞進(jìn)行。

    1.3.2real-time PCR按TRIzol試劑說明書上的步驟提取組織或者細(xì)胞中的總RNA,并應(yīng)用超微量核酸定量光譜儀(Thermo Nanodrop 1000)檢測RNA的濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄操作按照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書上的步驟進(jìn)行。real-time PCR按照miRNA qPCR試劑盒說明書上的步驟進(jìn)行,以U6為內(nèi)參,2-△△Ct法計(jì)算miR-376c的相對表達(dá)量。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。miR-376c正向引物:5′-AAC ATA GAG GAA ATT CCA CGT-3′;U6 snRNA 正向引物:5′-CGC AAG GAT GAC ACG CAA ATT C-3′。

    1.3.3Transwell小室遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)侵襲實(shí)驗(yàn)時,先按1:8的稀釋比例將50 mg/L的Matrigel膠稀釋后鋪于小室底部;遷移實(shí)驗(yàn)時不鋪膠 。收取轉(zhuǎn)染48 h 后的各組MHCC-97H 細(xì)胞,離心、重懸將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個/mL。24孔板下室加入600 μL含100 mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基,取各組細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室的上室。每組重復(fù)3個樣本。24 h后取出小室,首先用PBS溶液將小室清洗3次,然后用棉簽將小室的微孔膜上層的Matrigel 膠及細(xì)胞輕輕拭凈,接著用多聚甲醛(40 g/L,15 min)固定,用結(jié)晶紫(1 g/L,5 min)染色,并用PBS溶液洗凈,最后將小室置于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù),每個樣本隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行計(jì)數(shù)并求其平均數(shù),以此評估細(xì)胞的侵襲遷移能力。

    1.3.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)用記號筆在培養(yǎng)板背面畫3條橫行平行線,間距約0.5 cm,定位劃痕區(qū)域。將實(shí)驗(yàn)組、對照組細(xì)胞用胰酶消化、用培養(yǎng)基重懸后均勻種于6孔板中,細(xì)胞密度約1×106個/mL,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞均勻鋪滿板底,且為單層細(xì)胞時,將無菌直尺置于培養(yǎng)板上,與標(biāo)記線垂直,用200 μL槍頭用力均勻沿直尺劃線,與標(biāo)記線存在交叉點(diǎn)。PBS清洗3次,去除懸浮細(xì)胞,加入無血清培養(yǎng)基,繼續(xù)于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。于劃痕后0、48 h在倒置顯微鏡下觀察、拍照。

    1.3.5免疫組化先將組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋,制作4 μm切片。取出切片置于60 ℃烘箱中20 min,常規(guī)二甲苯脫蠟,梯度酒精水化,3%H2O2阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶(37 ℃,10 min),抗原修復(fù)(0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液,96 ℃,15 min),滴加山羊血清液封閉(100 mL/L,37 ℃,10 min),滴加HMGA2抗體(1:200,4 ℃過夜),PBS洗滌后,滴加生物素標(biāo)記的二抗(1:1000,37 ℃,60 min);滴加鏈霉親和素-過氧化物酶(SP),37 ℃孵育40 min,DAB顯色8 min,在顯微鏡下掌握染色程度,自來水沖洗10 min終止反應(yīng);蘇木素復(fù)染2 min,自來水沖洗15 min;常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。免疫組化評分= 染色強(qiáng)度評分×陽性細(xì)胞百分比評分,每張切片的最終評分為5個視野的平均分。染色強(qiáng)度評分:(-)為0分,(+)為1分,(++)為2分,(+++)為3分;陽性細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞或肝細(xì)胞)百分比評分:0分為陽性細(xì)胞比例≤5%,1分為陽性細(xì)胞比例>5%~≤25%,2分為陽性細(xì)胞比例>25%~≤50%,3分為陽性細(xì)胞比例50%>~≤75%,4分為陽性細(xì)胞比例>75%。

    1.3.6細(xì)胞蛋白抽提及Western blot實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,用RIPA裂解液抽提細(xì)胞總蛋白,用BCA法進(jìn)行蛋白定量。Western blot實(shí)驗(yàn)時,首先將待檢測蛋白樣品按30 μg/孔上樣后行SDS-PAGE電泳,然后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,用5%脫牛奶粉液封閉2.0 h后,加入相應(yīng)的HMGA2抗體(1:1000)或者β-actin抗體(1:1000),4 ℃孵育過夜。次日取出膜,在室溫孵育30 min,用TBST溶液(TBS,1 mL/L Tween-20)洗膜3次,10 min/次,洗去殘余的一抗;分別加HRP標(biāo)記的抗兔或抗小鼠二抗(1:5000),室溫孵育2 h。TBST(TBS,1 mL/L Tween-20)洗膜3 次,8 min/次,洗去殘余的二抗后在暗室進(jìn)行發(fā)光檢測目的蛋白。

    1.3.7miRNA靶基因的預(yù)測應(yīng)用生物信息學(xué)軟件TargetScanHuman預(yù)測miR-376c的靶基因。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    應(yīng)用SPSS 22.0等統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法包括t檢驗(yàn)、Pearson χ2檢驗(yàn)以及Pearman相關(guān)性檢驗(yàn)等;用Graphpad Prism 6及Adobe PhotoShop CS5等作圖軟件進(jìn)行圖表的繪制。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 HCC組織中miR-376c的表達(dá)

    real-time PCR結(jié)果顯示,與在癌旁組織中的表達(dá)水平(3.4330±0.1202)比較,miR-376c在HCC組織中的表達(dá)水平(0.9667±0.1217)明顯下調(diào)(P<0.01)(圖1)。

    2.2 HCC組織中miR-376c表達(dá)量的臨床意義

    以HCC組織中miR-376c的平均水平(0.9667±0.1217)為界,83例患者被分為miR-376c高表達(dá)組(44例)和miR-376c低表達(dá)組(39例)。分析miR-376c的表達(dá)與HCC患者的臨床病理特征之間的關(guān)系,結(jié)果顯示,miR-376c的表達(dá)水平與門靜脈侵犯與否、TNM分期及Edmondson分級有關(guān)(均P<0.05),而與年齡、性別、腫瘤大小、甲胎蛋白、腫瘤個數(shù)無關(guān)(均P>0.05)(表1)。對兩組患者的隨訪進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,與miR-376c高表達(dá)組患者比較,miR-376c低表達(dá)組患者的3年總體生存率明顯要低(P<0.01)(圖2)。

    圖1 癌旁組織和HCC組織中miR-376c的表達(dá)Figure 1 The miR-376c expressions in HCC tissues and adjacent normal tissues

    表1 HCC中miR-376c的表達(dá)量與臨床病理因素的關(guān)系[n(%)]Table 1 Relations of miR-376c expression with clinicopathologic features of HCC [n (%)]

    圖2 miR-376c高表達(dá)與低表達(dá)患者3年總體生存率比較Figure 2 Comparison of the 3-year overall survival rates between HCC patients with high and low miR-376c expression

    2.3 miR-376c在不同的HCC細(xì)胞系中的表達(dá)

    應(yīng)用real-time PCR檢測正常永生化人肝細(xì)胞L02以及不同的HCC細(xì)胞系MHCC-97H、HepG2、MHCC-97L、Hep-3B、SMMC-7721中miR-376c的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與在L02細(xì)胞中的表達(dá)相比,5種HCC細(xì)胞系中miR-376c的表達(dá)均明顯下調(diào),而與其他4種HCC細(xì)胞系相比,MHCC-97H細(xì)胞中的miR-376c的表達(dá)量為最低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖3)。

    圖3 miR-376c不同HCC細(xì)胞系與正常肝細(xì)胞中的表達(dá)Figure 3 The of miR-376c expressions in different HCC cell lines and normal hepatic cells

    2.4 過表達(dá)miR-376c對HCC細(xì)胞的遷移與侵襲的影響

    為探討miR-376c對HCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,用miR-376c模擬物上調(diào)MHCC-97H細(xì)胞中的miR-376c的表達(dá)水平,用real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染效果,結(jié)果顯示,過表達(dá)組中miR-376c的表達(dá)水平(0.4000±0.5774)明顯高于陰性對照組(15.1700±0.4410),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖4)。

    圖4 轉(zhuǎn)染效果檢測Figure 4 Transfection eきciency determinations

    Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)MHCC-97 H細(xì)胞的m i R-376 c后,遷移的細(xì)胞數(shù)目明顯減少[(56.00±2.00)vs.(26.00±1.16),P<0.05](圖5A-B);Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明,相比對照組而言,過表達(dá)MHCC-97H細(xì)胞的miR-376c后,侵襲的細(xì)胞數(shù)目也明顯被抑制[(45.33±1.88)vs.(18.33±1.87),P<0.01](圖5C-D)。此外,劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)MHCC-97H細(xì)胞的miR-376c后,劃痕的愈合率明顯降低[(95.33±1.45)% vs.(60.00±2.08)%,P<0.01](圖6)。

    2.5 miR-376c可抑制HMGA2蛋白的表達(dá)

    用生物信息學(xué)軟件(TargetScanHuman)分析發(fā)現(xiàn),HMGA2可能為miR-376c的潛在的靶點(diǎn)之一(圖7A)。為了探討miR-376c是否能調(diào)控HMGA2的表達(dá),分別在MHCC-97H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-376c模擬物和陰性對照序列,然后檢測對應(yīng)的細(xì)胞中HMGA2蛋白的表達(dá)變化,結(jié)果顯示,模擬物組細(xì)胞中的HMGA2蛋白表達(dá)水平明顯低于陰性對照組(P<0.05)(圖7B)。

    圖5 miR-376c對MHCC-97H細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響 A:Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力(×100);B:遷移細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)圖;C:Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力(×100);D:侵襲細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)圖Figure 5 Influence of miR-376c on migration and invasion abilities of MHCC-97H cells A: Cell migration ability measured by Transwell assay (×100); B: Statistical plot of number of migrating cells; C: Cell invasion ability measured by Transwell assay (×100);D: Statistical plot of numbers of invading cells

    圖6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力Figure 6 Cell migration ability measured by wound scratch healing assay

    圖7 miR-376c對HMGA2表達(dá)的影響 A:生物信息學(xué)分析顯示miR-376c可與HMGA2基因的3′非編碼區(qū)結(jié)合;B:過表達(dá)miR-376c的MHCC-97H細(xì)胞中HMGA2蛋白水平降低Figure 7 Influence of miR-376c on HMGA2 expression A: Bioinformatics analysis showing that miR-376c binds to 3’-UTR site of HMGA2 gene; B: Overexpressed miR-376c decreasing HMGA2 protein expression in MHCC-97H cells

    2.6 HCC組織中miR-376c表達(dá)水平與HMGA2蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性

    為了進(jìn)一步證實(shí)miR-376c可調(diào)控HMGA2蛋白的表達(dá),應(yīng)用免疫組化法分別檢測了miR-376c高表達(dá)組和低表達(dá)組的HCC組織中HMGA2的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HMGA2在HCC組織中的染色為棕黃色或者棕褐色,主要著色部位為細(xì)胞核,有部分存在于細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞膜上(圖8A-B)。并且,miR-376c高表達(dá)組中的HMGA2蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯低于miR-376c低表達(dá)組[(1.00±0.12)vs.(6.50±0.13)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖8C)。

    此外,為了進(jìn)一步明確miR-376c和HMGA2的表達(dá)量之間的相關(guān)性,采用了Spearman相關(guān)分析法進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示,在HCC組織中,miR-376c 與HMGA2的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.541,P<0.01)(圖8D)。

    圖8 HCC組織中miR-376c和HMGA2的表達(dá)量的相關(guān)性 A-B:miR-376C低表達(dá)和高表達(dá)HCC組織中HMGA2的表達(dá)檢測(×400);C:HMGA2的免疫組化評分;D: Spearman法分析miR-376c與HMGA2表達(dá)量的相關(guān)性Figure 8 Correlation of miR-376c expression with HMGA2 expression in HCC tissues A–B: The HMGA2 expression in HCC tissues with low and high miR-376C expression (×400);C: Immunohistochemistry score for HMGA2; D: Spearman correlation analysis of correlation between miR-376c and HMGA2 expression

    3 討 論

    HCC是最致命的腫瘤之一,盡管過去數(shù)十年HCC的治療手段已經(jīng)有了諸多改善,但是目前HCC患者的生存率仍然不容樂觀[5,23]。因此,尋找新的治療靶點(diǎn),有效推動HCC靶向治療的發(fā)展是目前需要迫切解決的問題[4,23]。miRNA是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA小分子,可在腫瘤中異常表達(dá),從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1,24-26]。系列研究發(fā)現(xiàn),miR-376c在骨肉瘤、膽管癌、前列腺癌、宮頸癌、卵巢癌等腫瘤中均為異常表達(dá),其作為抑癌基因或者癌基因可以參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移以及化療抵抗性等生物學(xué)行為[12,14-16,19,27]。Jin等[28]研究發(fā)現(xiàn),miR-376c在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中均為低表達(dá),并且miR-376c可通過直接靶向作用于TGF-α來抑制骨肉瘤的生長和侵襲;Iwaki等[15]研究發(fā)現(xiàn),miR-376c在膽管癌中為抑癌基因,能夠抑制膽管癌細(xì)胞的侵襲和遷移;Ye等[16]研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)卵巢癌細(xì)胞中的miR-376c可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的抵抗性。而miR-376c在HCC中的表達(dá)情況及其對HCC細(xì)胞的作用及其機(jī)制目前尚罕有報(bào)道。

    本研究發(fā)現(xiàn),HCC組織中miR-376c的表達(dá)水平明顯下調(diào),且與HCC的門靜脈侵犯與否、TNM分期及Edmondson分級顯著相關(guān),此外,miR-376c高表達(dá)組HCC患者預(yù)后較好。上述結(jié)果提示,在HCC中,miR-376c為抑癌基因,且可能對腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移具有抑制作用。為了探究miR-376c對HCC細(xì)胞的侵襲、遷移的影響,本研究首先檢測了miR-376c在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)情況。與在HCC組織標(biāo)本中的表達(dá)情況一致,miR-376c在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)與正常肝細(xì)胞相比明顯下調(diào)。而Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明,miR-376c可以抑制HCC細(xì)胞的遷移及侵襲能力,這和在膽管癌[15]、骨肉瘤[28]中的研究結(jié)果一致。上述結(jié)果表明,miR-376c為HCC的抑癌基因,可以通過抑制HCC細(xì)胞的侵襲遷移能力從而抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。

    為進(jìn)一步探討miR-376c在HCC中的潛在作用機(jī)制,本研究首先應(yīng)用生物信息學(xué)工具預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-376c在HCC中的可能的作用靶點(diǎn)之一為HMGA2。而據(jù)文獻(xiàn)[21]報(bào)道,HMGA2在HCC中為過表達(dá),可促進(jìn)HCC細(xì)胞的侵襲、遷移、EMT及增殖,并且HMGA2可通過與miRNA相互作用,從而共同調(diào)節(jié)HCC的發(fā)生發(fā)展。例如,Huang等[20]研究發(fā)現(xiàn),miR-603a可以抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,它可以通過直接作用于HMGA2來發(fā)揮其抑癌作用。因此,結(jié)合生物信息學(xué)資料和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道推測,在HCC中HMGA2可以受miR-376c的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,上調(diào)HCC細(xì)胞中的miR-376c的表達(dá)水平后HMGA2的蛋白水平相應(yīng)下調(diào)。這提示miR-376c可能通過負(fù)向調(diào)控HMGA2的表達(dá)水平發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果,本研究分析了HCC組織中miR-376c的表達(dá)和miR-376c表達(dá)水平的相關(guān)性。首先應(yīng)用免疫組化染色檢測HMGA2蛋白在miR-376c高表達(dá)組和低表達(dá)組的HCC組織中的表達(dá)情況并進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。結(jié)果顯示,HMGA2蛋白在miR-376c低表達(dá)組的HCC組織中HMGA2蛋白的表達(dá)明顯要強(qiáng);Spearman相關(guān)分析顯示,HCC組織中的miR-376c和HMGA2的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系。上述結(jié)果進(jìn)一步說明了,HMGA2可能是miR-376c的下游直接作用靶點(diǎn)。但是在HCC中,miR-376c是否可通過負(fù)向調(diào)控HMGA2蛋白的表達(dá)發(fā)揮其抗HCC遷移與侵襲的作用,miR-376c的上游調(diào)控因子及機(jī)制如何,以及HMGA2是否是miR-376c的直接作用靶點(diǎn)和具體作用機(jī)制都有待進(jìn)一步深入研究。

    綜上,HCC中miR-376c的表達(dá)下調(diào),并且與患者的門靜脈侵犯、TNM分期及Edmondson分級及預(yù)后密切相關(guān)。此外,miR-376c能抑制HCC細(xì)胞的侵襲與遷移,而HMGA2可能是miR-376c的下游直接作用靶點(diǎn)。因此,本研究可能為HCC靶向治療的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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