甲強(qiáng)龍對(duì)大鼠急性脊髓損傷后血中丙二醛的影響

胡雪峰+郭鵬年+姜霽哲+劉瑞

[摘要] 目的 探討大劑量甲基強(qiáng)的松龍（methylprednisolone，MP）對(duì)急性脊髓損傷（acute spinal cord injury，ASCI）后大鼠血清中丙二醛（Malonic Dialdehyde，MDA）的影響。方法 該試驗(yàn)于2015年7月—2016年8月進(jìn)行。90只雄性SD大鼠，隨機(jī)分成A，B，C 3組，每組30只。A 組單純?nèi)蛋迩谐?，不損傷脊髓；B，C組采用Allen's法制作T10脊髓損傷模型，C組首計(jì)量以30 mg/kg甲基強(qiáng)的松龍尾靜脈注射，余計(jì)量以5.4 mg/（kg·h），每4 h靜脈給藥1次，24 h給完，A、B組以生理鹽水尾靜脈注射，計(jì)量同C組。術(shù)后24 h，48 h對(duì)3組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能行BBB評(píng)分；損傷脊髓病理觀察。應(yīng)用ELISA方法檢測各組中血清MDA含量。結(jié)果 BBB評(píng)分A組中24 h與48 h亞組分別為（19.60±0.97），（19.90±0.74）；B組中24 h與48 h亞組分別為（0.80±0.63），（1.00±0.94）；C組中24 h與48 h亞組分別為（2.40±1.07），（2.60±0.97）。經(jīng)比較C組與B組，在運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.01），C組明顯優(yōu)于B組。血清MD含量變化不同時(shí)間點(diǎn)血清中丙二醛含量濃度（ng/mL），A組中24 h與48 h亞組分別為（2.45±0.23），（2.46±0.26）；B組中24 h與48 h亞組分別為（6.25±0.59），（6.74±0.31）；C組中24 h與48 h亞組分別為（4.53±0.43），（4.44±0.50）。B組血清中MDA含量較A和C組明顯增高（P<0.01），C組血清中MDA含量較A組明顯增高（P<0.05）。C組大鼠在損傷后24 h，48 h后BBB評(píng)分高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。B，C組血清中的MDA濃度較A組均明顯升高，而C組血清的MDA濃度顯著低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論 大鼠急性脊髓損傷后血清中MDA顯著升高，早期應(yīng)用大劑量MP后血清MDA明細(xì)降低，提示早期大劑量的MP治療對(duì)脊髓急性損傷具有明顯的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 脊髓損傷；甲基強(qiáng)的松龍；丙二醛；大鼠

[中圖分類號(hào)] R683.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）01（c）-0059-04

Effect of Urbason on the Blood Malonaldehyde of Rats after the Acute Spinal Cord Injury

HU Xue-feng， GUO Peng-nian， JIANG Ji-zhe， LIU Rui

Department of Orthopaedics， First Affiliated Hospital of Baotou Medical College， Baotou， Inner Mongolia， 014010 China

[Abstract] Objective To study the effect of large-dose urbason on the blood malonaldehyde？of rats after the acute spinal cord injury. Methods 90 male SD rats from July， 2015 to August， 2016 were randomly divided into three groups with 30 cases in each， the group A were given the laminectomy without spinal marrow injury， the group B and group C made the T10 spinal marrow injury model by the Allen's method， the group C were given the intravenous injection of 30 mg/kg methylprednisolone at first and then were given the intravenous administration of 5.4 mg/（kg·h） once per 4 h， and the administration was complete within 24 h， and the group A and group B were given the intravenous injection of normal saline and the amount was the same as that in the group C， and the posterior limb motion function of the three groups at 24 h and 48 h after operation were given the BBB score， and the serum MDA content in each group was tested by the ELISA method. Results The BBB scores in the 24 h and 48 h subgroups A， B and C were respectively（19.60±0.97），（19.90±0.74），（0.80±0.63），（1.00±0.94） and （2.40±1.07），（2.60±0.97）， and the difference in the motion function recovery between the group C and group B had statistical significance（P<0.01）， and the malonaldehyde content concentrations in serum in the 24 h and 48 h subgroups A， B and C were respectively（2.45±0.23），（2.46±0.26），（6.25±0.59），（6.74±0.31） and （4.53±0.43），（4.44±0.50）， the MDA content in the group B obviously increased compared with that in the group A and group C（P<0.01）， and the MDA content in the group C obviously increased compared with that in the group A（P<0.05）， and the BBB scores at 24 h and 48 h after injury in the group C were higher than those in the group B， and the difference had statistical significance（P<0.01）， and the MDA concentration in serum in the group C obviously increased compared with that in the group A， and the MDA concentration in serum in the group C was obviously lower than that in the group B， and the difference had statistical significance（P<0.01）. Conclusion The MDA in serum of rats after the acute spinal cord injury obviously increases， and the early application of large-dose MP can obviously reduce the serum MDA， which reminds that the early large-dose MP treatment has an obvious protective effect on the injury of the acute spinal cord injury.

[Key words] Spinal cord injury； Methylprednisolone； Malonaldehyde； Rat

氧化應(yīng)激在SCI中扮演了重要角色，使脊髓結(jié)構(gòu)與功能損傷甚至變性壞死，通過藥物抑制 SCI后的氧化應(yīng)激反應(yīng)可促進(jìn)患者神經(jīng)功能恢復(fù)。MP是美國脊髓損傷學(xué)會(huì)提出的唯一對(duì)脊髓損傷有確定療效的藥物，提出了大劑量MP的沖擊治療方案，但具體作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。此次試驗(yàn)通過早期大劑量MP注射對(duì)SCI后大鼠血清中丙二醛的變化，來評(píng)價(jià)MP治療效果為臨床應(yīng)用其治療SCI，提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。該試驗(yàn)于2015年7月—2016年8月進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑

4月齡雄性健康成年SD大鼠90只，體重（400±50）g （包頭醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供），分籠適應(yīng)性喂1周，自由進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)條件、飼料情況、護(hù)理?xiàng)l件符合國際上擬定的動(dòng)物公約。注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉 （購自Pfizer Manufacturing Belgium NV）；大鼠丙二醛ELISA試劑盒 （購于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）。90只SD大鼠的一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 動(dòng)物分組和模型制作

90只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為A、B、C3組，每組又分為造模后24 h，48 h，2個(gè)亞組，每組30只大鼠。1%戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉后，以T10為標(biāo)志，顯露脊髓，A組只行T10椎板切除術(shù)，不打擊脊髓，B、C組以5 cm×10 g的能量打擊脊髓，大鼠迅速出現(xiàn)軀體、雙后肢回縮撲動(dòng)及搖尾反射為打擊成功。動(dòng)物模型制作成功后，C組以30 mg/kg計(jì)量甲強(qiáng)龍尾靜脈立即注射，其余以5.4 mg/（kg·h），每4 h靜脈給藥1次，24 h內(nèi)完成，A、B組以等體積生理鹽水相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)代替注射。

1.3 BBB評(píng)分

試驗(yàn)完成后24、48 h，每組取15只大鼠行BBB評(píng)分。

1.4 取材及樣品制備

24、48 h每組取15只大鼠，麻醉后心臟取血1 mL，4℃靜置2 h，2 500 r/min×離心10 min取血清，-20℃冰箱保存待測。然后切取以損傷段為中心長約1.5 cm脊髓組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片HE染色。

1.5 病理檢測

切片經(jīng)HE染色后在光鏡下觀察各組大鼠脊髓組織的病理變化。

1.6 MDA-ELISA檢測

取-20℃冰箱保存血清室溫復(fù)溫，利用大鼠丙二醛聯(lián)免疫試劑盒具體步驟參照試劑盒說明書，靈敏度為0.094。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，行t檢驗(yàn)，P<0.05表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脊髓神經(jīng)功能評(píng)價(jià)

C組與B組在運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.01），治療組明顯優(yōu)于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，表明大劑量的MP治療能明顯促進(jìn)大鼠急性脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。BBB評(píng)分結(jié)果見表1。

2.2 組織病理學(xué)改變

2.2.1 HE染色特點(diǎn) A組各亞組見脊髓組織結(jié)構(gòu)完整清晰，未見明顯損傷表現(xiàn)。B 組在24 h 及48 h兩亞組神經(jīng)元細(xì)胞腫脹、空泡、壞死形成，灰白質(zhì)多灶性出血，脊髓正常結(jié)構(gòu)破壞。兩亞組間脊髓組織改變情況無明顯差異， C 組空泡、出血相對(duì)減少，壞死范圍較小，組織結(jié)構(gòu)相對(duì)較完整。見圖1、圖2。

2.3 血清MD含量變化

B組血清中MDA含量較A和C組明顯增高（P<0.01），C組血清中MDA含量較A組明顯增高（P<0.05）。見表2。

3 討論

急性脊髓損是高傷創(chuàng)傷性損傷，嚴(yán)重者造成癱瘓預(yù)后不佳，早期積極干預(yù)治療可降低致殘率。其損傷機(jī)制包括：首先是機(jī)械損傷即可造成脊髓的結(jié)構(gòu)破壞，血運(yùn)受損、水腫及炎癥因子的刺激。其次是繼發(fā)性損傷包括，凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，電解質(zhì)失調(diào)，脂質(zhì)過氧化，興奮性毒性，神經(jīng)成分活化的自身反應(yīng)性損害[1]。繼發(fā)性損傷從傷后即可開始，持續(xù)時(shí)間不等從數(shù)分鐘至數(shù)周甚至更長，因此臨床研究發(fā)現(xiàn)盡早的介入阻斷脊髓繼發(fā)性損傷，是治療脊髓損傷的關(guān)鍵，可以極大地提高預(yù)后效果[2]。早期大劑量應(yīng)用MP治療可以有效抑制其繼發(fā)性損傷反應(yīng)，雖然早期大量使用MP存在著很多爭論，如感染率的大幅升高，其他激素不良反應(yīng)等，但是許多醫(yī)生至今仍然應(yīng)用甲強(qiáng)龍治療急性脊髓損傷[3-6]。SCI后氧自由基和脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致脊髓繼發(fā)性損傷的重要發(fā)病機(jī)制。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的直接產(chǎn)物，也是試驗(yàn)研究脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度，常用而有效的判定指標(biāo)，因此通過檢測血清中MDA高低進(jìn)而反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度?；诖?，該研究利用大鼠SCI模型的早期MP治療，分析藥物干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)血清中MDA 的含量變化，來研究MP早期治療對(duì)MDA的影響作用。經(jīng)測試SCI 后早期血清中MDA水平迅速上升，表明脂質(zhì)過氧化在SCI后短時(shí)間內(nèi)即瀑布式發(fā)生，而治療組血清中MDA含量下降，與損傷組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，早期抑制繼發(fā)性損傷提高治療SCI效果的關(guān)鍵。

潑尼龍（MP）的抗炎和抗氧化作用非常強(qiáng)大是眾所周知，他是治療各種涉及腦白質(zhì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的中流砥柱。雖然MP的確切作用機(jī)制還不完全清楚，目前認(rèn)為糖皮質(zhì)激素可以維持血液脊髓屏障，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，抑制內(nèi)啡肽釋放，降低血管性水腫，并限制脊髓損傷后炎癥反應(yīng)等[7-8]。近年來研究表明， ASCI后細(xì)胞凋亡是至關(guān)重要的，caspase家族成員在細(xì)胞凋亡過程中為主要參與者，而caspase酶的活化是細(xì)胞凋亡的一個(gè)扳機(jī)點(diǎn)[9-10]。由于 MP 早期治療抑制繼發(fā)性損傷反應(yīng)，使得用藥組血清中 MDA含量會(huì)低于損傷組。經(jīng) ELISA 檢測顯示血清MDA：在 24、48 h，C 組分別為 （4.53±0.43）、（4.44±0.50），明顯低于 B 組的（6.25±0.59），（6.74±0.31），且高于 A 組（2.45±0.23），（2.46±0.26），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），證實(shí)試驗(yàn)前猜想。由于阻止繼發(fā)性損傷加強(qiáng)對(duì)損傷脊髓組織的保護(hù)作用，因此治療組大鼠血清MDA降低相對(duì)于試驗(yàn)對(duì)照組。高松等人[11]也證實(shí)急性脊髓損傷大鼠早期硬膜內(nèi)灌注甲強(qiáng)龍1、3 d，血清中MDA低于對(duì)照組，BBB評(píng)分3、7 d實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。早期藥物干預(yù)后后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)明顯，BBB評(píng)分顯示C組與B組在運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而且組織病理學(xué)證實(shí)經(jīng)甲強(qiáng)龍治療后脊髓組織空泡、出血相對(duì)減少，壞死范圍較小，組織結(jié)構(gòu)相對(duì)較完整，因此證明早期MP治療可有效的抑制脊髓損傷的第二相損傷反應(yīng)，從而有效的保護(hù)未損傷的脊髓神經(jīng)。

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