IFN-γ基因+874位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與宮頸癌的關(guān)系

陳 健，孫志強(qiáng)，李玉權(quán)，武廣恒

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長春130012；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021)

*通訊作者

IFN-γ基因+874位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與宮頸癌的關(guān)系

陳 健1，孫志強(qiáng)1，李玉權(quán)1，武廣恒2*

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長春130012；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021)

人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素[1]，但僅有一定數(shù)量的HPV 感染者最終罹患宮頸癌，說明遺傳易感性在個(gè)體之間存在著差異，其作用可能在特定條件下被激發(fā)，并在腫瘤發(fā)生中起到重要作用。干擾素(IFN)是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的十分重要的細(xì)胞因子,具有拮抗腫瘤、廣譜抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)等廣泛的生物活性。研究顯示[2]，在IFN-γ基因中存在6個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中第一內(nèi)含子+874位點(diǎn)A/T單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)，可以通過改變轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)的方式進(jìn)而影響到相關(guān)基因的表達(dá)數(shù)量[3]。本實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用單核苷酸多態(tài)性基因分型方法,比較宮頸癌病例組和對(duì)照組IFN-γ基因+874位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性基因型頻數(shù)和等位基因頻數(shù)差異,進(jìn)而探討IFN-γ基因與宮頸癌發(fā)生的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)對(duì)象 實(shí)驗(yàn)組：69例，漢族，其中鱗癌62例、腺癌7例,上述病例為吉林省腫瘤醫(yī)院住院病人，就診時(shí)間為2013年6月-2015年8月。經(jīng)病理切片確切診斷為宮頸癌，同時(shí)排除其他類型癌癥，年齡44.6±10.7歲；對(duì)照組：69例，漢族，為同一醫(yī)院同時(shí)期體檢正常的女性，無既往腫瘤病史，年齡45.2±9.4歲。

1.2 樣本的收集和處理 用真空采血管(5 ml，含有抗凝劑肝素鈉)收集靜脈血，采用TE飽和重蒸酚、氯仿/異戊醇混合液抽提法提取檢測(cè)對(duì)象外周血基因組DNA，-20℃保存。

1.3 引物 GenBank 檢索IFN-γ序列(NC-000012)，Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，南京金斯瑞生物科技有限公司合成。F1(上游引物)：5′-cgcgcaacacaaaatcaaatca-3′，F(xiàn)2(上游引物)：5′-cgcgcaacacaaaatcaaatct-3′，R(下游通用引物)：5′-gctacatctgaatgacctgc-3′，PCR擴(kuò)增，片段長度527 bp。

1.4 檢測(cè)基因型 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法。PCR 總的反應(yīng)體系為50 μl，PCR反應(yīng)條件：94℃ 1 min 、58℃ 50 s、72℃ 45 s，31個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物8 μl，1.0%瓊脂糖凝膠電泳電壓95V，35 min，凝膠成像系統(tǒng)分析并保存圖像。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 首先檢驗(yàn)基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律的要求，基因型和等位基因頻數(shù)的分布差異采用χ2檢驗(yàn)方法，采用SPSS13.5 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。用比值比(OR)和95%參數(shù)置信區(qū)間來評(píng)估相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)程度。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 定律檢驗(yàn)χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組基因型頻數(shù)分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律要求(P>0.05)。

2.2 基因型、等位基因分布狀況 IFN-γ基因通過PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)單核苷酸多態(tài)性可分為AA、AT和TT等三種基因型，詳見表1和圖1。同一樣本用F1、R引物及F2、R兩對(duì)引物分別擴(kuò)增，如結(jié)果均出現(xiàn)527 bp長度片段，稱為AT基因型，如只有其中一對(duì)引物可以擴(kuò)增出527 bp長度片段，稱為AA或者TT基因型。經(jīng)檢驗(yàn)，AA、AT和TT三種基因型實(shí)驗(yàn)組中的頻數(shù)分布與對(duì)照組比較具有顯著性差異(χ2=4.830，P=0.028)；AA基因型頻數(shù)分布與對(duì)照組相比較差異具有顯著性(χ2=4.182，P=0.042)；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的基因型頻數(shù)的相對(duì)危險(xiǎn)度分析后發(fā)現(xiàn)，AA / TT：OR=2.02，95%CI:1.03-3.97，AA基因型患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型的2.02倍；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中A與T兩個(gè)等位基因之間頻數(shù)分布比較具有顯著性差異(χ2=6.059，P=0.014)，相對(duì)危險(xiǎn)度分析結(jié)果，A / T ：OR=1.91，95%CI:1.14-3.20,A等位基因患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)度是T等位基因的1.91倍。

2.3 病例組中鱗癌與腺癌之間，基因型頻數(shù)和等位基因頻數(shù)相比較，差異均無顯著性，見表2。

M:Marker(DL-2000);1-2:AA基因型;3-4:AT基因型;5-6:TT基因型;PCR 產(chǎn)物長度均為527 bp

圖1 PCR產(chǎn)物電泳后AA、AT和TT三種基因型的電泳圖譜

表1 宮頸癌病例組、正常對(duì)照組基因型頻數(shù)和等位基因頻數(shù)分布狀況

表2 宮頸癌實(shí)驗(yàn)組病理類型中基因型頻數(shù)分布狀況

3 討論

目前，細(xì)胞因子與宮頸癌遺傳易感性關(guān)系的研究不斷取得進(jìn)展，研究提示[4]，IL-12A rs568408 和IL-12B rs3212227 多態(tài)性可能單獨(dú)或聯(lián)合作用影響江蘇地區(qū)女性的宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；Tamandani 等[5]研究揭示，HPV18 或 HPV18 合并16型感染患者中 IL-1RA AB 基因型患宮頸鱗癌和腺癌風(fēng)險(xiǎn)降低。IFN-γ的合成量受基因調(diào)控，存在著較大的個(gè)體差異，究其原因可能是基因調(diào)節(jié)區(qū)的多態(tài)性，或者說等位基因的多態(tài)性直接控制著IFN-γ的合成[6]。IFN-γ基因+ 874位點(diǎn)存在于IFN-γ基因第一個(gè)內(nèi)含子區(qū)域，包括 AA、AT、TT 3種基因型，轉(zhuǎn)錄因子NF-kappaB的結(jié)合位點(diǎn)剛好與+ 874 位點(diǎn)處于同一位置，此位置出現(xiàn)的SNP可直接影響到與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力，從而影響IFN-γ的轉(zhuǎn)錄[7]。據(jù)報(bào)道，IFN-γ基因第一內(nèi)含子+874位點(diǎn)多態(tài)性與腫瘤在內(nèi)的一些疾病具有相關(guān)性[8]。Kordi Tamandani等[9]經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ基因+874位點(diǎn)的AT和AA+AT基因型在印度北部人群中與宮頸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)，帶有等位基因A的個(gè)體產(chǎn)生IFN-γ的能力較低，提示+874位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性在決定個(gè)體HPV遺傳易感性方面可能承擔(dān)著十分重要的作用。

本文結(jié)果顯示，AA基因型、A等位基因可能是該群體宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。除此之外，該群體宮頸鱗癌和腺癌之間基因型頻率以及等位基因頻率相比較，均未見顯著性差異，表明本群體該位點(diǎn)SNP在宮頸癌病程中不存在組織學(xué)類型的特異性。

[1]趙方輝,喬友林.宮頸癌病因?qū)W研究進(jìn)展[J].癌癥進(jìn)展雜志,2004,2(1):39.

[2]Chevillard C,Henri S,Stefani F,et al.Two new polymer phisms in the human interferon gamma ( IFN-gamma) promoter[J].Eur J Immunogenet,2002,29 (1) :53.

[3]Lopez- Maderuelo D,Arnalich F,Serantes R,et al.Interferon-gamma and interleukin-10 gene polymor phisms in pulmonary tuberculosis[J].Am J Respir Crit Care Med,2003,167:970.

[4]陳小軍,錢年鳳,胡志斌等.IL-12A和IL-12B基因多態(tài)性與江蘇人群宮頸癌遺傳易感性相關(guān)[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,29(8):1148.

[5]Tamandani DM，Sobti RC，Shekari M et al．Impact of polymorphism in IL-1RA gene on the risk of cervical cancer[J]．Arch Gynecol Obstet,2008,277(6)：527.

[6]BEN-ARI Z,MOR E,PAPO O,et al.Cytokine gene polymorphisms in patients infected with hepatit is B virus[J].Am J Gustroenterol,2003,98:144.

[7]Pravica V,Perrey C,Stevens A,et al.A single nucleotide polyorphism in the first intron of the human IFN-γ gene:absolute correlation with a polymorphic CA microsatellite marker of high IFN-γ gene [J].Hum Immunol,2000,61(9):863.

[8]Kamali-Sarvestani E,Merat A,Talei AR.Polymorphism in the genes of alpha and beta tumor necrosis factors(TNF-alpha and TNF-beta) and gamma interferon (IFN-gamma) among Iranian women with breast cancer[J].Cancer Lett，2005，223:113.

[9]Kordi Tamandani MK,Sobti RC,Shekari M,et al.Expression and polmiorphism of IFN-gamma gene in patients with cervical cancer [J].Exp Oncol,2008,30(3):224.

1007-4287(2017)03-0498-02

2016-05-17)