糖尿病小鼠心肌組織中線粒體轉(zhuǎn)錄因子A的表達(dá)

周益盛，荊 哲，劉峰舟，高玉婷*

(1蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院安寧分院心腎內(nèi)科，蘭州 730070；2蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院心血管內(nèi)科；3第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管內(nèi)科；*通訊作者，E-mail：937027447@qq.com)

糖尿病小鼠心肌組織中線粒體轉(zhuǎn)錄因子A的表達(dá)

周益盛1，荊 哲2，劉峰舟3，高玉婷2*

(1蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院安寧分院心腎內(nèi)科，蘭州 730070；2蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院心血管內(nèi)科；3第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管內(nèi)科；*通訊作者，E-mail：937027447@qq.com)

目的 觀察db/db糖尿病小鼠與正常小鼠心肌組織中線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)的表達(dá)水平。 方法 9只雄性db/db糖尿病小鼠，隨機(jī)分為6周組(db/db 6 week)，12周組(db/db 12 week)，18周組(db/db 18 week)；正常雄性小鼠9只，隨機(jī)分為6周組(wt 6 week)，12周組(wt 12 week)，18周組(wt 18 week)，每組3只。分別用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot法檢測(cè)心肌組織中TFAM的表達(dá)。利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)心肌組織中線粒體拷貝數(shù)。 結(jié)果 db/db糖尿病小鼠TFAM的表達(dá)及線粒體拷貝數(shù)低于正常組，且隨年齡的增長(zhǎng)表達(dá)逐漸降低，同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠心肌組織中心肌組織ATP的生成明顯低于正常組水平，且隨著周齡的增長(zhǎng)，ATP的生成逐漸降低。 結(jié)論 糖尿病小鼠心肌組織中TFAM表達(dá)進(jìn)行性降低。

2型糖尿?。?心肌； 線粒體轉(zhuǎn)錄因子A； 線粒體； 小鼠

糖尿病是一種常見的由內(nèi)分泌系統(tǒng)代謝障礙引起的慢性終身疾病[1]，表現(xiàn)為高血糖、高血脂等代謝紊亂[2]，長(zhǎng)期糖尿病可導(dǎo)致心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)等多種系統(tǒng)的慢性損害[3]。近年來(lái)流行病學(xué)調(diào)查顯示，糖尿病患者中70%以上死于心血管相關(guān)性疾病，明顯高于非糖尿病患者心血管系統(tǒng)疾病。而其中糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病患者主要心臟并發(fā)癥之一[4]。糖尿病心肌病是指在糖尿病患者機(jī)體基礎(chǔ)代謝平衡紊亂的基礎(chǔ)上引發(fā)的心臟微血管病變和心肌代謝紊亂，最終導(dǎo)致心肌廣泛壞死[5]。糖尿病心肌病發(fā)病初期主要以心肌順應(yīng)性下降和舒張功能不全為主要表現(xiàn)，若患者長(zhǎng)期血糖控制不佳或治療不當(dāng)，發(fā)展至晚期則以收縮功能不全為主要表現(xiàn)，嚴(yán)重時(shí)甚至可發(fā)展為充血性心力衰竭[6]。

線粒體在維持和發(fā)揮細(xì)胞生物學(xué)功能中發(fā)揮著重要作用，是細(xì)胞生命進(jìn)程中的重要細(xì)胞器[7]。近期研究表明，細(xì)胞線粒體功能的紊亂與糖尿病心肌病的發(fā)病及進(jìn)展密切相關(guān)[8]。而其中維持一定數(shù)量正常功能的線粒體，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的發(fā)揮至關(guān)重要[9]。線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)是在哺乳動(dòng)物調(diào)控線粒體復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程的重要調(diào)控因子[10]，有研究顯示，線粒體DNA轉(zhuǎn)錄激活過程、基因組復(fù)制及調(diào)節(jié)線粒體mtDNA拷貝數(shù)，TFAM都在其中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[11]。TFAM基因位于10號(hào)染色體長(zhǎng)臂21區(qū)上，長(zhǎng)度為10-25 kb，有6個(gè)內(nèi)含子，所編碼的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為25000，包含2個(gè)短串聯(lián)的高遷移率族蛋白盒域，其間以27個(gè)氨基酸連接，其后是1個(gè)相對(duì)富含酸性氨基酸C末端[12]。已有研究證實(shí)，在心血管相關(guān)疾病中TFAM發(fā)揮著一定的調(diào)控作用[13,14]。本研究通過db/db糖尿病心肌病模型，探討不同周齡糖尿病心肌組織中TFAM的表達(dá)變化，期望進(jìn)一步闡述糖尿病心肌病中心肌線粒體DNA轉(zhuǎn)錄激活和基因組復(fù)制、線粒體mtDNA拷貝數(shù)的變化在糖尿病心肌病發(fā)生及發(fā)展中的作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與分組

正常組(wt)小鼠為c57小鼠，db/db糖尿病小鼠為近交系小鼠(C57BL/Ks)，c57及db/db糖尿病小鼠為清潔普通級(jí)動(dòng)物，購(gòu)買周齡均為3-4周，均購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK蘇2011-0003)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將9只正常雄性小鼠分為3組，每組3只，分別飼養(yǎng)至6周(wt-6w)，12周(wt-12w)，18周(wt-18w)。另將9只雄性db/db糖尿病小鼠隨機(jī)分為3組，每組3只，分別飼養(yǎng)至6周(db-6w)，12周(db-12w)，18周(db-18w)。飼養(yǎng)到對(duì)應(yīng)周齡后處死，取小鼠心臟左心室組織。

1.2 Western blot檢測(cè)TFAM蛋白表達(dá)水平

采用聚丙烯凝膠電泳(10%分離膠，5%濃縮膠)，80 V進(jìn)行上層膠電泳，120 V進(jìn)行下層膠電泳2 h后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(100 V恒壓，1 h)。5%脫脂奶粉搖床室溫封閉1 h，TFAM抗體(購(gòu)自英國(guó)abcam公司)稀釋比例為1 ∶1 000，β-actin抗體(購(gòu)自武漢三贏公司)稀釋比例為1 ∶3 000，4 ℃封閉過夜，兔二抗IgG抗體室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TFAM mRNA表達(dá)水平

采用實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)不同處理組中心肌組織TFAM的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。Trizol(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)法提取心肌組織的總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)，嚴(yán)格按照PCR檢測(cè)試劑盒的說明書操作(購(gòu)自TaKaRa公司)。擴(kuò)增TFAM基因的引物序列上游為：5′-GAAACGCCTAAAGAAGAAAGCA-3′，下游為5′-AAGTCCATGGGCTACAGAAAAA-3′;擴(kuò)增內(nèi)參GAPDH基因的引物序列上游為：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游為5′- ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)心肌組織線粒體mtDNA表達(dá)水平

方法及材料同1.3。心肌組織線粒體mtDNA基因的引物序列上游為：5′- CTGATACTAGTGGCATTCTCCGAGTTGCTGCTAAA-3′，下游為5′- TACCGGAATTCTTGTGAGGGACGGTAAAAGG-3′；擴(kuò)增內(nèi)參GAPDH基因的引物序列上游為：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。

1.5 心肌組織ATP生成的檢測(cè)

采用ATP熒光檢測(cè)法(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)。試劑準(zhǔn)備：配制1 ml 1×Reaction Buffer:50 μl 20× Reaction Buffer+950 μl去離子水。配制1 ml 10 mmol/L D-luciferin儲(chǔ)存液：將上述步驟1中的1 ml Reaction Buffer加入到一整管D-luciferin(Component A, blue cap)中；-20 ℃避光。配制100 mmol/L DTT儲(chǔ)存液：加1.62 ml水至25 mg的DTT管(Component C，black cap)-20 ℃保存，若拿出溶解，請(qǐng)放置4 ℃，勿再次凍融；稀釋ATP做標(biāo)曲。工作液制備：8.9 ml 去離子水；0.5 ml 20×Reaction Buffer (Component E)；0.1 ml 0.1 mol/L DTT；0.5 ml 10 mmol/L D-luciferin；2.5 μl firefly luciferase 5 mg/ml stock solution(Component B, red cap)；90 μl工作液+10 μl(ATP、裂解后樣本)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織TFAM mRNA表達(dá)進(jìn)行性降低

分別飼養(yǎng)db/db及正常組小鼠至6，12，18周，將此3個(gè)飼養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的不同分組的小鼠處死后，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小鼠心肌TFAM mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，db/db小鼠心肌組織中TFAM的mRNA水平明顯低于正常組水平，且隨著周齡的增長(zhǎng)表達(dá)逐漸降低(見圖1)。

2.2 心肌組織TFAM蛋白表達(dá)進(jìn)行性下降

為了進(jìn)一步明確TFAM在糖尿病心肌組織中的表達(dá)情況，采用Western blot檢測(cè)TFAM在心肌組織中的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，db/db小鼠心肌組織中TFAM的蛋白表達(dá)明顯低于正常組水平，且隨著周齡的增長(zhǎng)表達(dá)逐漸降低，這與實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果相一致(P<0.05,見圖2)。

圖1 正常組及db/db小鼠心肌組織TFAM的mRNA表達(dá)水平(n=3)Figure 1 The TFAM mRNA level in normal group and db/db mice group (n=3)

圖2 正常組及db/db小鼠心肌組織TFAM的蛋白表達(dá)水平比較 (n=3) Figure 2 The TFAM protein level by Western blot in normal group and db/db mice group (n=3)

2.3 心肌組織線粒體mtDNA拷貝數(shù)隨周齡增長(zhǎng)表達(dá)降低

為了進(jìn)一步明確TFAM是否參與影響了糖尿病心肌組織中線粒體的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)心肌組織中線粒體mtDNA的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，db/db小鼠心肌組織中心肌線粒體mtDNA拷貝數(shù)明顯低于正常組水平，且隨著周齡的增長(zhǎng)表達(dá)逐漸降低(P<0.05,見圖3)。

2.4 心肌組織ATP生成隨周齡增長(zhǎng)表達(dá)降低

TFAM與線粒體的生物學(xué)功能密切相關(guān)，為了初步研究TFAM是否影響了糖尿病心肌組織中線粒體的生物學(xué)功能，我們對(duì)心肌組織中ATP的生成進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，db/db小鼠心肌組織中心肌組織ATP的生成明顯低于正常組水平，且隨著周齡的增長(zhǎng)ATP的生成逐漸降低(P<0.01,見圖4)。

圖3 正常組及db/db小鼠心肌組織線粒體mtDNA拷貝數(shù) (n=3)Figure 3 The mtDNA copy number in normal group and db/db mice group (n=3)

圖4 正常組及db/db小鼠心肌組織ATP生成量比較 (n=3)Figure 4 The level of ATP in normal group and db/db mice group (n=3)

3 討論

城市及農(nóng)村人口中糖尿病患者呈逐年上升的趨勢(shì)，糖尿病的重要并發(fā)癥之一糖尿病心肌病對(duì)人類的健康造成嚴(yán)重的危害。近期有學(xué)者認(rèn)為，糖尿病心肌病的發(fā)生與線粒體功能的異常密切相關(guān)[15]。TFAM通過對(duì)線粒體復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控，影響線粒體DNA轉(zhuǎn)錄激活過程和基因組復(fù)制、調(diào)節(jié)線粒體mtDNA拷貝數(shù)，進(jìn)而影響線粒體的生物學(xué)功能[16]。Yue等[17]研究指出，心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷為線粒體DNA損傷所致，其機(jī)制可能與心肌細(xì)胞中TFAM的表達(dá)降低密切相關(guān)。Hickson-Bick等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在新生大鼠心肌細(xì)胞中，TFAM通過激活線粒體的生物多樣性，抑制新生大鼠心肌細(xì)胞的程序性死亡，對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。但TFAM在糖尿病心肌病中的作用及其機(jī)制尚不十分清楚。

本研究以瘦素受體敲除的db/db糖尿病小鼠為糖尿病心肌病疾病模型，首先檢測(cè)了TFAM mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果提示db/db糖尿病小鼠心肌組織中TFAM的mRNA水平明顯低于正常組，且與小鼠的周齡呈明顯的負(fù)相關(guān)。為了進(jìn)一步明確上述實(shí)驗(yàn)的可信性，采用Western blot法對(duì)TFAM的蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果相一致。TFAM通過對(duì)線粒體復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控，調(diào)節(jié)和影響線粒體mtDNA拷貝數(shù)，實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，db/db小鼠心肌組織中心肌線粒體mtDNA拷貝數(shù)明顯低于正常組水平，且隨著周齡的增長(zhǎng)表達(dá)逐漸降低。普遍研究認(rèn)為，TFAM在發(fā)揮線粒體生物學(xué)功能中起到至關(guān)重要的作用，而ATP作為提供細(xì)胞能量物質(zhì)，其主要來(lái)源于線粒體，因此，我們初步對(duì)TFAM是否對(duì)糖尿病心肌病中心肌組織線粒體ATP的生成產(chǎn)生影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠心肌組織中心肌組織ATP的生成明顯低于正常組水平，且隨著周齡的增長(zhǎng)ATP的生成逐漸降低。

綜上認(rèn)為，在糖尿病心肌病的發(fā)生及發(fā)展過程中，TFAM的表達(dá)進(jìn)行性降低，這種變化可能引起線粒體復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程調(diào)控受到影響，線粒體DNA轉(zhuǎn)錄激活和基因組復(fù)制發(fā)生異常，進(jìn)而引起線粒體mtDNA拷貝數(shù)發(fā)生改變，最終影響線粒體的生物學(xué)功能的發(fā)揮，如ATP的生成改變等，而這些改變可能最終導(dǎo)致糖尿病心肌病的發(fā)生。但由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，本實(shí)驗(yàn)僅僅是對(duì)糖尿病心肌中TFAM的表達(dá)、心肌線粒體mtDNA拷貝數(shù)及其ATP的生成的改變進(jìn)行了初步研究，并未對(duì)其具體機(jī)制進(jìn)行更深層次的研究，這也導(dǎo)致了本研究具有一定的局限性。因此，以本課題的結(jié)果為依托，課題組將在后續(xù)研究中，對(duì)TFAM在糖尿病心肌組織中的表達(dá)定位及在糖尿病心肌病中發(fā)揮作用的深層次分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究與探討，以期為糖尿病心肌病的治療提供新的潛在的治療靶點(diǎn)。

[1] Liu Q,Wang S,Cai L.Diabetic cardiomyopathy and its mechanisms: Role of oxidative stress and damage[J].J Diabetes Investig,2014,5(6):623-634.

[2] Njike VY,Ayettey R,Petraro P,etal.Walnut ingestion in adults at risk for diabetes: effects on body composition,diet quality,and cardiac riskmeasures[J].BMJ Open Diabetes Res Care,2015,3(1):e000115.

[3] Bernardi S,Michelli A,Zuolo G,etal.Update on RAAS modulation for the treatment of diabetic cardiovascular disease[J]. J Diabetes Res,2016,2016:8917578.

[4] Mizamtsidi M,Paschou SA,Grapsa J,etal.Diabetic cardiomyopathy: a clinical entity or a cluster of molecular heart changes?[J].Eur J Clin Invest,2016,46(11):947-953.

[5] Guo X,Xue M,Li CJ,etal.Protectiveeffects of triptolide on TLR4 mediated autoimmune and inflammatory response induced myocardial fibrosis in diabetic cardiomyopathy[J].J Ethnopharmacol,2016,193:333-344.

[6] Haseeb A,Bilal M,Khan MA.N-acetyl cysteine:a possible treatment for diabetic cardiomyopathy[J].J Coll Physicians Surg Pak,2016,26(8):720.

[7] Higuchi T,Miyagawa S,Pearson JT. Functional and electrical integration of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in a myocardial infarction rat heart[J]. Cell Transplant,2015,24(12):2479-2489.

[8] Sultana MR,Bagul PK,Katare PB,etal.Garlic activates SIRT-3 to prevent cardiac oxidative stress and mitochondrial dysfunction in diabetes[J]. Life Sci,2016,164:42-51.

[9] Arkat S,Umbarkar P,Singh S,etal.Mitochondrial peroxiredoxin-3 protects against hyperglycemia induced myocardial damage in diabetic cardiomyopathy[J].Free Radic Biol Med,2016,97:489-500.

[10] Vernochet C,Mourier A,Bezy O,etal.Adipose-specific deletion of TFAM increases mitochondrial oxidation and protects mice against obesity and insulin resistance[J]. Cell Metab,2012,16(6):765-776.

[11] Furukawa R,Yamada Y,Matsushima Y,etal.The manner in which DNA is packaged with TFAM has an impact on transcription activation and inhibition[J]. FEBS Open Bio,2012,2:145-150.

[12] Kang D,Kim SH,Hamasaki N.Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions[J].Mitochondrion,2007,7(1-2):39-44.

[13] Lu Y,Li S,Wu H,etal.Beneficial effects of astragaloside Ⅳ against angiotensin Ⅱ-induced mitochondrial dysfunction in rat vascular smooth muscle cells[J].Int J Mol Med,2015,36(5):1223-1232.

[14] Colom B,Oliver J,Garcia-Palmer FJ. Sexual dimorphism in the alterations of cardiac muscle mitochondrial bioenergetics associated to the ageing process[J].J Gerontol A Biol Sci Med Sci,2015,70(11):1360-1369.

[15] Boudina S,Abel ED.Diabetic cardiomyopathy revisited[J].Circulation,2007,115:3213-3223.

[16] Sultana MR,Bagul PK,Katare PB,etal.Garlic activates SIRT-3 to prevent cardiac oxidative stress and mitochondrial dysfunction in diabetes[J].Life Sci,2016,164:42-51.

[17] Yue R,Xia X,Jiang J,etal.Mitochondrial DNA oxidative damage contributes to cardiomyocyte ischemia/reperfusion-injury in rats cardioprotective role of lycopene[J].J Cell Physiol,2015,230(9):2128-2141.

[18] Hickson-Bick DL,Jones C,Buja LM.Stimulation of mitochondrial biogenesis and autophagy by lipopolysaccharide in the neonatal rat cardiomyocyte protects against programmed cell death[J].J Mol Cell Cardiol,2008,44(2):411-418.

Expression of mitochondrial transcription factor A in myocardium of diabetic mice

ZHOU Yisheng1,JING Zhe2,LIU Fengzhou3,GAO Yuting2*

(1DepartmentofCardiology,LanzhouGeneralHospital,LanzhouMilitaryRegionAnningBranchCourts,Lanzhou730070,China;2DepartmentofCardiology,LanzhouGeneralHospital,LanzhouMilitaryRegion;3DepartmentofCardiology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail：937027447@qq.com)

ObjectiveTo investigate the altered expression of mitochondrial transcription factor A in db/db diabetic mice.MethodsNine male db/db mice were randomly divided into 3 groups(db/db 6 week, db/db 12 week and db/db 18 week) according to the feeding time,and nine male normal mice were also randomly divided into 3 groups(wt 6 week,wt 12 week and wt 18 week). The expression of TFAM was detected by real-time PCR and Western blot. The mtDNA copy number was detected by real-time PCR.ResultsCompared to normal group, the expression of TFAM and the mtDNA copies were decreased significantly in db/db mice group, and decreased gradually as the prolonging of feeding. ATP level showed the same tendency.ConclusionThe expression of TFAM is gradually decreased in db/db diabetic mice.

type 2 diabetes mellitus; myocardium； TFAM； mitochondria; mice

周益盛,男,1984-01生，學(xué)士, 住院醫(yī)師，E-mail:zysgml@qq.com

2016-11-09

R587.1

A

1007-6611(2017)03-0211-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.003