硒元素及硒結(jié)合蛋白1在消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤中的表達(dá)及意義

梁 鋼，趙婷婷，肖 虹，張 進(jìn)，董金龍

(1山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科，太原 030001;2太原師范學(xué)院化學(xué)系;3山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普通外科)

硒元素及硒結(jié)合蛋白1在消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤中的表達(dá)及意義

梁 鋼1，趙婷婷2，肖 虹1，張 進(jìn)3，董金龍2

(1山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科，太原 030001;2太原師范學(xué)院化學(xué)系;3山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普通外科)

目的 研究食管癌、胃癌及結(jié)直腸癌腫瘤組織、癌旁組織中硒元素(selenium,Se)含量及硒結(jié)合蛋白1(selenium binding protein 1,SBP1)的表達(dá)。 方法 收集山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)的癌旁組織各30例,采用原子吸收光譜法檢測(cè)各組織中Se元素的含量,Western blot檢測(cè)SBP1蛋白的表達(dá)。分析SBP1的表達(dá)量與患者臨床病理特征之間的關(guān)系。 結(jié)果 與癌旁組織相比,食管癌、胃癌及結(jié)直腸癌癌組織中Se元素含量明顯降低,SBP1的表達(dá)量顯著下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);食管癌中SBP1蛋白的表達(dá)在不同性別、年齡、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中無(wú)顯著差異(P>0.05),胃癌及結(jié)直腸癌中SBP1在TNM分期Ⅲ+Ⅳ及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)顯著低于TNM分期Ⅰ+Ⅱ及淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移的患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),SBP1蛋白的表達(dá)在不同性別、年齡、分化程度的胃癌及結(jié)直腸癌患者中無(wú)顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論 Se元素及SBP1在食管癌、胃癌及結(jié)直腸癌組織中下調(diào),SBP1的低表達(dá)可能與胃癌、結(jié)直腸癌的進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)。

食管癌； 胃癌； 結(jié)直腸癌； 硒元素； 硒結(jié)合蛋白1

近年來(lái),隨著生活節(jié)奏的加快、飲食結(jié)構(gòu)的變化以及生態(tài)環(huán)境的改變,我國(guó)消化道腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)[1]。硒元素(selenium,Se)是人體必需微量元素,也是目前公認(rèn)的具有抗腫瘤作用的元素之一[2],其主要通過抑制腫瘤細(xì)胞蛋白合成、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗氧化損傷、誘導(dǎo)抑癌基因轉(zhuǎn)錄等發(fā)揮抗癌作用[3]。Se元素在體內(nèi)主要以結(jié)合蛋白的形式儲(chǔ)存和發(fā)揮作用,硒結(jié)合蛋白1(selenium binding protein1,SBP1)是Se結(jié)合蛋白的重要成員之一[4],據(jù)報(bào)道,SBP1具有遏制細(xì)胞增殖的功能,SBP1表達(dá)異常可能是腫瘤發(fā)生、進(jìn)展的重要分子生物事件[5]。本研究以消化道常見的惡性腫瘤食管癌、胃癌及結(jié)直腸癌為研究對(duì)象,分析三種腫瘤癌組織及相應(yīng)癌旁組織中Se元素含量的水平及SBP1的表達(dá)量,分析SBP1的表達(dá)量與患者臨床病理特征之間的關(guān)系,為消化道惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制及預(yù)防提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及一般資料

收集2014-01～2016-01山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院手術(shù)切除的食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌癌組織及相應(yīng)癌旁組織各30例,要求:①患者無(wú)廠礦區(qū)工作、生活史以及含硒保健品、藥物等服用史。②腫瘤系原發(fā),患者術(shù)前未經(jīng)任何放化療。③腫瘤組織經(jīng)取材后不影響病理診斷及腫瘤分期。所有標(biāo)本術(shù)后經(jīng)兩名病理醫(yī)師診斷確診,腫瘤分期按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)第七版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行?；颊叩呐R床病理資料:①食管癌:男19例,女11例;平均年齡(56.4±8.5)歲;高分化14例,中低分化16例;Ⅰ+Ⅱ期23例,Ⅲ+Ⅳ期7例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例,未轉(zhuǎn)移21例,組織學(xué)類型均為鱗狀細(xì)胞癌。②胃癌:男13例,女17例;平均年齡(60.2±10.6)歲;高分化8例,中低分化22例;Ⅰ+Ⅱ期13例,Ⅲ+Ⅳ期17例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例,未轉(zhuǎn)移18例,組織學(xué)類型均為腺癌。③結(jié)直腸癌:男12例,女18例;平均年齡(58.5±12.7)歲;高分化6例,中低分化24例;Ⅰ+Ⅱ期20例,Ⅲ+Ⅳ期10例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例,未轉(zhuǎn)移20例,組織學(xué)類型均為腺癌。

1.2 原子吸收光譜法檢測(cè)硒元素含量

標(biāo)本離體后去除周圍出血壞死組織,蒸餾水反復(fù)沖洗,濾紙吸干,烤箱烘干,電子天平稱取腫瘤組織及瘤旁組織各0.5 g。將組織置于錐形瓶中加入混酸(硝酸與高氯酸體積比為4 ∶1)消化,去離子水定容至10 ml。硒元素用1 000 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)逐步稀釋,分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度值,繪制工作曲線,采用石墨爐原子吸收光譜儀進(jìn)行元素含量檢測(cè)。

1.3 蛋白印跡試驗(yàn)檢測(cè)SBP1蛋白表達(dá)量

稱取0.5 g癌組織及癌旁組織,置于勻漿管中,用眼科彎剪將組織盡量剪碎,吸取WIP組織裂解液(北京賽馳生物)1 ml加勻漿管中混勻,冰上勻漿。恒溫離心10 min(4 ℃,10 000 r/min),吸取上清液,分光光度計(jì)檢測(cè)OD值,按照蛋白定量試劑盒(武漢博士德生物)所示步驟計(jì)算蛋白濃度。將上樣緩沖液與待測(cè)蛋白以1 ∶1混勻放入EP管中,煮沸蛋白樣本5 min。配制濃縮膠與分離膠,將待測(cè)蛋白加至泳道,加入電極緩沖液,預(yù)電泳30 min(電壓60 V),電泳45 min(電壓100 V)。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜25 min(電壓100 V)。加一抗SBP1(英國(guó)abcam)濃度為1 ∶1 000,GAPDH(美國(guó)Santa cruz)濃度為1 ∶1 000,4 ℃冰箱過夜,加二抗(福州邁新生物)濃度1 ∶3 000,室溫反應(yīng)60 min,ECL發(fā)光液(北京普利萊生物)顯色,凝膠成像系統(tǒng)曝光顯色;采用Bandscan軟件進(jìn)行目的條帶灰度分析,SBP1蛋白的灰度值除以GAPDH的灰度值為SBP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,Se元素含量以及SBP1的相對(duì)表達(dá)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩樣本資料比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種癌組織及癌旁組織中硒元素的含量

硒元素檢測(cè)工作曲線:YSe=0.031 6XSe+0.018 0(r=0.998 8)。與相應(yīng)的癌旁組織相比,三種癌組織中硒元素含量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

表1 三種癌及癌旁組織中硒元素的含量 (μg/g)

Table 1 The contents of selenium in three kinds of cancer tissues and adjacent tissues (μg/g)

2.2 三種癌組織及癌旁組織中SBP1蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示:SBP1蛋白及GAPDH分別在52 kD、36 kD處出現(xiàn)顯影條帶(見圖1)。以SBP1與GAPDH灰度值之比作為SBP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量,與相應(yīng)的癌旁組織相比,三種癌組織中SBP1蛋白表達(dá)顯著下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05,見表2)。

表2 三種癌及癌旁組織中SBP1的相對(duì)表達(dá)量

Table 2 The relative expression of SBP1 in three kinds of cancer tissues and adjacent tissues

組別食管癌胃癌結(jié)直腸癌癌組織0279±01340211±00910240±0102癌旁組織0419±01080391±01250408±0131t-2851-4265-3688P000900000001

圖1 SBP1蛋白在三種癌及癌旁組織中的表達(dá)Figure 1 The relative expression of SBP1 in three kinds of cancer tissues and adjacent tissues by Western blot

2.3 三種癌組織中SBP1蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

食管癌中SBP1蛋白的表達(dá)在不同性別、年齡、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中無(wú)顯著差異(P>0.05),胃癌及結(jié)直腸癌中SBP1在TNM分期Ⅲ+Ⅳ及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)顯著低于TNM分期Ⅰ+Ⅱ及淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移的患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表3)。

表3 SBP1的表達(dá)與三種癌臨床病理特征的關(guān)系

Table 3 Relationships between expression of SBP1 protein and clinicopathological features in three kinds of cancer tissues

臨床病理指標(biāo)n食管癌SBP1表達(dá)量n胃癌SBP1表達(dá)量n結(jié)直腸癌SBP1表達(dá)量性別 男190269±0122130208±0049120232±0105 女110291±0129170214±0120180246±0076年齡 <平均年齡120307±0104100229±0066120284±0098 ≥平均年齡180254±0159200196±0110180188±0085分化程度 高分化140312±018780243±008360262±0083 中低分化160250±0116220174±0091240214±0115TNM分期 Ⅰ+Ⅱ230325±0148130257±0081?200296±0065? Ⅲ+Ⅳ70238±0124170158±0075100174±0097淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 是90247±0169120137±0080▲100162±0050▲ 否210315±0153180276±0065200307±0101

①與Ⅲ+Ⅳ相比,*P<0.05;胃癌組t=-2.458,P=0.029;結(jié)直腸癌組t=-2.806,P=0.015；②與淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組相比,▲P<0.05;胃癌組t=-4.556,P=0.001;結(jié)直腸癌組t=-3.936,P=0.002

3 討論

微量元素的病理性蓄積或者減少在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[6]。Se元素是人體所必需的微量元素之一,其抗腫瘤作用已被廣泛認(rèn)同,被譽(yù)為“抗癌之王”。Se元素與多種惡性腫瘤之間存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系,Se含量降低會(huì)大大增加腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[7,8],本研究結(jié)果顯示,與相應(yīng)的癌旁組織相比,三種癌組織中Se元素含量降低,提示Se元素含量下降可能與消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生存在一定的關(guān)系,生態(tài)學(xué)研究表明Se元素?cái)z入與結(jié)直腸癌等腫瘤的發(fā)病危險(xiǎn)性呈負(fù)相關(guān)[9],缺Se地區(qū)腫瘤的發(fā)病率明顯增高,而補(bǔ)Se則能降低腫瘤的發(fā)病率和致死率[10]。

SBP1是硒結(jié)合蛋白的一種,其基因位于1號(hào)染色體,編碼含640個(gè)氨基酸的蛋白[11],SBP1是Se元素在體內(nèi)發(fā)揮生物活性的重要媒介,SBP1是一種保護(hù)性蛋白,在卵巢癌、肺癌、宮頸癌等大多數(shù)惡性腫瘤組織中SBP1的表達(dá)水平均下調(diào)[4,12],其表達(dá)降低可能是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵步驟,體外研究證實(shí):過表達(dá)SBP1的腫瘤細(xì)胞遷徙和侵襲能力降低,因此SBP1可視為腫瘤治療的基因靶點(diǎn)。本研究結(jié)果表明,與相應(yīng)的癌旁組織相比,三種癌組織中SBP1蛋白表達(dá)顯著下調(diào),與Se元素的絕對(duì)含量下降呈一致趨勢(shì),據(jù)報(bào)道:SBP1在腫瘤中的表達(dá)下降可能是由于SBP1基因啟動(dòng)子區(qū)超甲基化引起的轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)[13]。通過與患者的臨床病理指標(biāo)結(jié)合分析發(fā)現(xiàn),胃癌及結(jié)直腸癌中SBP1在TNM分期Ⅲ+Ⅳ及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)顯著高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ及淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移的患者,說(shuō)明SBP1的低表達(dá)與胃癌、結(jié)直腸癌患者的腫瘤進(jìn)展程度相關(guān),SBP1低表達(dá)可能提示患者預(yù)后不良。

綜上所述,Se元素及SBP1蛋白在消化道常見惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào),我們相信隨著對(duì)Se及相關(guān)結(jié)合蛋白的深入研究,Se有望成為腫瘤預(yù)防及治療的可靠靶點(diǎn)。

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Expression and significance of selenium element and selenium binding protein 1 in common gastrointestinal malignancies

LIANG Gang1,ZHAO Tingting2,XIAO Hong1,ZHANG Jin3,DONG Jinlong2

(1DepartmentofPathology,FirstHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2DepartmentofChemistry,TaiyuanNormalUniversity;3DepartmentofGeneralSurgery,FirstHospitalofShanxiMedicalUniversity)

ObjectiveTo investigate the selenium(selenium,Se)content and selenium-binding protein 1(selenium binding protein1,SBP1)expression in esophageal cancer,gastric cancer and colorectal cancer tissues and adjacent tissues.MethodsThirty cases of esophageal cancer,their gastric cancer,30 cases of colorectal cancer tissues and their corresponding adjacent cancer tissues were collected.Se element content was detected by atomic absorption spectrometry.Western blot was used to detect the expression of SBP1 protein.The relationship between the expression of SBP1 and clinical pathological characteristics was analyzed.ResultsCompared with the adjacent tissues,the content of Se and the expression of SBP1 were significantly reduced in esophageal cancer,gastric cancer and colorectal cancer tissues(P<0.05).In esophageal cancer tissues,there was no significant difference in SBP1 protein expression among patients with different clinicopathological features(P>0.05).In gastric cancer and colorectal cancer tissues,SBP1 expression in TNM stage Ⅲ+Ⅳ and lymph node metastasis were significantly lower than that of patients with TNM stage Ⅰ+Ⅱ and without lymph node metastasis,respectively(P<0.05).The expression of SBP1 protein was not related with sex,age,degree of differentiation in patients with gastric cancer and colorectal cancer(P>0.05).ConclusionSe elements and SBP1 protein are down-regulated in esophageal,gastric and colorectal cancer tissues, and the low expression of SBP1 may be related to the progression and prognosis of gastric cancer and colorectal cancer.

esophageal cancer； gastric cancer； colorectal cancer； selenium； selenium binding protein 1

山西省軟科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2016042008-1)

梁 鋼，男，1985-02生，碩士，主治醫(yī)師，E-mail:pathology_1282@163.com

2016-10-13

R730.231

A

1007-6611(2017)03-0256-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.012