脂聯(lián)素及其受體在高血壓小鼠血管平滑肌中的表達及其作用機制

郭瑞敏，韓 敏，孫燕妮

(上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院急診內(nèi)科，上海 200062；*通訊作者，E-mail：sunstone1974@163.com)

脂聯(lián)素及其受體在高血壓小鼠血管平滑肌中的表達及其作用機制

郭瑞敏，韓 敏，孫燕妮*

(上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院急診內(nèi)科，上海 200062；*通訊作者，E-mail：sunstone1974@163.com)

目的 觀察血管原位組織中脂聯(lián)素(adiponectin，APN)及AdipoR的表達及其在高血壓血管損傷中的作用，并分析其可能的機制。 方法 采用免疫印跡檢測正常血管平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞及脂肪細胞中APN及AdipoR的表達。采用免疫印跡分別檢測血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)處理的脂肪細胞中APN的表達及血管平滑肌細胞中AdipoR的表達。成年雄性C57BL/6小鼠分為對照組和Ang Ⅱ誘導血管損傷組，免疫熒光檢測血管組織APN及AdipoR的表達。Transwell遷移實驗檢測APN對血管平滑肌細胞的遷移調(diào)控作用。 結(jié)果 免疫印跡結(jié)果顯示，內(nèi)皮細胞APN表達量較少，脂肪細胞大量表達APN，血管平滑肌細胞未檢測到APN的表達。APN受體AdipoR廣泛分布于血管各層細胞中。Ang Ⅱ誘導血管損傷后管周脂肪細胞APN的表達降低(11.7%±3.6%vs3.0%±1.5%)，同時血管平滑肌細胞及內(nèi)皮細胞的AdipoR1(13.2%±4.0%vs2.7%±1.6%)和AdipoR2(22.4%±7.1%vs5.7%±1.2%)的表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義。細胞實驗證實Ang Ⅱ抑制脂肪細胞APN以及血管平滑肌細胞AdipoR的表達。利用免疫熒光技術進一步證實了血管原位的APN及AdipoR表達分布與體外研究結(jié)果一致。APN重組蛋白抑制Ang Ⅱ誘導的血管平滑肌細胞的遷移以及P38 MAPK信號通路的活化(1.2±0.08vs2.3±0.46)，差異具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論 本研究證實Ang Ⅱ誘導管周脂肪APN的表達降低以及血管原位AdipoR的降低，參與血管損傷過程的調(diào)節(jié)。

脂聯(lián)素； 脂聯(lián)素受體； 高血壓； 血管平滑肌細胞

近年來的研究表明脂肪組織也具有活躍的內(nèi)分泌功能，可以分泌和釋放多種脂肪因子、炎癥因子[1,2]。這些細胞因子在體內(nèi)行使多種功能，在糖代謝、免疫炎性反應及心血管疾病中起重要作用。在諸多脂肪因子中，脂聯(lián)素(adiponectin，APN)的血漿含量最高。最近研究發(fā)現(xiàn)，APN可通過內(nèi)分泌和/或旁分泌途徑進入血管組織，調(diào)節(jié)平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和凋亡等病理生理過程，在動脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用[3,4]。APN存在2種受體，分別命名為APN受體1(AdipoR1)和APN受體2(AdipoR2)，其結(jié)構相似，均為包含7個跨膜區(qū)域的蛋白質(zhì)，廣泛表達于機體各組織中[4,5]。已有的研究證實Ang Ⅱ通過促進VSMCs的遷移參與血管損傷過程的調(diào)控[6]，但是APN及其受體是否參與這一過程仍不清楚。關于APN及其受體與心肌缺血、糖尿病等的發(fā)生發(fā)展已有較多文獻報道，然而關于APN及其受體是否參與高血壓血管損傷過程目前還不清楚。本研究通過建立血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓模型，檢測APN及其受體在血管組織的表達分布，并探討APN對血管細胞生物學功能的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

APN羊多克隆抗體(R&D公司，美國)；AdipoR1和AdipoR2羊多克隆抗體(Abcam公司，英國)；β-actin鼠單克隆抗體(Sigma公司，美國)；磷酸化p38(p-p38)和總p38(t-p38)抗體(Cell Signaling Technology公司，美國)；Transwell 細胞遷移板(Corning公司，美國)，胎牛血清及DMEM細胞培養(yǎng)液(HyClone公司，美國)。

1.2 動物模型制備

成年雄性C57BL/6小鼠，體重(25±2)g，上海斯萊克實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2012-0002，動物使用許可證號：SYXK(滬)2011-0113。12只小鼠隨機分為對照組(n=6)，Ang Ⅱ植入式膠囊滲透壓泵灌注損傷組[1 mg/(kg·min)，14 d，n=6]。造模方法：將動物腹腔注射水合氯醛(0.3 g/kg)麻醉，背部肩胛骨處切口，植入AngⅡ滲透壓泵，縫合皮膚。對照小鼠的基本操作方法與上述相同，但植入PBS泵。

1.3 小鼠血管組織病理學檢測

模型制備14 d后，水合氯醛(0.3 g/kg)麻醉，處死小鼠，取胸主動脈，用PBS緩沖液沖洗殘余的血液，用4%多聚甲醛固定，石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察血管結(jié)構。冰凍切片免疫熒光染色：按上述方法取材，固定，OCT冰凍包埋劑包埋。將冰凍切片破膜封閉固定后，分別滴加20 μl一抗(APN，Adipo R1，AdipoR2 1 ∶100稀釋)將標本覆蓋，室溫孵育2 h后加二抗(1 ∶200)，室溫孵育1 h，4’,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)染細胞核20 min，室溫，封片，Zeiss熒光顯微鏡檢測蛋白表達。

1.4 細胞培養(yǎng)

小鼠血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)培養(yǎng)：取正常小鼠胸主動脈置于含200 U/ml Ⅱ型膠原酶的DMEM中，37 ℃孵育10 min，鑷子小心剝離外膜。175 U/ml Ⅱ型膠原酶和4 U/ml Ⅰ型彈性蛋白酶37 ℃消化中膜30-45 min。待中膜平滑肌消化后，200×g離心5 min，重懸于2 ml含20% FBS的DMEM中培養(yǎng)。實驗均使用90%融合的第4-6代VSMC，待靜止24 h后，使用Ang Ⅱ處理0，6，12，24 h，對照組不做任何處理等待0，6，12，24 h收集。為檢測APN的保護作用，VSMCs使用APN預處理1 h后，再加Ang Ⅱ刺激。

3T3-L1脂肪細胞培養(yǎng)：3T3-L1前體細胞生長融合后，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，換成分化液A(10%FBS-DMEM，IBMX 0.5 mmol/L，地塞米松1 μmol/L，胰島素10 μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h，換成分化液B(10%FBS-DMEM，胰島素10 μg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h，換成新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h，即可得到成熟的脂肪細胞C，待靜止24 h后，使用Ang Ⅱ處理0，6，12，24 h，對照組不做任何處理等待0，6，12，24 h收集。

1.5 Western blot檢測APN及AdipoR蛋白表達

培養(yǎng)細胞加入細胞裂解液，冰浴20 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，測定蛋白濃度。取各組細胞蛋白10 g經(jīng)含SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛乳封閉1 h，加入一抗(1 ∶1 000)室溫孵育2 h，用HRP標記的二抗室溫孵育2 h，洗膜后經(jīng)ECL顯色，暗室曝光。

1.6 Transwell細胞遷移實驗

取適量血管平滑肌細胞，完全吸盡上清，加入DMEM，細胞密度為106/ml，吹打均勻。細胞懸液分為4組，分別為對照組，Ang Ⅱ組，Ang Ⅱ加APN(1 μg/ml)，Ang Ⅱ加APN(10 μg/ml)。Transwell下室加入600 ml DMEM和Ang Ⅱ及APN，將上述細胞懸液接種到Transwell上室中(200 ml/小室)放入37 ℃孵箱培養(yǎng)6 h，然后從孵箱中取出Transwell，將上室取出用棉簽輕輕搽拭上室內(nèi)側(cè)壁，PBS洗3遍冰乙醇固定4 ℃ 15 min，PBS洗3遍，每次5 min，蘇木素染色室溫下5 min，水洗伊紅A和B分別染色，室溫下5 min，水洗，放置顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野(×200)，細胞計數(shù)取其平均數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 APN及其受體在血管細胞的表達

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示：APN在內(nèi)皮細胞表達相對較少，主要表達于脂肪細胞(adipocyte)，在血管平滑肌細胞很少表達；而脂聯(lián)素受體Adipo R1和Adipo R2在脂肪細胞，平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞都有表達(見圖1)。

圖1 脂聯(lián)素(APN)及其受體(AdipoR1、AdipoR2)在胸主動脈血管細胞的表達Figure 1 Expression of APN and APN receptors in the vascular cells and adipocytes from thoracic aorta

2.2 APN及其受體在高血壓血管組織的表達分布

與對照組相比，損傷組(Ang Ⅱ灌注制備高血壓小鼠模型)蘇木素-伊紅(HE)染色顯示胸主動脈血管壁顯著增厚，尤以中膜平滑肌為主。組織免疫熒光染色顯示APN主要表達于管周脂肪細胞，損傷組小鼠管周脂肪組織脂聯(lián)素表達與對照組相比顯著減少(3.0%±1.5%vs11.7%±3.6%，見圖2A)。與細胞蛋白表達結(jié)果相似，APN受體Adipo R1和Adipo R2廣泛表達于血管壁各層組織，包括內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、管周脂肪細胞，并且與對照組相比，損傷組小鼠血管壁Adipo R1(13.2%±4.0%vs2.7%±1.6%)和Adipo R2(22.4%±7.1%vs5.7%±1.2%)表達顯著減少(見圖2B，C)。

2.3 AngⅡ抑制脂肪細胞APN表達

體外培養(yǎng)3T3-L1脂肪細胞，AngⅡ(100 nmol/L)刺激呈時間依賴性抑制APN在脂肪細胞的表達，減少55%±10.6%(見圖3)，培養(yǎng)24 h表達最少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。正常對照脂肪細胞在靜止狀態(tài)下不加Ang Ⅱ刺激，24 h內(nèi)APN表達無顯著差異。

藍色為DAPI染色，顯示細胞核；損傷組表示血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)灌注高血壓模型小鼠，對照組表示正常對照；與對照組比較，*P<0.05圖2 脂聯(lián)素(APN)及其受體(AdipoR)在胸主動脈血管原位的表達Figure 2 APN and APN receptors expression and distribution in the vasculature of Ang Ⅱ-induced vascular injury mice

圖3 血管緊張素Ⅱ抑制脂肪細胞脂聯(lián)素(APN)的表達Figure 3 Ang Ⅱ inhibits APN expression in the adipocytes

2.4 AngⅡ抑制血管平滑肌細胞APN受體表達

體外培養(yǎng)AngⅡ刺激原代培養(yǎng)的血管平滑肌細胞(VSMCs)，呈時間依賴性抑制AdipoR1(減少54%±6.1%)和Adipo R2(減少53%±5.3%)的表達(見圖4)，培養(yǎng)24后表達最少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。正常對照VSMCs在靜止狀態(tài)下不加Ang Ⅱ刺激，AdipoR的表達無顯著差異。

2.5 APN抑制AngⅡ誘導的血管平滑肌細胞遷移

利用APN預處理VSMCs后，再給予AngⅡ刺激，結(jié)果顯示APN(10 mg/ml)預處理能顯著抑制AngⅡ誘導的VSMCs的遷移(1.83±0.46vs5.58±0.58)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖5)。

2.6 APN通過MAPK通路抑制AngⅡ誘導的血管平滑肌細胞遷移

MAPK通路p38激酶的蛋白免疫印跡結(jié)果顯示APN可以抑制AngⅡ誘導的p38激酶磷酸化(1.2±0.08vs2.3±0.46)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖6)。

圖4 血管緊張素Ⅱ抑制血管平滑肌細胞AdipoR1和AdipoR2的表達Figure 4 Ang Ⅱ inhibits APN receptors expression in the VSMCs

與正常對照組比較，*P<0.05；與AngⅡ組比較，#P<0.05圖5 脂聯(lián)素(APN)抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的血管平滑肌細胞的遷移Figure 5 APN inhibits Ang Ⅱ-induced VSMCs migration

與正常對照組比較，*P<0.05；與AngⅡ組比較，#P<0.05圖6 脂聯(lián)素(APN)抑制血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)誘導的血管平滑肌細胞p38 MAPK激酶的磷酸化Figure 6 APN inhibits Ang Ⅱ-induced p38 phosphorylation(p-p38)in the VSMCs

3 討論

本研究通過建立AngⅡ誘導的高血壓動物模型，觀察了APN及其受體在血管組織的分布，結(jié)果顯示APN主要表達于血管外周脂肪細胞，而其受體Adipo R1和Adipo R2則主要分布于血管組織，尤其在中膜平滑肌。在AngⅡ誘導的高血壓動物模型，其血管周脂肪APN表達顯著減少，同時體外培養(yǎng)的脂肪細胞證實Ang Ⅱ呈時間依賴性的抑制APN的表達。APN是由約240個氨基酸組成的分泌蛋白，分子量約30 kD,包含4個結(jié)構域，從N端到C端分別是20殘基信號序列、N端非同源序列、膠原樣結(jié)構域和C端球狀結(jié)構域。APN作為一種重要的抗炎性的脂肪因子，近年來其在代謝、血管損傷等方面的保護作用已逐漸被人們所認知[7,8]。APN通過活化AMPK通路，促進內(nèi)皮細胞eNOS的表達，增加NO的釋放，并誘導內(nèi)皮細胞的增殖，進而參與急性血管損傷的修復過程。同時APN可以抑制堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)誘導的VSMC的增殖和遷移作用，從而抑制血管損傷過程中新生內(nèi)膜的形成[7,9]。本研究發(fā)現(xiàn)在高血壓慢性血管損傷模型中發(fā)現(xiàn)高血壓引起血管周圍脂肪APN的表達降低，并且RAS系統(tǒng)的激活抑制脂肪細胞APN的表達。已有研究證實VSMCs遷移能力的改變是血管重塑過程的重要生物學基礎，多種血管活性物質(zhì)包括Ang Ⅱ都能刺激VSMCs的遷移，其中MAPK信號通路的活化起著關鍵的調(diào)控作用[10]。本研究提示APN能抑制Ang Ⅱ誘導的VSMCs的遷移及MAPK家族關鍵成員p38激酶的活化。這些結(jié)果提示RAS系統(tǒng)激活除直接作用于心血管系統(tǒng)外，可能也通過調(diào)控脂肪細胞脂肪因子APN的表達，進而抑制VSMCs活化遷移，減輕高血壓血管損傷。

脂聯(lián)素主要通過自身受體發(fā)揮生物學調(diào)控作用，目前已知受體為AdipoR1和AdipoR2，這兩種受體廣泛分布于全身各個器官和組織。脂聯(lián)素受體不同于GPCR受體家族，其屬于PAQR受體家族，N端位于胞內(nèi)，而C端位于胞外，介導APN的生物學作用。盡管在各組織都有廣泛表達，但是AdipoR1和AdipoR2還是存在組織間的差異性，如AdipoR1主要表達于骨骼肌組織，AdipoR2主要表達于肝臟中[11,12]。本研究對血管組織中的AdipoR的分布進行了觀察，結(jié)果提示AdipoR1和AdipoR2廣泛表達于管周脂肪細胞、血管平滑肌細胞以及內(nèi)皮細胞中。已有研究表明在代謝性疾病模型中，脂肪細胞AdipoR表達會顯著降低；與之相反，在慢性腎臟病疾病動物模型中，腎臟組織原位AdipoR表達顯著增加[13]，提示在不同的疾病模型中，AdipoR的變化存在一定差異。本研究在高血壓動物模型中發(fā)現(xiàn)，血管組織的AdipoR的表達顯著降低，在體外培養(yǎng)的主動脈原代平滑肌細胞也發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ刺激能抑制VSMC的AdipoR表達。

綜上所述，本研究表明在Ang Ⅱ誘導的高血壓動物模型，管周脂肪細胞APN表達以及血管各層組織中AdipoR的表達均明顯降低，外源性APN可以抑制AngⅡ引起的p38 MAPK信號通路的活化，并抑制血管平滑肌細胞的遷移，證實p38信號通路可能是APN的作用靶點。這些結(jié)果提示APN及其受體可能作為潛在的干預靶點為防治高血壓血管損傷提供新的治療思路。

[1] Thalmann S,Meier CA.Local adipose tissue depots as cardiovascular risk factors[J].Cardiovasc Res,2007,75(4):690-701.

[2] Molica F,Morel S,Kwak BR,etal.Adipokines at the crossroad between obesity and cardiovascular disease[J].Thromb Haemost,2015,113(3):553-566.

[3] Li FY,Cheng KK,Lam KS,etal.Cross-talk between adipose tissue and vasculature:role of adiponectin[J].Acta Physiol(Oxf),2011,203(1):167-180.

[4] Wang ZV,Scherer PE.Adiponectin,the past two decades[J].J Mol Cell Biol,2016,8(2):93-100.

[5] Yamauchi T,Kamon J,Ito Y,etal.Cloning of adiponectin receptors that mediate antidiabetic metabolic effects[J].Nature,2003,423(6941):762-769.

[6] Montezano AC,Nguyen Dinh Cat A,Rios FJ,etal.Angiotensin II and vascular injury[J].Curr Hypertens Rep,2014,16(6):431.

[7] Lee S,Kwak HB.Role of adiponectin in metabolic and cardiovascular disease[J].J Exerc Rehabil,2014,10(2):54-59.

[8] Chakraborti CK.Role of adiponectin and some other factors linking type 2 diabetes mellitus and obesity[J].World J Diabetes,2015,6(15):296-1308.

[9] Freitas Lima LC,Braga VA,do Socorro de Franca Silva M,etal.Adipokines,diabetes and atherosclerosis:an inflammatory association[J].Front Physiol,2015,6:304.

[10] Ndisang JF,Jadhav A.Heme arginate therapy enhanced adiponectin and atrial natriuretic peptide,but abated endothelin-1 with attenuation of kidney histopathological lesions in mineralocorticoid-induced hypertension[J].J Pharmacol Exp Ther,2010,334(1):87-98.

[11] Yamauchi T,Kadowaki T.Adiponectin receptor as a key player in healthy longevity and obesity-related diseases[J].Cell Metab,2013,17(2):185-196.

[12] Lustig Y,Hemi R,Kanety H.Regulation and function of adiponectin receptors in skeletal muscle[J].Vitam Horm,2012,90:95-123.

[13] Yu Y,Bao BJ,Fan YP,etal.Changes of adiponectin and its receptors in rats following chronic renal failure[J].Ren Fail,2014,36(1):92-97.

Expression and its mechanism of adiponectin and its receptors in the vacular smooth muscle of hypertension mice

GUO Ruimin,HAN Min,SUN Yanni*

(DepartmentofEmergencyMedicine,PutuoHospitalAffiliatedToShanghaiTraditionalChineseMedicineUniversity，Shanghai200062，China;*Correspondingauthor,E-mail:sunstone1974@163.com)

ObjectiveTo explore the role of APN and APN receptor expression in the hypertensive vascular injury and its possible

adiponectin； adiponectin receptors； hypertension； vascular smooth muscle cells

上海中醫(yī)藥大學預算內(nèi)項目(2016YSN59)

郭瑞敏，女，1977-05生，碩士，主治醫(yī)師，E-mail：guoruimin13597632359@126.com

2016-12-23

R544.1

A

1007-6611(2017)03-0205-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.002