宮腔灌注基因重組人絨毛膜促性腺激素聯(lián)合靜脈注射阿托西班在反復(fù)著床失敗凍融周期囊胚移植中的臨床效果

劉杰 鄭潔 雷亞蘭 夏敏 孫虹

胚胎著床受諸多因素的精細(xì)調(diào)控，成功的胚胎植入必須有同步發(fā)育的正常胚胎、容受性的子宮內(nèi)膜以及胚胎-母體之間不斷進(jìn)行相互對(duì)話來(lái)實(shí)現(xiàn)。有研究認(rèn)為胚胎移植反復(fù)著床失敗(repeated implantation failure ，RIF)的主要原因是子宮內(nèi)膜容受性不良[1]。如何改善子宮內(nèi)膜的容受性、增加母-胎之間的相互交流，以提高胚胎種植成功率是生殖醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)問(wèn)題。胚胎在移植入宮腔后呈游走狀態(tài)，大約30%的患者在移植后出現(xiàn)子宮收縮活動(dòng)增加[2]。在胚胎移植前使用縮宮素受體拮抗劑阿托西班則可有效減少子宮內(nèi)膜蠕動(dòng)，抑制子宮收縮，明顯提高RIF患者的臨床妊娠率和胚胎著床率[3]。人絨毛膜促性腺激素(hCG)是種植前胚胎所分泌的早期信號(hào)分子,它啟動(dòng)和控制胎盤(pán)絨毛膜細(xì)胞的侵襲及種植，在胚胎著床及妊娠的維持中發(fā)揮重要作用。在胚胎移植前宮腔灌注hCG可明顯改善卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(intracytoplasmic sperm injection ，ICSI)患者的臨床妊娠結(jié)局[4]。能否在增加宮腔內(nèi)著床相關(guān)因子濃度的同時(shí)有效抑制子宮收縮，進(jìn)一步提高RIF患者的妊娠率？本研究基于此，納入反復(fù)著床失敗后再次行凍融胚胎復(fù)蘇囊胚移植的患者，移植前半小時(shí)靜脈推注縮宮素受體拮抗劑阿托西班，并于移植前7 min行宮腔內(nèi)灌注rhCG，觀察其對(duì)臨床結(jié)局的影響。

資料與方法

1.研究對(duì)象：選取2014年6月—2016年6月因女方輸卵管因素或男方因素在本院生殖醫(yī)學(xué)中心行體外受精/卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection,IVF/ICSI)治療反復(fù)移植失敗，再次行凍融胚胎囊胚培養(yǎng)或凍融囊胚移植的病例，納入標(biāo)準(zhǔn)為(1)女性年齡≤40歲；(2)至少3次胚胎移植(ET)失敗史(包括新鮮周期及冷凍周期)；(3)或既往移植胚胎數(shù)>10枚仍未獲得臨床妊娠，且所移植胚胎中至少含有1枚優(yōu)質(zhì)胚胎；(4)無(wú)移植困難。排除宮腔病變及嚴(yán)重子宮畸形，無(wú)子宮肌瘤及子宮內(nèi)膜異位癥，無(wú)輸卵管積水，術(shù)前宮腔鏡檢查無(wú)異常，雙方無(wú)染色體異常。根據(jù)是否使用阿托西班和rhCG分為三組，A組共155例，于移植前半小時(shí)靜脈推注阿托西班(醋酸阿托西班注射液,6.75 mg/0.9 ml，瑞士輝凌制藥)預(yù)處理；B組共32例，于移植前半小時(shí)靜脈推注0.9 ml阿托西班，并于移植前7 min用移植管向?qū)m腔內(nèi)注射500 U用胚胎培養(yǎng)液稀釋至40 μl的rhCG(艾澤，250 μg/0.5 ml，默克雪蘭諾有限公司)；C組為對(duì)照組，共182例，未使用rhCG及阿托西班。

2.胚胎及囊胚的冷凍、復(fù)蘇：胚胎采用玻璃化法冷凍保存，解凍后有2個(gè)以上的III級(jí)以下胚胎且經(jīng)患者知情同意后行囊胚培養(yǎng)，如D5無(wú)囊胚形成繼續(xù)培養(yǎng)至D6。第5/6天( D5/D6) 分別觀察囊胚形成情況及形態(tài)，囊胚評(píng)分采用Gardner評(píng)分系統(tǒng)[5]，選擇囊胚在4期以上，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)分在B級(jí)以上，滋養(yǎng)外胚層評(píng)分在C及以上的囊胚進(jìn)行新鮮囊胚移植。囊胚的解凍為移植前兩小時(shí)進(jìn)行，移植前對(duì)移植的囊胚行激光打孔輔助孵出，根據(jù)胚胎復(fù)蘇及移植方案分為移植鮮囊胚和移植凍融囊胚兩種。

3.子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備：子宮內(nèi)膜的準(zhǔn)備方案分為自然周期、促排卵周期、激素替代周期。自然周期/促排卵周期根據(jù)陰道超聲監(jiān)測(cè)，以排卵日為D0、D3為卵裂期胚胎解凍日，D5為囊胚解凍移植日；激素替代周期以注射黃體酮日為 D0、D3為卵裂期胚胎解凍日，D5為囊胚解凍移植日。

4.移植后黃體支持：三組患者移植后均給予黃體支持治療,肌肉注射黃體酮60 mg/d,并口服地屈孕酮片10 mg,每日2次。

5.妊娠結(jié)局評(píng)價(jià)：囊胚移植后D14進(jìn)行血清β-hCG檢測(cè)，若β-hCG>5 U/L，則定義為生化妊娠，D28天B超檢查見(jiàn)孕囊者則定義為臨床妊娠。

結(jié)果

1.一般資料分析：各組患者在不孕年齡、不孕年限、不孕因素等方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三組間子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、囊胚移植方案、平均移植囊胚數(shù)及子宮內(nèi)膜厚度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 各組間臨床資料分析

組別子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案[例(%)]人工周期自然周期促排卵周期囊胚移植方案[例(%)]鮮囊胚凍囊胚轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度(mm)移植日內(nèi)膜厚度(mm)移植囊胚數(shù)(個(gè))A93(600)52(336)109(64)56(361)99(639)93±18102±1817±04B19(594)10(313) 3(93)13(406)19(594)93±1799±1917±05C96(528)73(401)13(71)68(374)114(626)96±17100±1617±04

2.各組間臨床結(jié)局分析:RIF患者行TET移植前半小時(shí)靜脈注射小劑量縮宮素受體拮抗劑阿托西班后，無(wú)論是否聯(lián)合應(yīng)用宮腔灌注rhCG，A組和B組的臨床妊娠率和胚胎著床率均顯著高于對(duì)照組C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組的臨床妊娠率和胚胎著床率亦稍高于B組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組自然流產(chǎn)率、多胎妊娠率和異位妊娠率均稍高于B組和C組，但三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 各組間臨床結(jié)局分析[例(%)]

注：與C組比較，*P<0.05

討論

目前多數(shù)學(xué)者主張將反復(fù)著床失敗(RIF)定義為移植≥3次優(yōu)質(zhì)胚胎或多次移植胚胎數(shù)量累計(jì)≥10枚均未能獲得臨床妊娠[6]。RIF發(fā)生的具體原因尚不完全清楚，可能是多種因素造成,包括子宮畸形、血栓前狀態(tài)、免疫因素、夫妻雙方染色體因素、胚胎因素等多種因素。胚胎質(zhì)量及子宮內(nèi)膜容受性是決定體外受精-胚胎移植(IVF-ET)是否成功兩個(gè)最基本的因素，當(dāng)移植優(yōu)質(zhì)胚胎反復(fù)著床失敗，排除患者全身系統(tǒng)性疾病及子宮器質(zhì)性病變后，要考慮子宮內(nèi)膜的容受性。Pierzynski等[7]研究發(fā)現(xiàn)RIF患者子宮收縮較正常生育期的女性明顯增加，超聲聲像圖顯示內(nèi)膜蠕動(dòng)頻率增加，致使胚胎不易著床，或使胚胎不能在宮腔內(nèi)著床導(dǎo)致異位妊娠，甚至使著床后的胚胎在發(fā)育階段流產(chǎn)。RIF患者在反復(fù)移植優(yōu)質(zhì)胚胎失敗后，精神緊張、壓力增大等負(fù)面影響也可能導(dǎo)致子宮收縮活動(dòng)增加，從而導(dǎo)致著床失敗和不良IVF結(jié)局。在促排卵周期中血清雌二醇水平升高使子宮肌層縮宮素受體基因的表達(dá)增加，從而增加了非妊娠子宮對(duì)縮宮素的反應(yīng)性，過(guò)度的宮縮降低了胚胎著床率和臨床妊娠率[8]。

另外，胚胎移植時(shí)移植管進(jìn)入宮腔的持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，或移植管碰觸宮壁均可增加宮縮，降低胚胎著床[7]。在本研究中，納入研究的患者內(nèi)膜厚度>7 mm，同時(shí)排除了子宮內(nèi)膜息肉、子宮畸形及宮腔粘連等可能影響著床的病例，并且研究組與對(duì)照組間移植優(yōu)質(zhì)胚胎的個(gè)數(shù)無(wú)明顯差異，夫妻雙方均無(wú)染色體異常，排除了因胚胎本身質(zhì)量差異對(duì)妊娠結(jié)局的影響，并排除移植困難者，目的是確保同一性，減少人為因素造成的影響。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未使用縮宮素受體拮抗劑，RIF患者囊胚移植的臨床妊娠率只有41.2%，胚胎著床率只有32.1%，而移植前使用縮宮素受體拮抗劑預(yù)處理后，患者的臨床妊娠率及胚胎著床率均明顯提高，提示移植前使用縮宮素受體拮抗劑能有效減少宮縮，幫助胚胎著床。

阿托西班是縮宮素受體拮抗劑,通過(guò)與縮宮素競(jìng)爭(zhēng)位于子宮肌細(xì)胞膜、蛻膜、胎膜上的縮宮素受體,抑制細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放,阻斷Ca2+內(nèi)流，同時(shí),抑制縮宮素誘導(dǎo)的前列腺素F2a(PGF2a)的產(chǎn)生,從而在受體水平抑制縮宮素對(duì)子宮的收縮作用,在早產(chǎn)的保胎治療中有良好的效果。而且阿托西班對(duì)人精子活力或兔胚胎發(fā)育無(wú)任何毒性，對(duì)人胚胎未發(fā)現(xiàn)有致畸作用，是一種安全有效的保胎藥物[9]。2007年P(guān)ierzynski等[7]首次將阿托西班應(yīng)用于RIF患者獲得妊娠并分娩健康胎兒。阿托西班可能通過(guò)減少子宮內(nèi)膜蠕動(dòng)及子宮收縮,增加子宮內(nèi)膜血流,改善內(nèi)膜容受性，提高RIF患者再次IVF及凍融周期的臨床妊娠結(jié)局[10-11]。本研究選擇RIF患者再次行TET治療移植囊胚的病例，移植前半小時(shí)使用小劑量阿托西班6.75 mg預(yù)處理，結(jié)果顯示觀察組的著床率及妊娠率均顯著高于對(duì)照組，而宮外孕率和流產(chǎn)率并沒(méi)有增加，進(jìn)一步證實(shí)阿托西班可以改善子宮內(nèi)膜容受性，提高RIF患者的臨床結(jié)局。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)精、卵結(jié)合形成受精卵后，尚處在輸卵管中的胚胎就不斷釋放信號(hào)與子宮內(nèi)膜間相互交流，發(fā)育中的胚胎通過(guò)分泌IL-1、LIF、hCG等多種信號(hào)分子促使母體子宮內(nèi)膜發(fā)生適應(yīng)性的變化，以利于胚胎的粘附與著床[12]，這些細(xì)胞因子在母-胎對(duì)話及胚胎著床中起著極其重要的作用[13]。而hCG作為著床前胚胎分泌的一種主要分泌蛋白，當(dāng)注射到宮腔內(nèi)直接作用于子宮內(nèi)膜后，能迅速刺激子宮內(nèi)膜分泌與著床密切相關(guān)的細(xì)胞因子如LIF、VEGF、MMP-9等，在胚胎著床及妊娠的維持中發(fā)揮重要作用[14]。目前hCG試劑有尿源性hCG粉末和重組人hCG注射液，前者價(jià)格低廉但藥物純度低于基因重組的注射液制劑。Rosen等[15]的研究認(rèn)為,未提純的hCG對(duì)小鼠胚胎具有毒性作用,而宮腔注射高純度的hCG可以提高種植率。Santibanez等[16]在胚胎移植前宮腔灌注500 U的重組人hCG明顯提高了IVF周期的臨床妊娠率，并沒(méi)有觀察到副作用。國(guó)內(nèi)學(xué)者[17]將宮腔灌注重組人hCG應(yīng)用在RIF患者凍融胚胎移植前，也獲得了良好的妊娠結(jié)局。本研究將宮腔灌注rhCG和靜脈注射阿托西班聯(lián)合應(yīng)用于RIF患者再次行凍融胚胎囊胚移植前。觀察發(fā)現(xiàn)，兩者聯(lián)合應(yīng)用后，患者的臨床妊娠率達(dá)到62.5%，胚胎著床率達(dá)到46.7%，均顯著高于未處理者；雖然臨床妊娠率和著床率稍低與單獨(dú)應(yīng)用阿托西班組，但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且聯(lián)合應(yīng)用后流產(chǎn)率和多胎率均較低，尚無(wú)異位妊娠發(fā)生。但因聯(lián)合應(yīng)用組患者病例數(shù)較少，宮腔灌注rhCG聯(lián)合靜脈注射阿托西班是否優(yōu)于單獨(dú)靜脈注射阿托西班預(yù)處理，還需更大樣本量的試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，阿托西班作為安全有效的宮縮抑制劑，有利于減少宮縮及子宮內(nèi)膜蠕動(dòng)，改善子宮內(nèi)膜容受性，提高RIF患者的臨床結(jié)局。宮腔內(nèi)灌注rhCG可刺激子宮內(nèi)膜分泌與著床密切相關(guān)的細(xì)胞因子，將兩者聯(lián)合起來(lái)，在增加宮腔內(nèi)著床相關(guān)因子濃度的同時(shí)有效抑制子宮收縮,對(duì)RIF的患者不失為一種改善其妊娠結(jié)局的嘗試方法,但其療效尚需大樣本量的試驗(yàn)和更多設(shè)計(jì)良好的前瞻性隨機(jī)試驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

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