KRAS基因突變與結(jié)直腸癌的研究進(jìn)展

范志軍

【摘要】 結(jié)直腸癌作為高發(fā)的惡性腫瘤，國(guó)際醫(yī)學(xué)界一直致力于結(jié)直腸癌的治療研究。惡性腫瘤靶向治療藥物的問(wèn)世，結(jié)直腸癌也開(kāi)始應(yīng)用靶向藥物進(jìn)行治療，臨床治療顯示，KRAS基因突變與用于結(jié)直腸癌單抗EGFR的臨床療效具有較大的關(guān)聯(lián)，國(guó)際上醫(yī)學(xué)已經(jīng)開(kāi)始把KRAS基因突變作為是否采用EGFR單抗的重要檢驗(yàn)指標(biāo)。因而有效的檢測(cè)KRAS基因突變，具有較高的醫(yī)學(xué)價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)直腸癌； KRAS基因突變； 靶向治療； 單抗

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.8.093 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1674-6805（2017）08-0163-02

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的重大疾病之一，發(fā)病率和病死率均位于惡性腫瘤的第3位，KRAS基因長(zhǎng)約35 kb，位于12號(hào)染色體，編碼K-ras蛋白，參與表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，是CRC研究中最受關(guān)注的基因突變之一。有研究顯示，KRAS基因突變對(duì)CRC患者預(yù)后有不同的影響，且不同的位點(diǎn)突變也與之相關(guān)。已有許多研究者針對(duì)此問(wèn)題進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，KRAS基因是CRC研究中最受關(guān)注的基因突變之一，能增加CRC患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)和疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，可能是影響CRC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

1 KRAS基因突變的研究

所有的RAS基因里面，KRAS與人類(lèi)的患癌率直接相關(guān)，KRAS基因在人體內(nèi)相當(dāng)于腫瘤患病的開(kāi)關(guān)，它較大程度地影響著人類(lèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)[1]。正常情況下的KRAS基因可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是KRAS基因一旦出現(xiàn)突變，就會(huì)不斷地刺激細(xì)胞的生長(zhǎng)，擾亂細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，從而引發(fā)機(jī)體的腫瘤細(xì)胞的繁殖[2-3]。直腸癌患者的KRAS基因與腫瘤發(fā)病原理具有較大的相關(guān)性，臨床數(shù)據(jù)表明，結(jié)直腸癌患者的KRAS基因突變概率高達(dá)30%～40%[4-5]。

KRAS基因突變的出現(xiàn)在結(jié)直腸癌的早期，這時(shí)患者的原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的KRAS基因能夠保持較大的一致[6-7]。在臨床治療過(guò)程中，KRAS基因不會(huì)因治療過(guò)程而出現(xiàn)突變。但是KRAS基因會(huì)出現(xiàn)點(diǎn)的突變，突變的位點(diǎn)主要集中在二號(hào)外顯子里的12-13密碼子，以及三號(hào)外顯子的61密碼子[8-9]。在直腸癌患者的臨床治療過(guò)程中，KRAS基因突變的檢出率高達(dá)90%以上，這個(gè)結(jié)果表明，KRAS的基因突變檢測(cè)非常具有醫(yī)學(xué)價(jià)值[10]。

2 KRAS基因突變的檢測(cè)

2.1 突變的檢測(cè)

KRAS基因突變成為當(dāng)代醫(yī)學(xué)生命研究的熱點(diǎn)課題之一，突變的檢測(cè)手段也得到了不斷的發(fā)展。對(duì)于基因突變的檢測(cè)，20世紀(jì)80年代之前，主要采用了Southern印跡法，能夠有效地檢測(cè)出基因的重組、缺失、亂碼、增多等主要突變情況。但是Southern印跡法無(wú)法較好的用于基因突變的檢出，因而在較長(zhǎng)一段時(shí)間使用較為費(fèi)時(shí)的DNA序列檢測(cè)分析法。21世紀(jì)研究得到的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)使得基因突變檢測(cè)得到了較大的進(jìn)展，基因突變檢測(cè)建立在多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的基礎(chǔ)上得到了迅速的發(fā)展[11-12]。

臨床中還采用的KRMS檢測(cè)方法，在實(shí)際中是通過(guò)引物設(shè)計(jì)和瓊脂糖電泳對(duì)突變結(jié)果進(jìn)行判定的，不用借用別的器材，非常靈活方便。但對(duì)于特定位點(diǎn)里的設(shè)計(jì)方案，不能夠?qū)ξ粗耐蛔冞M(jìn)行有效的篩查[13-14]。焦磷酸測(cè)序技術(shù)通過(guò)四種酶催化，促使同一反過(guò)程中的酶級(jí)聯(lián)呈現(xiàn)化學(xué)的發(fā)光反應(yīng)，這種分析方法可以有效地檢測(cè)出SNP的存在。但在檢測(cè)過(guò)程中，需要對(duì)于檢測(cè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增、跑膠、切膠進(jìn)行純化后才能測(cè)序，操作步驟復(fù)雜，檢測(cè)成本較高，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率也不高，不適用于大樣本的多位點(diǎn)檢測(cè)[15]。此外，研究發(fā)現(xiàn)的HRM檢測(cè)方法可以實(shí)時(shí)對(duì)熒光進(jìn)行定量檢測(cè)，也在多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)基礎(chǔ)之上，對(duì)飽和染料監(jiān)控核酸曲線(xiàn)變化進(jìn)行基因分析的主要方法之一。

HRM需要在實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)過(guò)程中對(duì)雙鏈DNA熒光染料與多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)產(chǎn)物相結(jié)合來(lái)有效的對(duì)基因進(jìn)行突變檢測(cè)，HRM在檢測(cè)過(guò)程中，必須要使用到序列特異性探針，這樣才能夠不受突變堿基位與種類(lèi)的限制，可以在使用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)之后，直接根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析，在檢測(cè)過(guò)程中，具有快捷方便、節(jié)約成本、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[16]。而HRM技術(shù)不會(huì)對(duì)DNA造成損傷，可以在結(jié)果分析后直接進(jìn)行純化測(cè)序。HRM分析手段可以有效的對(duì)基因突變進(jìn)行檢測(cè)，可以迅速對(duì)突變進(jìn)行掃描，以及基因的序列匹配，能夠在臨床中對(duì)基因突變進(jìn)行有效的檢測(cè)[3-4]。

2.2 檢測(cè)適用范圍

KRAS基因突變的檢測(cè)適用較為廣泛，檢測(cè)過(guò)程中患者的血液、穿刺標(biāo)本、石蠟包埋手術(shù)標(biāo)本都能夠作為有效的樣本，當(dāng)前，很多檢測(cè)樣本都需要進(jìn)行石蠟包埋?？墒?，近幾年發(fā)現(xiàn)，采用的石蠟標(biāo)本提取的DNA檢測(cè)質(zhì)量較低，在石蠟標(biāo)本里檢測(cè)出的KRAS基因突變率比冰凍組織標(biāo)本的檢出率少一半左右[17]。使用福爾馬林會(huì)較大程度地破壞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，使得傳統(tǒng)的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)與之發(fā)生反應(yīng)，形成后期的基因突變。要是腫瘤細(xì)胞的數(shù)目大于300個(gè)，或者是DNA模板的數(shù)量大于30 ng，則可以較好的避免這種情況的出現(xiàn)[5-6]。

非腫瘤細(xì)胞會(huì)較大程度地干擾KRAS突變基因的檢測(cè)，要是在顯微鏡下進(jìn)行選擇性的抽提，就會(huì)有效地提高檢測(cè)的敏感性。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于腫瘤細(xì)胞的靈敏度檢測(cè)必須要高于70%以上，有文獻(xiàn)[18]報(bào)道認(rèn)為，外周血的KRAS基因突變檢測(cè)之后，顯示出對(duì)腫瘤具有較高的侵襲性，可以有效地預(yù)防后期的不良狀態(tài)發(fā)生。血液里標(biāo)本顯示的低濃度的DNA，檢測(cè)的敏感性較低，不利于臨床應(yīng)用，而外周血與腫瘤的原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶一致的問(wèn)題還沒(méi)有明確的定論，需要醫(yī)學(xué)專(zhuān)家進(jìn)一步的確定。

3 KRAS基因突變對(duì)臨床治療的意義

結(jié)直腸癌在臨床治療過(guò)程中，KRAS基因突變與EGFR抗體療效具有較大的相關(guān)性，臨床中通常采用了檢測(cè)KRAS基因突變的方法，以較好的確定患者在治療中EGFR抗體的使用情況。KRAS基因野生型者可以在EGFR抗體的使用中得到更好的臨床療效，在美國(guó)臨床雜志上更新的結(jié)論也同樣支持了這一說(shuō)法[19]。

臨床研究表明，KRAS突變檢測(cè)可以較好地指導(dǎo)西妥昔單抗的臨床應(yīng)用，臨床治療過(guò)程中可以把西妥昔單抗與FOLFOX4聯(lián)合用于惡性腫瘤的治療中，可以更為顯著地提高患者的臨床療效。通過(guò)對(duì)患者的KRAS突變進(jìn)行有效分析，KRAS突變型患者在聯(lián)合治療中無(wú)明顯療效，而KRAS野生型患者中使用聯(lián)合治療具有較好的療效[20]。檢測(cè)KRAS基因突變的過(guò)程中，可以有效地幫助院方登記觀察患者的臨床情況，在治療中，采用科學(xué)適用的方法對(duì)患者進(jìn)行臨床治療。西妥昔單抗聯(lián)合伊立替康一線(xiàn)治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的CRYS-TALⅢ期研究已經(jīng)證實(shí)，在意向治療人群（ITT）中，F(xiàn)OLFIRI聯(lián)合西妥昔單抗方案可以提高患者一線(xiàn)治療客觀有效率（ORR）和無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）[21]。

綜上可知，KRAS基因突變情況與直腸癌單抗治療結(jié)果密切相關(guān)，檢測(cè)結(jié)果可以作為患者的有效治療指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)結(jié)果也能夠選擇較為合理的治療方法與靶向藥物，以更好的實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤的差異化治療。這種人性化的治療方法，可以更好地為患者節(jié)約更多的經(jīng)濟(jì)開(kāi)支，分子靶向治療也是治療腫瘤的發(fā)展趨勢(shì)。對(duì)于KRAS基因突變檢測(cè)的意義已經(jīng)得到了醫(yī)學(xué)界的廣泛認(rèn)同，但是在國(guó)際醫(yī)學(xué)中還沒(méi)有明確的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法，HRM檢測(cè)分析方法在近年來(lái)開(kāi)始逐漸發(fā)展起來(lái)，并在多個(gè)檢測(cè)領(lǐng)域里得到了較好的應(yīng)用，應(yīng)該會(huì)在不久的將來(lái)成為臨床KRAS基因突變檢測(cè)的常規(guī)方法。

參考文獻(xiàn)

[1]孫毅，艾力江·吐?tīng)栠d，楊娜，等.新疆維吾爾族、漢族結(jié)直腸癌患者中KRAS及BRAF基因突變差異及其與預(yù)后的關(guān)系研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，38（1）：47-51.

[2]王碧波，韓一平，萬(wàn)善志，等.p63與表皮生長(zhǎng)因子受體突變肺鱗癌患者生存的關(guān)系[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（4）：378-382.

[3]楊家和.結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的綜合治療策略[EB/OL].中華結(jié)直腸疾病電子雜志，2014，3（4）：237-224.

[4]陳萬(wàn)青，張思維，曾紅梅，等.中國(guó)2010年惡性腫瘤發(fā)病與死亡[J].中國(guó)腫瘤，2014，23（1）：1-10.

[5]陳萬(wàn)青，彭俠彪.結(jié)直腸癌流行病學(xué)[M].北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2014：234-249.

[6]曾紅梅，陳萬(wàn)青.中國(guó)癌癥流行病學(xué)與防治研究現(xiàn)狀[J].化學(xué)進(jìn)展，2013，25（9）：1415-1420.

[7]何振華，張森.結(jié)直腸癌NCCN、NICE指南及中國(guó)衛(wèi)生部診療規(guī)范的比較[J].世界華人消化雜志，2013，21（14）：1297-1302.

[8] Chen J，Guo F，Shi X，et al.BRAF V600E mutation and KRAS codon 13 mutations predict poor survival in Chinese colorectal cancer patients[J].BMC Cancer，2014，14：802.

[9]李亞楠，周云芝，王洪武.肺鱗癌分子靶向治療的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)肺癌雜志，2014，15（8）：618-624.

[10] Chang Y S，Chang S J，Yeh K T，et al.RAS，BRAF，and TP53 gene mutations in Taiwanese colorectal cancer patients[J].Onkologie，2013，36（12）：719-724.

[11]衣素琴，莊園，朱衛(wèi)東，等.非小細(xì)胞肺癌中KRAS基因突變分析[EB/OL].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2013，7（20）：9111-9115.

[12] Yashima H，Shimizu K，Araki T，et al.Assessment of DDR2，BRAF，EGFR and KRAS mutations as therapeutic targets in non-adenocarcinoma lung cancer patients[J].Mol Clin Oncol，2014，2（5）：714-718.

[13]羅煒，王慧，徐韞健，等.非小細(xì)胞肺癌患者KRAS基因突變情況分析[J].廣東醫(yī)學(xué)，2014，35（13）：2025-2028.

[14] Boch C，Kollmeier J，Roth A，et al.The frequency of EGFR and KRAS mutations in non-small cell lung cancer （NSCLC）：routine screening data for central Europe from a cohort study[J].BMJ Open，2013，3（4）：e002560.

[15] Kim H R，Ahn J R，Lee J G，et al.The impact of cigarette smoking on the frequency of and qualitative differences in KRAS mutations in Korean patients with lung adenocarcinoma[J].Yonesi Med J，2013，54（4）：865-874.

[16] Dearden S，Stevens J，Wu Y L，et al.Mutation incidence and coincidence in non small-cell lung cancer：meta-analyses by ethnicity and histology （mutMap）[J].Ann Oncol，2013，24（9）：2371-2376.

[17]李珊珊.貝伐珠單抗對(duì)比抗EGFR單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者療效及不良反應(yīng)的分析[D].北京：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2014：66.

[18]王慧，徐韞健，林云恩，等.結(jié)直腸癌KRAS基因突變狀態(tài)的檢測(cè)分析[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29（17）：2890-2893，3994.

[19]譚聰，倪淑娟，翁微微，等.結(jié)直腸癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶K-ras基因突變的比較分析[J].中國(guó)癌癥雜志，2013，23（10）：829-833.

[20]陸萬(wàn)青，張思維，曾紅梅.中國(guó)2010年惡性腫瘤發(fā)病與死亡[J].中國(guó)腫瘤，2014，23（1）：1-10.

[21]楊軍，劉妮，康安靜，等.一種新型胃癌組織學(xué)分型、分級(jí)-評(píng)分系統(tǒng)[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2013，29（2）：159-162.

（收稿日期：2016-11-15）