核磁共振氫譜檢測糖尿病不同發(fā)病階段額葉和枕葉的代謝變化

王丹，鄭涌泉，趙良才，鄭宏，高紅昌，張華杰

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院 藥劑科，浙江杭州 310006）

核磁共振氫譜檢測糖尿病不同發(fā)病階段額葉和枕葉的代謝變化

王丹1，鄭涌泉2，趙良才1，鄭宏1，高紅昌1，張華杰1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院 藥劑科，浙江杭州 310006）

目的:運用基于核磁共振氫譜（1H NMR）的代謝組學(xué)方法分析1型糖尿病大鼠不同發(fā)病階段額葉和枕葉2個腦區(qū)的代謝變化。方法:取正常大鼠（n=22）和鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠發(fā)病1周（n=8）、5周（n=7）、9周（n=7）的額葉和枕葉組織進行1H NMR檢測，并結(jié)合多元模式識別和代謝物定量分析闡述代謝特征。結(jié)果:糖尿病發(fā)病各個時期，額葉和枕葉的代謝模式均發(fā)生顯著改變。與正常大鼠相比，代謝物乳酸（Lac）、?；撬幔═au）、肌醇（m-Ins）含量隨著糖尿病的發(fā)展明顯升高；而N-乙酰天冬氨酸（NAA）、天冬氨酸（Asp）、琥珀酸（Suc）等的含量顯著降低。結(jié)論:額葉和枕葉的代謝變化相似，且均發(fā)生于糖尿病早期，主要涉及能量代謝紊亂、谷氨酸-谷氨酰胺-γ-氨基丁酸（Glu-Gln-GABA）循環(huán)抑制、滲透壓調(diào)節(jié)增強。

糖尿?。荒芰看x；額葉；枕葉；核磁共振氫譜；大鼠

糖尿病引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷日益受到關(guān)注[1]。糖尿病會導(dǎo)致腦萎縮和白質(zhì)損傷，臨床上，腦萎縮和白質(zhì)損傷通常被認為是糖尿病患者認知功能障礙的病理學(xué)基礎(chǔ)[2]。而糖尿病患者腦內(nèi)額葉和枕葉萎縮與注意力下降和記憶力損傷密切相關(guān)[3]。然而，導(dǎo)致糖尿病腦損傷的發(fā)病機制目前仍不明確。

基于核磁共振的代謝組學(xué)技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域擁有重要地位和強大優(yōu)勢[4-8]。本研究利用基于核磁共振氫譜（1H NMR）的代謝組學(xué)方法分析1型糖尿病大鼠不同發(fā)病階段額葉和枕葉2個腦區(qū)的代謝變化，找出具有時間依賴性和腦區(qū)特異性的特征代謝物和代謝途徑，為闡明糖尿病患者注意力和記憶力發(fā)生障礙的潛在發(fā)病機制提供線索。

1 材料和方法

1.1 儀器、試劑與動物 Bruker AVANCE I I I 600核磁共振譜儀（德國Bruker公司）；血糖試紙及血糖儀（德國貝朗醫(yī)療國際貿(mào)易有限公司）；冷凍干燥機（ALPHA-4，德國Christ公司）。鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）購自美國Sigma-Aldrich公司；重水（D2O，99.9%）購于英國劍橋同位素實驗室；檸檬酸、檸檬酸鈉、甲醇、氯仿購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。Sprague-Dawley（SD）大鼠44只，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司動物合格證號:SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房，并通過實驗動物倫理學(xué)委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 1型糖尿病模型的建立:大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為2組，即糖尿病組和對照組，各22只。大鼠禁食12 h后，糖尿病組腹腔注射STZ檸檬酸鈉混懸溶液（70 mg/kg，現(xiàn)配現(xiàn)用），72 h后測其血糖水平，空腹血糖值大于16.7 mmol/L的大鼠為造模成功的糖尿病大鼠。對照組注射同等劑量的檸檬酸鈉混懸溶液（0.1 mol/L，pH=4.5）。

1.2.2 腦組織（額葉和枕葉）樣本的收集和處理:大鼠在STZ誘導(dǎo)1周（n=8）、5周（n=7）、9周（n=7）后斷頭處死，快速分離出額葉和枕葉，并將收集的腦組織樣本迅速浸入液氮中急凍，置于-80 ℃保存。冰凍的腦組織樣本稱重后，置于勻漿管中，加入冰甲醇4 mL/g，蒸餾水0.85 mL/g，使用手持式組織勻漿機勻漿，渦漩15 s；再加入2 mL/g氯仿，渦漩；最后分別加入2 mL/g冰氯仿和冰蒸餾水，渦漩后于冰上靜置15 min。于1 000×g 4 ℃條件下離心15 min，取上層水溶性代謝物。凍干24 h，得到代謝物粉末。最后將粉末重新溶解于500 μL D2O中，離心（12 000×g，10 min，4 ℃），上清液轉(zhuǎn)入NMR樣品管中進行測試。

1.2.3 腦組織提取物的1H NMR檢測及數(shù)據(jù)處理:于600 MHz NMR波譜儀上進行NMR采集實驗，探頭溫度控制為25 ℃，累加采樣256次，采樣點數(shù)64 K，譜寬為12 000 Hz，弛豫延遲10 s。將采得的時域信號進行傅立葉變換后，使用Topspin 2.1軟件對所有的1H NMR譜圖進行相位校正、基線調(diào)整，并以乳酸的甲基峰的化學(xué)位移（1.33 ppm）定標[9]。所有譜圖用MATLAB軟件（R2012a，美國MathWorks公司）進行對齊處理[10]。將1H NMR譜從δ0.1～10.0 ppm按0.01 ppm為單位進行自動分段積分，為了消除預(yù)飽和壓水峰時引起的譜線扭曲，將δ5.16～4.70 ppm的水峰區(qū)域設(shè)為0積分段。對每一段積分值都相對于該譜的所有積分值進行歸一化，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P+12.0軟件（瑞典Umetrics公司）進行偏最小二乘判別分析（partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA）。所得得分圖是以第一和第二主成分作為x，y坐標軸構(gòu)建的二維空間，該空間中每一個點代表一個樣本，圖中橢圓區(qū)域代表95%的置信區(qū)間。由PLS-DA得到的軌跡圖中，一個點代表各組某一個時間點的代謝輪廓。相應(yīng)的彩色相關(guān)系數(shù)載荷圖（correlation coefficient color-coded loadings plot）上，橫坐標代表化學(xué)位移，縱坐標代表相關(guān)系數(shù)|r|值（0～1.0），表示各代謝物對組間分離的貢獻，|r|越大，即圖中峰顏色越偏向于暖色調(diào)，對組間分離的貢獻越大。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病發(fā)病不同時期的額葉和枕葉1H NMR譜及代謝模式分析 腦組織提取物的1H NMR波譜可以同時測量多種內(nèi)源性代謝物，圖1和圖2分別為額葉和枕葉提取物的典型1D1H NMR譜，基于實驗室前期已發(fā)表的研究成果[6，11]及2D1H-1H COSY和TOCSY譜圖驗證，歸屬代謝物有乳酸（Lac，δ1.33，δ4.11）、丙氨酸（Ala，δ1.47）、N-乙酰天冬氨酸（NAA，δ2.01，δ4.39），γ-氨基丁酸（GABA，δ1.90，δ2.29）、谷氨酸（Glu，δ2.35，δ3.75）、琥珀酸（Suc，δ2.40）、谷氨酰胺（Gln，δ2.45，δ3.75）、天冬氨酸（Asp，δ2.82）、肌酸（Cre，δ3.03，δ3.93）、膽堿（Cho，δ3.20）、?；撬幔═au，δ3.42）、甘氨酸（Gly，δ3.55）和肌醇（m-Ins，δ3.52，δ4.06）。從代謝軌跡圖中可以看出額葉和枕葉2個腦區(qū)，糖尿病組和對照組在第一主成分方向上明顯區(qū)分，且糖尿病發(fā)展這一因素對代謝模式的影響遠大于大鼠自身生長發(fā)育這一因素對代謝模式的影響，見圖3A和4A。且2個腦區(qū)在糖尿病發(fā)病不同時期的代謝模式均明顯區(qū)分，見圖3B和4B。在額葉區(qū)，引起糖尿病組和對照組之間的差異的主要代謝物有:Lac、NAA、Gln、m-Ins；同樣的，這些也是引起枕葉區(qū)代謝差異的主要特征性代謝物，見圖3C和4C。

圖1 對照組1周（A）和糖尿病組1周（B）、5周（C）、9周（D）時大鼠額葉組織典型的1H NMR譜

圖2 對照組1周（A）和糖尿病組1周（B）、5周（C）、9周（D）時大鼠枕葉組織典型的1H NMR譜

2.2 代謝物定量分析結(jié)果 進一步對代謝物進行定量分析后發(fā)現(xiàn)，在糖尿病組1周時的大鼠額葉中，NAA、GABA、Gln、Cho含量明顯下降，m-Ins含量顯著升高，而枕葉中還存在Lac升高的現(xiàn)象。當糖尿病發(fā)展至5周時，在之前的基礎(chǔ)上，代謝變化逐漸加劇，額葉中的Lac開始顯著升高，枕葉中的Tau顯著升高。至第9周時，代謝變化持續(xù)加劇，Asp開始在2個腦區(qū)顯著降低，此外，額葉中的Tau開始出現(xiàn)升高的趨勢，枕葉中的Gly開始出現(xiàn)降低的趨勢，見表1。

2.3 Glu-Gln-GABA循環(huán) 糖尿病1周時，額葉和枕葉區(qū)均已開始出現(xiàn)Glu、Gln、GABA含量減少的趨勢。與對照組大鼠相比，糖尿病組大鼠額葉和枕葉區(qū)，三者總含量（Glu+Gln+GABA）在1、5、9周時均持續(xù)降低，見圖5。

3 討論

圖3 額葉模式識別分析結(jié)果

圖4 枕葉模式識別分析結(jié)果

3.1 能量代謝紊亂 腦部能量需求至少占人體總能量需求的20%[12]，腦能量代謝紊亂與腦病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病的發(fā)病進程中，額葉和枕葉中Lac含量均持續(xù)升高，而Lac在腦內(nèi)是由能量底物葡萄糖通過無氧酵解方式代謝產(chǎn)生的，在糖尿病大鼠腦內(nèi)的這種異常升高，說明無氧酵解途徑增強。同時，當糖尿病發(fā)展到第9周時，2個腦區(qū)中三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA循環(huán)）中間產(chǎn)物Asp和Suc均出現(xiàn)降低的趨勢，說明TCA循環(huán)活性減弱，可能是高糖刺激腦內(nèi)神經(jīng)細胞致使其線粒體受損，從而影響到正常的氧化呼吸供能。綜上所述，糖尿病誘導(dǎo)的無氧酵解過強導(dǎo)致無效供能增加，而發(fā)病后期TCA循環(huán)的減弱，進一步加劇了能量代謝紊亂。

3.2 神經(jīng)元-膠質(zhì)代謝區(qū)間改變 哺乳動物腦內(nèi)存在2個主要代謝區(qū)間，分別是神經(jīng)元代謝區(qū)間和膠質(zhì)細胞代謝區(qū)間[6]，Glu-Gln-GABA循環(huán)在維持這2個代謝區(qū)間的神經(jīng)遞質(zhì)平衡以及大腦運作中起著至關(guān)重要的作用[10]。Glu被星形膠質(zhì)細胞攝取后，在膠質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)化為Gln，因為谷氨酰胺合成酶僅存在于膠質(zhì)細胞中，隨后合成的Gln被轉(zhuǎn)運回神經(jīng)元，作為氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu和GABA的主要前體物質(zhì)，繼續(xù)參與神經(jīng)沖動傳遞或其他代謝途徑。本研究在2個腦區(qū)中同時發(fā)現(xiàn)Glu、Gln、GABA的含量有持續(xù)減少的趨勢，三者總含量隨著糖尿病的發(fā)生發(fā)展顯著降低，說明在糖尿病發(fā)病進程中，神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞之間的這一重要循環(huán)受到阻礙，遞質(zhì)動態(tài)平衡被打破。這一結(jié)果與本課題組早前在2型糖尿病模型db/db小鼠海馬內(nèi)得到的Glu-Gln循環(huán)減弱的結(jié)果[7]一致。可見無論是1型還是2型糖尿病，高血糖造成的腦中神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞間的遞質(zhì)傳遞障礙普遍存在。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，從糖尿病1周開始，額葉和枕葉區(qū)就已開始出現(xiàn)Glu-Gln-GABA循環(huán)障礙的現(xiàn)象，且隨著糖尿病的發(fā)生發(fā)展持續(xù)減弱。有研究[3]表明糖代謝紊亂的早期就已觸發(fā)腦損傷，這種代謝水平觀測到的早期代謝異常，很可能是導(dǎo)致糖尿病患者逐漸發(fā)展演變?yōu)槟X損傷的重要原因。

表1 糖尿病組大鼠腦中代謝物含量變化表

3.3 氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂 m-Ins、Tau是反映膠質(zhì)細胞增生或膠質(zhì)細胞活性以及膠質(zhì)滲透壓調(diào)節(jié)的特征性代謝物，主要參與調(diào)節(jié)滲透壓平衡和細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[14-15]。糖尿病1周大鼠額葉和枕葉中m-Ins的增加以及糖尿病發(fā)病后期Tau的升高表明2個腦區(qū)中膠質(zhì)細胞滲透壓調(diào)節(jié)的需求增強。Cre的含量在2個腦區(qū)中一直維持穩(wěn)定，這也與相關(guān)文獻[16-18]報道的腦內(nèi)Cre含量在絕大多數(shù)疾病發(fā)生時一般恒定不變是相符的。此外，與對照組大鼠相比，額葉和枕葉中NAA從1周時開始顯著降低，與1型糖尿病患者額葉活體定域MRS結(jié)果[19-20]一致。而NAA作為神經(jīng)元活性的特征性代謝物，其含量的降低說明神經(jīng)元受損。結(jié)合上述分析，神經(jīng)元受損可能是導(dǎo)致神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞之間的Glu-Gln-GABA循環(huán)障礙的重要誘因。

3.4 腦區(qū)相似性 本實驗分別考察了大腦內(nèi)參與調(diào)節(jié)注意力和記憶力的2個腦區(qū)—額葉和枕葉，在糖尿病發(fā)生發(fā)展進程中的一系列重要的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的擾動。值得一提的是，在糖尿病發(fā)病進程中，2個腦區(qū)中發(fā)生變化的特征性代謝物基本一致，且隨著發(fā)病周期的增加具有規(guī)律性的持續(xù)降低或升高，比如Lac、NAA、m-Ins、Suc、Asp、Tau、Gly等。說明高血糖對額葉和枕葉造成的代謝紊亂是相似的，只是個別代謝物的擾動發(fā)生的時期略有差異，比如Lac的升高在額葉中至第5周才出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，而在枕葉中第1周就顯著升高；額葉中的Tau在糖尿病造模9周后才出現(xiàn)明顯升高，而枕葉中發(fā)病第5周就具有統(tǒng)計學(xué)差異。這說明雖然額葉和枕葉在大腦內(nèi)分布的具體位置不同，但是可能由于它們均參與調(diào)控注意力和記憶力，功能上相互協(xié)調(diào)，所以一旦受到外界刺激，會引起相似的代謝調(diào)控反應(yīng)，這也進一步說明了高血糖可能會對注意力和記憶力造成損害，而且，這種損害在糖尿病發(fā)病早期（1周）時，就已經(jīng)可以觀測到代謝水平的擾動。

圖5 糖尿病大鼠額葉和枕葉中Glu、Gln和GABA總含量柱狀圖

綜上所述，本研究應(yīng)用基于1H NMR的代謝組學(xué)方法分析了1型糖尿病大鼠不同發(fā)病階段額葉和枕葉2個腦區(qū)的代謝水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高血糖對額葉和枕葉在糖尿病各個時期的代謝輪廓均造成了較大程度的影響。從代謝物水平觀測到2個腦區(qū)中發(fā)生的特征性代謝物變化具有相似性，且多數(shù)代謝紊亂在糖尿病發(fā)病早期就已開始出現(xiàn)，隨著糖尿病的發(fā)生發(fā)展逐漸加劇，其中包括能量代謝出現(xiàn)紊亂、Glu-Gln-GABA循環(huán)受到抑制、滲透壓調(diào)節(jié)的增強等。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Study on frontal lobe and occipital lobe metabolism in different stages of diabetes using1H NMR spectros-

copy

WANG Dan1, ZHENG Yongquan2, ZHAO Liangcai1, ZHENG Hong1, GAO Hongchang1, ZHANG Huajie1.

1.School of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Department of Pharmacy, Women’s Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou, 310006

Objective：To investigate the metabolic changes of frontal lobe and occipital lobe in different stages of diabetes.Methods：The frontal lobe and occipital lobe were dissected from the 1-week, 5-week and 9-week diabetic rats and the age-matched controls.1H NMR-based metabonomics combined with multivariate pattern recognition analysis and quantitative analysis were used to study the metabolic characteristics.Results：The metabolic patterns of frontal lobe and occipital lobe were signif cantly changed in different stages of diabetes. Compared to the controls, lactate, taurine and myo-inositol were distinctly increased both in frontal lobe and occipital lobe with the development of diabetes, while the levels of N-acetyl-aspartate, aspartate and succinate were markedly decreased.Conclusion：The metabolic changes in frontal lobe and occipital lobe are similar, and occurr in the early stage of diabetes. The metabolic changes mainly focus around the disordered energy metabolism, inhibit Glu-Gln-GABA cycle and increas osmoregulation.

diabetes mellitus; energy metabolism; frontal lobe; occipital lobe;1H NMR; rats

R34

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.02.003

2016-05-17

浙江省藥學(xué)重中之重一級學(xué)科開放基金（YKFJ2-003）；浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LY14H090014，LY15H180010）；高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金新教師類資助課題（20133321 120006）。

王丹（1991-），女，浙江嘉興人，碩士生。

張華杰，教授，碩士生導(dǎo)師，Email:zhanghuajie116@ sina.com。