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    二肽酶IV在胃癌中的表達(dá)及臨床意義

    2017-03-29 06:12:44田杰張志安孫國(guó)興肖保增張文超楊繼濤張慶永尹曉耿國(guó)旺
    關(guān)鍵詞:組織化學(xué)染色胃癌

    田杰,張志安,孫國(guó)興,肖保增,張文超,楊繼濤,張慶永,尹曉,耿國(guó)旺

    (清河縣人民醫(yī)院 普外科,河北 邢臺(tái) 054899)

    二肽酶IV在胃癌中的表達(dá)及臨床意義

    田杰,張志安,孫國(guó)興,肖保增,張文超,楊繼濤,張慶永,尹曉,耿國(guó)旺

    (清河縣人民醫(yī)院 普外科,河北 邢臺(tái) 054899)

    目的:檢測(cè)二肽酶IV(DPP IV)在胃癌組織中的表達(dá),探討其在胃癌預(yù)后中的價(jià)值。方法:收集本院手術(shù)后的胃癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織112例,用免疫組織化學(xué)方法定性比較胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中DPP IV的表達(dá);Western blot定量比較胃癌組織及癌旁正常組織中DPP IV蛋白的表達(dá)。結(jié)果:免疫組織化學(xué)結(jié)果示DPP IV在癌旁正常組織中有3例(占2.7%)表達(dá)缺失;胃癌組織中有78例(占69.6%)表達(dá)缺失;Western blot結(jié)果示DPP IV在胃癌組織中的含量明顯低于癌旁正常組織;多因素分析示DPP IV是胃癌不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(P<0.001)。結(jié)論:DPP IV表達(dá)缺失是胃癌不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

    二肽酶IV;胃腫癌;病理學(xué);預(yù)后

    1 資料和方法

    1.1 一般資料 收集2003年1月至2014年12月在我院普外科行手術(shù)治療的胃腺癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織112例,術(shù)前未經(jīng)過(guò)放療及化療。納入標(biāo)準(zhǔn)∶入選病例均為原發(fā)性胃管狀腺癌根治標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn):胃鱗狀細(xì)胞癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌及腺癌活檢標(biāo)本。記錄腫瘤部位、大小、組織學(xué)分級(jí)、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移情況。所有胃腺癌標(biāo)本均有完整的病理資料及隨訪資料,隨訪時(shí)間為手術(shù)日至死亡或末次隨訪日,所有死亡均與癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。DDP IV單克隆抗體購(gòu)自丹麥DaKo生物試劑公司,相應(yīng)二抗EnVision試劑盒購(gòu)自北京博奧生物技術(shù)公司。

    1.2 方法

    1.2.1 免疫組織化學(xué)染色:所有供體組織蠟塊行常規(guī)病理切片后HE染色,經(jīng)有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師采取雙盲法對(duì)112例胃腺癌組織切片進(jìn)行復(fù)診及組織學(xué)分級(jí)確認(rèn)。冰凍切片機(jī)5 μm厚連續(xù)切片制成冰凍切片。免疫組織化學(xué)染色操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,用正常大腸組織切片作陽(yáng)性對(duì)照,PBS替代一抗作陰性對(duì)照,切片常規(guī)脫蠟,枸櫞酸鹽加熱抗原修復(fù),然后采用EnVision兩步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果判定:DDP IV染色以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性,采用半定量積分法判斷結(jié)果。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分:無(wú)著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比評(píng)分:<10%為0分,11%~50%為1分,51%~75%為2分,>76%為3分。兩項(xiàng)得分相乘,0~3分記為(-),4~5分記為(+),6~8分記為(++),≥9分記為(+++)。染色結(jié)果為陰性者,認(rèn)為DDP IV表達(dá)缺失。

    1.2.2 蛋白質(zhì)提取及Western blot分析:經(jīng)液氮超低溫保存的112例胃癌及癌旁正常組織用于提取蛋白質(zhì)以進(jìn)行Western blot分析。用放射免疫沉淀裂解液提取胃癌組織塊中的總蛋白,測(cè)定蛋白質(zhì)濃度以判斷標(biāo)本是否合格,取100 μg樣品上清液,聚丙烯酰胺凝膠電泳。4 ℃、100 mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)膜過(guò)夜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入DDP IV及β-actin(1∶400稀釋?zhuān)┮豢梗? ℃孵育過(guò)夜,洗膜后加適量辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗,于37 ℃孵育2 h,然后在暗室中顯影,底片經(jīng)掃描儀透掃后用凝膠分析軟件Image Pro Plus對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行灰階分析,以DDP IV與β-actin 的光密度比值表示其相對(duì)表達(dá)量。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以χ2檢驗(yàn)DDP IV的表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)之間的相互關(guān)系;DDP IV在胃癌預(yù)后中的價(jià)值使用多因素Cox分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 DPP4在胃癌中表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析 DDP IV在癌旁組織中有3例(占2.7%)表達(dá)缺失,在胃癌組織中有78例(占69.6%)表達(dá)缺失(見(jiàn)圖1)。DDP IV蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系見(jiàn)表1,DDP IV的表達(dá)缺失與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度及TNM臨床分期相關(guān)(P<0.05)。伴有淋巴結(jié)及肺轉(zhuǎn)移者DDP IV的表達(dá)缺失的頻率增高,胃癌浸潤(rùn)更深及TNM分期更晚者DDP IV的表達(dá)缺失的概率更大。

    圖1 免疫組織化學(xué)結(jié)果示DDP IV的表達(dá)

    表1 DPP IV表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系(例)

    2.2 DDP IV在胃癌中表達(dá)的Western blot分析

    Western blot結(jié)果顯示,癌旁正常組織中DDP IV的表達(dá)都明顯高于胃癌組織(P<0.05),而且伴有轉(zhuǎn)移的胃癌組織中DDP IV的表達(dá)明顯低于無(wú)轉(zhuǎn)移的胃癌組織(P<0.05),見(jiàn)圖2。

    圖2 DDP IV的Western blot結(jié)果圖

    2.3 DPP IV與胃癌臨床預(yù)后 根據(jù)隨訪結(jié)果,對(duì)DDP IV蛋白表達(dá)陽(yáng)性組和表達(dá)缺失組的生存率進(jìn)行了Kaplan Meier分析,結(jié)果見(jiàn)圖3。DDP IV陽(yáng)性組患者的癌癥特異性生存率及癌癥無(wú)進(jìn)展生存率明顯高于DDP IV表達(dá)缺失組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)過(guò)多因素分析,結(jié)果顯示DDP IV表達(dá)缺失為胃癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子,見(jiàn)表2。

    圖3 DDP IV表達(dá)對(duì)生存率的Kaplan Meier分析

    表2 胃癌預(yù)后因素的多因素Cox回歸分析

    3 討論

    DPP IV是20世紀(jì)60年代末在大鼠腎臟中被發(fā)現(xiàn)的,屬于絲氨酸蛋白酶家族成員[9]。DPP IV基因位于2號(hào)染色體,包括26個(gè)外顯子,表達(dá)于多種細(xì)胞表面,如淋巴細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞等。DPP IV一般以同源二聚體形式存在,其單體含有766個(gè)氨基酸殘基,相對(duì)分子量11 kD,其細(xì)胞外區(qū)域具有蛋白酶活性,該酶能從絲裂因子或神經(jīng)肽的N端切除二肽,從而使之失去活性。最初發(fā)現(xiàn)DPP IV是一種淋巴細(xì)胞分化分子[10],在微生物感染等過(guò)程中具有免疫調(diào)節(jié)作用[11-12];后來(lái)DPP IV被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織存在不同水平的表達(dá)降低[13-15],并有進(jìn)一步研究[16-19]發(fā)現(xiàn)其在腫瘤中起著抑制細(xì)胞增殖的作用;還有研究[20]報(bào)道DPP IV在鼻咽癌中也存在表達(dá)降低,并發(fā)揮著抑癌基因的作用。但也有研究發(fā)現(xiàn)DPP IV在肺癌[21]中表達(dá)升高,張夢(mèng)真等[22]通過(guò)Western blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DPP IV在卵巢癌組織中表達(dá)明顯升高,并且與臨床分期、組織學(xué)分期與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),從而推斷DPP IV參與了腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。SANCHEZ-OTERO等[23]對(duì)肺癌等數(shù)種肺疾病組織在蛋白質(zhì)和mRNA水平上對(duì)DPP IV進(jìn)行了研究后發(fā)現(xiàn)其起著抑癌基因的作用,而且其發(fā)揮作用與p21密切相關(guān)。

    本研究主要采用了免疫組織化學(xué)等常用的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DPP IV基本全部表達(dá)于正常的胃黏膜,而在胃癌組織中則不同程度地表達(dá)降低或缺失;而且隨著腫瘤惡性程度的增高,DPP IV的表達(dá)缺失更加明顯。進(jìn)而通過(guò)Western blot方法分析發(fā)現(xiàn):與正常胃黏膜組織相比,DPP IV在胃癌組織中的表達(dá)明顯降低,在伴有轉(zhuǎn)移的癌組織中其表達(dá)降低程度更大。DPP IV的表達(dá)缺失與胃癌浸潤(rùn)深度及有無(wú)淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移有關(guān),而與其病理學(xué)類(lèi)型、組織學(xué)分化程度和年齡無(wú)關(guān),這些數(shù)據(jù)提示DPP IV在胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮了抑制作用。但是關(guān)于DPP IV在胃癌中的確切機(jī)制,目前研究較少,或是通過(guò)調(diào)控鉀通道的功能而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或存活而實(shí)現(xiàn)的,前者在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的前進(jìn)及凋亡中發(fā)揮著重要的作用。

    本研究應(yīng)用Kaplan Meier相關(guān)分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),DPP IV的表達(dá)缺失與患者的癌癥特異性生存期及癌癥無(wú)進(jìn)展生存期明顯相關(guān);進(jìn)而采用多因素Cox回歸分析后顯示DPP IV表達(dá)缺失是胃癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子,通過(guò)檢測(cè)胃癌組織中DPP IV的表達(dá)水平可以預(yù)測(cè)患者以后的病情發(fā)展趨勢(shì)。因本研究為回顧性分析,且收集到的病例數(shù)較少,對(duì)DPP IV在胃癌中的作用缺少分子生物學(xué)水平上的研究、分析。但本研究初步發(fā)現(xiàn)了DPP IV在胃癌中發(fā)揮著抑癌基因的作用,DPP IV表達(dá)缺失是胃癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子,而從基因水平上探討其作用機(jī)制應(yīng)成為接下來(lái)研究的重點(diǎn)。

    [1] 鄒文斌, 李兆申. 中國(guó)胃癌發(fā)病率及死亡率研究[J]. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2014, 34(4): 408-415.

    [2] CARCAS L P. Gastric cancer review[J]. J Carcinog, 2014, 13: 14.

    [3] PIAZUELO M B, CORREA P. Gastric cancer: overview[J]. Colomb Med (Cali), 2013, 44(3): 192-201.

    [4] ITOU M, KAWAGUCHI T, TANIGUCHI E, et al. Dipeptidyl peptidase -4: A key player in chronic liver disease[J]. World J Gastroenterol, 2013, 19(15): 2298-2306.

    [5] ZHONG J, RAO X, RAJAGOPALAN S. An emerging role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP-4) beyond glucose control: potential implications in cardiovascular disease[J]. Atherosclerosis 2013, 226(2): 305-314.

    [6] ZHENG T, BASKOTA A, GAO Y, et al. Increased plasma DPP4 activities predict new-onset hyperglycemia in Chinese over a four-year period: possible associations with inf ammation [J]. Metabolism, 2014, 64(4): 498-505

    [7] LEE S A, KIM Y R, YANG E J, et al. CD26/DPP4 levels in peripheral blood and T cells in patients with type 2 diabetes mellitus[J]. J Cli Endocrinol Metab, 2013, 98(6): 2553-2561.

    [8] 王忠民, 盧永科. DPPIV基因影響卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制探討[J]. 中國(guó)醫(yī)藥指南, 2011, 9(10): 29-32.

    [9] KOIVISTO V. Discovery of dipeptidyl-peptidase IV——a 40 year journey from bench to patient[J]. Diabetologia, 2008, 51(6): 1088-1089.

    [10] YU D M, SLAITINI L, GYSBERS V, et al. Soluble CD26/ dipeptidyl peptidase IV enhances human lymphocyte proliferation in vitro independent of dipeptidyl peptidase enzyme activity and adenosine deaminase binding[J]. Scand J Immunol, 2011, 73(2): 102-111.

    [11] BROXMEYER H E, HOGGATT J, O’LEARY H A, et al. Dipeptidylpeptidase 4 negatively regulates colony-stimulating factor activity and stress hematopoiesis[J]. Nat Med, 2012, 18(12): 1786-1796.

    [12] SHIOBARA T, CHIBANA K, WATANABE T, et al. Dipeptidyl peptidase-4 is highly expressed in bronchial epithelial cells of untreated asthma and it increases cell proliferation along with fibronectin production in airway constitutive cells[J]. Respir Res, 2016, 17: 28.

    [13] KACER A, ARIKOK A T, KOKENEK UNAL T D, et al. Stromal expression of CD34, α-smooth muscle actin and CD26/DPPIV in squamous cell carcinoma of the skin: A comparative immunohistochemical study[J]. Pathol Oncol Res, 2012, 18(1): 25-31.

    [14] NAZARIAN A , LAWLOR K, YI S S, et al. Inhibition of circulating dipeptidyl peptidase 4 activity in patients with metastatic prostate cancer[J]. Mol Cell Proteomics, 2014, 13 (11): 3082-3096.

    [15] VARONA A, BLANCO L, PEREZ I, et al. Expression and activity prof les of DPP IV/CD26 and NEP/CD10 glycoproteins in the human renal cancer are tumor-type dependent[J]. BMC Cancer, 2010, 10: 193.

    [16] BARREIRA DA SILVA R, LAIRD M E, YATIM N, et al. Dipeptidyl peptidase 4 inhibition enhances lymphocyte traff cking, improving both naturally occurring tumor immunity and immunotherapy[J]. Nat Immunol, 2015, 16(8): 850-858.

    [17] OHNUMA K, HATANO R, MORIMOTO C, et al. DPP4 in anti-tumor immunity: going beyond the enzyme[J]. Nat Immunol, 2015, 16(8): 791-792.

    [18] STULC T, SEDO A. Inhibition of multifunctional dipeptidyl peptidase-IV: Is there a risk of oncological and immunological adverse effects?[J]. Diabetes Res Clin Pract, 2010, 88(2): 125-131.

    [19] YU D M, YAO T W, CHOWDHURY S, et al. The dipeptidyl peptidase IV family in cancer and cell biology[J]. FEBS J, 2010, 277(5): 1126-1144.

    [20] XIONG S, WANG Q, ZHANG L, et al. Identif cation of candidate molecular markers of nasopharyngeal Carcinoma by tissue microarray and in situ hybridization[J]. Med Oncol, 2011, 28(1): 341-348.

    [21] WESLEY U V, TIWARI S, HOUGHTON A N. Role for dipeptidyl peptidase IV in tumor suppression of human non small cell lung carcinoma cells[J]. Int J Cancer, 2004, 109 (6): 855-866.

    [22] 張夢(mèng)真, 喬玉環(huán), 索振河, 等. 卵巢上皮性癌組織中二肽基肽酶IV蛋白和mRNA的表達(dá)[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào), (醫(yī)學(xué)版), 2009, 44(5): 1099-1022.

    [23] SANCHEZ-OTERO N, RODRIGUEZ-BERROCAL F J, DE LA CADENA M P, et al. Exalution of pleural effusion sCD26 and DPP-IV as diagnostic biomarkers in lung disease [J]. Sci Rep, 2014, 4(2): 3999.

    (本文編輯:趙翠翠)

    Expression of dipeptidyl peptidase IV gene in gastric carcinoma and its’ signifance for prognosis

    TIAN

    Jie, ZHANG Zhi’an, SUN Guoxing, XIAO Baozeng, ZHANG Wenchao, YANG Jitao, ZHANG Qingyong, YIN Xiao, GENG Guowang. Department of General Surgery, the People’s Hospital of Qinghe, Xingtai, 054899

    Objective:To evaluate the expression of dipeptidyl peptidase IV (DPP IV) in gastric carcinoma tissue and matched para-tumor tissues, then its clinical pathologic signif cance for gastric carcinoma was investigated.Methods:One hundred and twelve cases gastric carcinomas tissues and the same number of matched para-tumor tissues were selected, expressive difference of DPP IV gene between carcinoma tissues and their matched para-tumor tissues was measured by immunohistiochemistry; with protein concentration level of DPP IV measured by Western blotting methods.Results:The expressive loss number for DPP IV was 3 (2.7%) in 110 normal gastric tissues, while lossed in 78 gastric carcinomas; and the level of DPP IV decreased obviously in DPP IV positive tissues; DPP IV is an independent prognostic factor of gastric carcinoma by multiple factor analysis.Conclusion:Loss of DPP IV’s expression is an independent poor prognostic factor of gastric carcinoma.

    dipeptidyl peptidase IV; stomach neoplasm; pathology; prognosis胃癌是人類(lèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在東方國(guó)家發(fā)病率及病死率均居惡性腫瘤前列[1-3];多數(shù)胃癌患者病情進(jìn)展較快,預(yù)后不佳。有多項(xiàng)研究顯示二肽酶(dipeptidyl peptidase,DDP)家族參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[4-8],但是關(guān)于DDP IV在胃癌臨床病理學(xué)中的預(yù)后價(jià)值鮮有報(bào)道,本研究初步探討了DDP IV在胃癌預(yù)后中的價(jià)值。

    R733.3

    B

    10.3969/j.issn.2095-9400.2017.02.013

    2016-03-05

    田杰(1977-),男,河北清河人,主治醫(yī)師。

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