姜黃素抑制β淀粉樣蛋白致小膠質(zhì)瘤細胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)

張旭彤，王孝慶，王中蘇，張英，曹紅，李軍

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325027）

姜黃素抑制β淀粉樣蛋白致小膠質(zhì)瘤細胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)

張旭彤，王孝慶，王中蘇，張英，曹紅，李軍

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325027）

目的:采用β-淀粉樣蛋白（Aβ25-35）致小鼠小膠質(zhì)瘤細胞（BV2細胞）炎癥建立阿爾茨海默?。ˋD）模型，觀察高遷移率族蛋白1（HMGB1）與糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)系，并探討姜黃素（Cur）對BV2細胞活力、HMGB1、RAGE、IL-1β、TNF-α、NF-κB表達的影響。方法:將對數(shù)生長期的BV2細胞分為4組。對照組:不做任何處理；Aβ25-35模型組:40 μmol/L Aβ25-35刺激24 h；Aβ25-35+RAGE受體阻斷組:抗RAGE抗體10 μmol/L預(yù)處理1 h后，加入40 μmol/L Aβ25-35刺激24 h；Aβ25-35+Cur治療組:姜黃素10 μmol/L預(yù)處理1 h后，加入40 μmol/L Aβ25-35刺激24 h。孵育24 h后行細胞形態(tài)學(xué)觀察，CCK8檢測細胞活性，Western blot法檢測細胞HMGB1、NF-κB、RAGE蛋白的表達情況，ELISA法檢測上清液HMGB1、IL-1β、TNF-α的含量。結(jié)果:與對照組相比，Aβ25-35模型組、Aβ25-35+RAGE受體阻斷組細胞活力明顯下降，胞內(nèi)HMGB1表達明顯升高（P＜0.05），總NF-κB表達增加（P＜0.05），上清液中IL-1β和TNF-α含量升高（P＜0.05）。與Aβ25-35模型組、Aβ25-35+RAGE受體阻斷組相比，Aβ25-35+Cur治療組細胞內(nèi)HMGB1、RAGE、NF-κB表達明顯下降（P＜0.05），上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α含量明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論:姜黃素可減輕Aβ25-35引起的BV2細胞炎癥反應(yīng)，其機制與抑制HMGB1表達及核外釋放、抑制NF-κB通路有關(guān)，與RAGE表達下調(diào)部分相關(guān)。

阿爾茨海默?。唤S素；淀粉樣β蛋白；BV2細胞；高遷移率族蛋白質(zhì)類；糖基化終末產(chǎn)物受體

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一進行性認知障礙和記憶力損害的中樞神經(jīng)退行性疾病。在美國，AD已成為第六大致死性疾病，在65歲以上的人群中為第五大致死性疾病[1]。高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是存在于真核細胞核內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，可直接促進炎癥介質(zhì)釋放，部分受糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end product，RAGE）調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦組織HMGBl水平增高，能抑制β淀粉樣蛋白（amyloid beta-protein，Aβ）的清除并加強Aβ的毒性作用[2]。姜黃素（Curcumin）是從姜黃的根莖中提取出來的一種脂溶性酚類色素，具有抗炎、抗氧化、抗斑塊、清除氧自由基等多種藥理作用。前期研究[3]發(fā)現(xiàn)，姜黃素可下調(diào)HMGB1表達及抑制HMGB1的核外釋放，從而減輕Aβ25-35引起的PC12細胞毒性。本研究采用高度純化的BV2細胞株作為體外小膠質(zhì)瘤細胞模型，用Aβ25-35誘導(dǎo)活化BV2細胞建立AD炎癥模型，探討HMGB1、RAGE在AD中的重要性及姜黃素的抗炎機制，為姜黃素用于AD治療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 BV2細胞株:購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心。

1.1.2 藥物和試劑:Aβ25-35（A4559）、姜黃素（C1386）購于美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；CCK8檢測試劑購于日本同仁化學(xué)研究所；多克隆抗RAGE抗體（af1179）、小鼠HMGB1、IL-1β、TNF-α ELISA檢測試劑盒購于美國R&D公司；HMGB1抗體（ab18256）、RAGE抗體（ab3611）、NF-κB抗體（ab7970）購于美國Abcam公司；小鼠多克隆抗β-actin抗體（ap0060）購自上海Bioworld公司。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制:Aβ25-35配成終濃度為500 μmol/L的溶液，分裝后-20 ℃保存，使用前提早7 d置于37 ℃水浴箱中孵育，即為“老化”狀態(tài)；姜黃素用DMSO溶解，配成終濃度為20 mmol/L的溶液，DMSO終濃度不超過0.1%，分裝后-20 ℃保存。

1.2.2 BV2細胞培養(yǎng):BV2細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基（含5%胎牛血清、100 μg/mL青霉素以及100 μg/mL鏈霉素），按1×104個細胞/mL密度接種到培養(yǎng)瓶，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，BV2細胞為半貼壁生長，細胞匯集至70%～80%時，按1∶3或1∶4傳代，傳代6～7次后，多數(shù)細胞轉(zhuǎn)為貼壁生長，取第10～第20代細胞進行實驗。

1.2.3 細胞分組:將對數(shù)期生長的BV2細胞分為4組。對照組:不做任何處理；Aβ25-35模型組: 40 μmol/L Aβ25-35刺激24 h；Aβ25-35+RAGE受體阻斷組:抗RAGE抗體10 μmol/L預(yù)處理1 h后，加入40 μmol/L Aβ25-35刺激24 h；Aβ25-35+Cur治療組:姜黃素10 μmol/L預(yù)處理1 h后，加入40 μmol/L Aβ25-35刺激24 h。24 h后，收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.4 CCK8法測細胞活力:取對數(shù)生長期的BV2細胞，經(jīng)胰酶消化后，吹打成單細胞懸液，將各組細胞按5×103個細胞/100 μL的密度接種于96孔板上，邊緣孔用無菌PBS填充，防止液體蒸發(fā)。16～24 h后，細胞單層鋪滿孔底，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，換液，各組加入不同濃度梯度的藥物。孵育24 h后，每孔加入10 μL的CCK溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。細胞活力=（各處理組吸光度-空白組吸光度）/（對照組吸光度-空白組吸光度）。

1.2.5 細胞形態(tài)學(xué)觀察:各組細胞孵育24 h后，置于倒置顯微鏡上觀察，比較各組細胞密度、生長狀態(tài)和突起情況。

1.2.6 Western blot法檢測各組細胞HMGB1、RAGE、NF-κB表達:按照Bradford試劑盒及文獻[3]的方法測定?？贵w濃度分別為:兔抗HMGB1抗體1∶1 000，兔抗RAGE抗體1∶1 000，兔抗NF-κB抗體1∶2 000，小鼠多克隆抗β-actin抗體1∶1 000，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體1∶5 000。用AlphaEase FC軟件分析條帶光密度。用Quantityone 4.6.2圖像分析軟件分析目的蛋白、內(nèi)參蛋白的平均光密度值，作半定量比值測定分析。

1.2.7 ELISA法測定上清液HMGB1、IL-1β、TNF-α含量:收集細胞上清液200 μL，按照小鼠HMGB1、IL-1β、TNF-α ELISA檢測試劑盒說明書處理，以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度，畫出標(biāo)準曲線。根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)HMGB1、IL-1β、TNF-α含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS16.0及GraphPad Prism5統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析并作圖。計量數(shù)據(jù)用±s表示，用Shapiro-Wilk法行正態(tài)性檢驗，用Leven法行方差齊性檢驗，多組計量資料比較采用單因素方差分析，方差齊則組內(nèi)兩兩比較采用最小顯著差異（LSD）法，否則采用Dunnett’s T3檢驗，不同濃度Aβ25-35對BV2細胞不同作用時間點存活率的影響采用重復(fù)測量資料的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Aβ25-35對BV2細胞存活率的影響 在BV2細胞培養(yǎng)基中加入Aβ25-35，細胞活力明顯下降。在6、12、24 h細胞存活率隨著Aβ25-35濃度增加而降低，而在36 h后，Aβ25-35濃度對細胞存活率影響不大。本實驗盡量考慮延長損傷時間，故確定24 h為藥物的作用時間點（見表1）。通過計算得出，其半數(shù)致死濃度（IC50）為42.1 μmol/L，為此選擇Aβ25-35的造模濃度為40 μmol/L。

表1 不同濃度Aβ25-35對BV2細胞不同作用時間點存活率的影響（n=5，±s）

表1 不同濃度Aβ25-35對BV2細胞不同作用時間點存活率的影響（n=5，±s）

與濃度為0時比:aP＜0.05

1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00 5 0.68±0.10a0.78±0.100.84±0.02a0.95±0.02 100.64±0.12a0.75±0.130.76±0.02a0.95±0.02 200.62±0.12a0.69±0.07a0.71±0.04a0.94±0.03 300.52±0.16a0.59±0.10a0.62±0.05a0.94±0.03 400.43±0.12a0.53±0.11a0.55±0.04a0.92±0.04a濃度（μmol/L）6 h12 h24 h36 h 0

2.2 姜黃素對BV2細胞存活率的影響 不同姜黃素濃度（0、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L）作用24 h后BV2細胞存活率分別為（1.00±0.00、0.97±0.05、1.10±0.09、1.10±0.13、0.92±0.09、0.58± 0.03）。20 μmol/L對細胞的毒性明顯強于其他各濃度組（P＜0.05），細胞活力下降可達57.8%。因此選擇對BV2細胞沒有抑制作用的最高姜黃素濃度為10 μmol/L，與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 倒置顯微鏡下各組BV2細胞形態(tài)學(xué)改變 對照組BV2細胞在孵育4 h左右即能貼壁，胞體較小，少量細胞有突起，突起細小（見圖1A）；Aβ25-35模型組貼壁速度明顯慢于對照組，細胞出現(xiàn)聚集狀態(tài)，胞體伸出一個或多個樹枝狀突起，連接周圍細胞，突起粗大（見圖1B）；Aβ25-35+RAGE受體阻斷組和Aβ25-35+ Cur治療組的細胞胞體肥大，核仁明顯，細胞間以突觸相連（見圖1C-D）。

圖1 倒置顯微鏡下各組BV2細胞形態(tài)學(xué)改變（×100）

2.4 Western blot法檢測結(jié)果 與對照組相比，Aβ25-35模型組Aβ25-35活化誘導(dǎo)后，HMGB1、RAGE和NF-κB灰度值明顯升高（P＜0.05）。Aβ25-35+RAGE受體阻斷組加入RAGE受體阻斷劑后，與Aβ25-35模型組相比，HMGB1、RAGE和NF-κB灰度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但均明顯高于對照組（P＜0.05）。與Aβ25-35模型組、Aβ25-35+RAGE受體阻斷組相比，Aβ25-35+Cur治療組HMGB1、RAGE和NF-κB灰度值明顯下降（P＜0.05）。見表2。

2.5 ELISA法檢測結(jié)果 與對照組相比，Aβ25-35模型組在Aβ25-35活化誘導(dǎo)24 h后，上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α含量明顯升高（P＜0.05）。Aβ25-35+ RAGE受體阻斷組與Aβ25-35模型組相比TNF-α有所下降（P＜0.05），其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Aβ25-35+Cur治療組與Aβ25-35模型組相比，HMGB1、IL-1β、TNF-α明顯下降（P＜0.05）；與對照組相比，HMGB1、TNF-α有所升高（P＜0.05），IL-1β變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表2 各組細胞活化誘導(dǎo)24 h后HMGB1、RAGE、NF-κB蛋白表達（n=7，±s）

表2 各組細胞活化誘導(dǎo)24 h后HMGB1、RAGE、NF-κB蛋白表達（n=7，±s）

與對照組比:aP＜0.05；與Aβ25-35模型組比:bP＜0.05；與Aβ25-35+RAGE受體阻斷組比:cP＜0.05

組別HMGB1RAGENF-κB對照組0.81±0.160.88±0.100.86±0.09 Aβ25-35模型組1.18±0.06a1.16±0.11a1.20±0.15aAβ25-35+RAGE受體阻斷組1.14±0.15a1.11±0.16a1.13±0.15aAβ25-35+Cur治療組0.90±0.14bc0.86±0.10bc0.87±0.20bc

表3 各組細胞活化誘導(dǎo)24 h后上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α含量比較（n=7，±s，ng/L）

表3 各組細胞活化誘導(dǎo)24 h后上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α含量比較（n=7，±s，ng/L）

與對照組比:aP＜0.05；與Aβ25-35模型組比:bP＜0.05；與Aβ25-35+RAGE受體阻斷組比:cP＜0.05

組別HMGB1IL-1βTNF-α對照組726.4± 65.426.4±4.521.0±4.1aAβ25-35模型組1 393.5±160.0a51.1±8.4a44.4±2.3aAβ25-35+RAGE受體阻斷組1 204.5±238.654.7±6.2a35.1±4.3abAβ25-35+Cur治療組988.2±217.6abc30.1±6.1bc25.2±3.7abc

3 討論

研究表明，多種因素所致小膠質(zhì)瘤細胞激活引發(fā)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)在AD的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。神經(jīng)炎癥反應(yīng)可引起認知損害、神經(jīng)細胞β-淀粉樣前體蛋白（myloid beta precursor protein，APP）表達和Aβ的沉積[4]。回顧性研究發(fā)現(xiàn)，長期服用非甾體抗炎藥（non-steroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs）能夠延緩AD的發(fā)生并減輕癥狀[5]。小膠質(zhì)瘤細胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)是AD的重要病理標(biāo)志，在AD中小膠質(zhì)瘤細胞能通過吞噬作用抑制Aβ沉積和聚集，防止斑塊的形成[6]。然而隨著疾病的發(fā)展，小膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生過多的炎癥因子、氧化產(chǎn)物，形成惡性循環(huán)，最終失去Aβ清除能力，引起神經(jīng)元的毒性作用，加快疾病進程[7]。因此小膠質(zhì)瘤細胞的生長狀態(tài)對加重或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病至關(guān)重要。

本實驗采用的BV2細胞株基本具備了原代小膠質(zhì)瘤細胞的形態(tài)學(xué)、表型及各項功能特點，相對較易培養(yǎng)，被國外許多學(xué)者所應(yīng)用。Aβ25-35是Aβ1-42的活性片段，于37 ℃水浴箱孵育5～7 d，即為“聚集”狀態(tài)。但目前有關(guān)BV2細胞與Aβ相互作用的研究鮮見報道。本實驗結(jié)果顯示，在一定時間內(nèi)，BV2細胞活性隨著Aβ25-35濃度增大而減小，但在36 h后無明顯變化，可能與培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗造成細胞缺乏營養(yǎng)支持有關(guān)。故本實驗選擇24 h為造模時間，造模濃度為40 μmol/L，結(jié)果顯示，Aβ25-35模型組貼壁速度明顯慢于對照組，細胞出現(xiàn)聚集狀態(tài)，胞體伸出一個或多個樹枝狀突起，連接周圍細胞，證實Aβ25-35具有致神經(jīng)炎性作用，離體AD炎癥細胞模型成功建立。

在大腦中，炎癥刺激伴隨著HMGB1的釋放，后者可進一步促進炎癥反應(yīng)[8]。HMGB1誘導(dǎo)小膠質(zhì)瘤細胞活化促進炎癥反應(yīng)的潛在機制及細胞信號傳導(dǎo)通路尚未明確。研究[9]表明，HMGB1能激活星形膠質(zhì)細胞，通過RAGE-MAPK/ERK1/2信號通路，引起IκB磷酸化降解而激活NF-κB，促進MMP-9、COX-2、炎癥因子等生物活性分子的表達。本研究用老化狀態(tài)下的Aβ25-35（40 μmol/L，24 h）處理BV2細胞，可增加HMGB1蛋白表達，同時促進細胞外分泌。RAGE屬于跨膜蛋白，能結(jié)合多種配體，但HMGB1是其親和力最高的配體。RAGE可介導(dǎo)小膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥、Aβ蓄積而損害小鼠學(xué)習(xí)記憶功能[10]，且可使細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激或炎癥反應(yīng)，正反饋加強RAGE的表達。本實驗采用抗RAGE抗體阻斷RAGE，發(fā)現(xiàn)HMGB1、RAGE、NF-κB表達與模型組無顯著差異，經(jīng)排除抗體的劑量及作用時間因素，分析出現(xiàn)此結(jié)果的原因可能與HMGB1致炎作用是多途徑多通路有關(guān)，阻斷RAGE并不能抑制HMGB1誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，但炎癥反應(yīng)又可導(dǎo)致RAGE表達增加。CHAVAN等[11]得出了相同結(jié)果，他們采用腦內(nèi)注射重組HMGB1后，對RAGE基因敲除大鼠的觀察表明HMGB1介導(dǎo)的大鼠記憶損害可以通過RAGE途徑。本研究顯示姜黃素可抑制HMGB1和RAGE的表達，HMGB1的作用受體RAGE雖是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵之一，但并不是唯一通路。

Aβ能促進小膠質(zhì)瘤細胞分泌IL-1、IL-6、TNF-α、NO、活性氧（ROS），導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[12]。激活的小膠質(zhì)瘤細胞首先釋放IL-1β、TNF-α，后者的級聯(lián)釋放損傷神經(jīng)元，進一步釋放IL-6[13]。其中IL-1增加Aβ的生成[14]，TNF-α加重Aβ的沉積，減弱小膠質(zhì)瘤細胞降解Aβ的能力，抑制Aβ清除。本研究結(jié)果表明，Aβ25-35活化誘導(dǎo)BV2細胞后，上清液中IL-1β、TNF-α分泌增多，而姜黃素預(yù)處理能抑制NF-κB的表達和IL-1β、TNF-α的分泌，提示姜黃素是一種抗炎藥物，能抑制小膠質(zhì)瘤細胞釋放炎癥介質(zhì)。有研究[15]表明，姜黃素的作用機制是通過磷酸化結(jié)合蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶2（SHP-2）抑制JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；也有研究[16]表明，其作用是通過JNK/p38MAPK抑制IκB磷酸化而抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄。

綜上所述，本實驗表明姜黃素可減輕Aβ25-35引起的BV2細胞炎癥反應(yīng)，其機制與抑制HMGB1表達及核外釋放、抑制NF-κB通路有關(guān)，與RAGE表達下調(diào)部分相關(guān)。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Curcumin inhibits neuroinfammation mediated by amyloid beta-protein in BV2 cells

ZHANG Xutong,

WANG Xiaoqing, WANG Zhongsu, ZHANG Ying, CAO Hong, LI Jun. Department of Anesthesiology, the Second Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective：To explore the relationship between high mobility group box1 (HMGB1) and inf ammatory response of the receptor for advanced glycation end product (RAGE) with inf ammation model of Alzheimer’s disease (AD) selected Aβ25-35-induced BV2 cells for 24 hours later, to further investigate the effects of curcumin on expression of HMGB1, RAGE, interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α) in Aβ25-35-induced BV2 cells.Methods：Cultured BV2 cells in logarithmic growth phase were divided into 4 groups: control group (group A, non-treament), model Aβ25-35group (group B, 40 μmol/L Aβ25-35, 24 h), Aβ25-35+anti-RAGE antibody group (group C, 10 μmol/L anti-RAGE antibody 1 h before+40 μmol/L Aβ25-35, 24 h) and Aβ25-35+curcumin treatment group (group D, 8 μmol/L curcumin 1 h before+40 μmol/L Aβ25-35, 24 h). The morphological character of BV2 cells was observed 24 hours later and cells viability was examined by CCK8, the level expression of HMGB1, NF-κB, RAGE in cells were detected by western blotting. The level secretion of HMGB1, IL-1β, TNF-α were detected by ELISA 24 hours later.Results：Compared with group A, the cell viability in group B and C were signif cantly declined and the level of HMGB1 protein expression in cells was signif cantly increased (P＜0.05), the expression of total NF-κB were signif cantly increased (P＜0.05), IL-1β and TNF-α in supernatant were signif cantly increased (P＜0.05). Compared with group B and C, the cell viability, the level of HMGB1 and NF-κB protein expression in cells signif cantly declined, HMGB1/IL-1β and TNF-α in supernatant signif cantly declined in group D (P＜0.05).Conclusion：Curcumin may reduce Aβ25-35-induced neuroinfammation in BV2 cells through inhibiting HMGB1 expression/extracellular released and inhibition NF-κB pathway, partly correlated with RAGE expression down-regulatd.

Alzheimer’s disease; curcumin; amyloid beta-protein; BV2 cells; high mobility group proteins; receptor for advanced glycation end product

R614.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.02.002

2016-03-31

國家自然科學(xué)基金資助項目（81271204）；浙江省科技廳公益項目（2016C37098）。

張旭彤（1974-），男，浙江溫州人，副主任醫(yī)師，博士。

李軍，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，Email:lijun0068@163.com。