林蛙油蛋白水解產(chǎn)物對小鼠抗疲勞的作用及其生理機制

李志剛，王 昶

（東北師范大學體育學院，吉林 長春 130024）

運動性疲勞是指機體在生理過程中不斷繼續(xù)在特定水平上進行或整個機體不能維持預定的運動強度[1]。研究表明[2]：長期的耐力訓練能夠誘發(fā)機體產(chǎn)生運動性疲勞。關(guān)于運動性疲勞產(chǎn)生機制以及如何促進運動性疲勞的恢復是當前體育科學領(lǐng)域面對的重大課題。耐力訓練導致的運動性疲勞的生理機制是一個極其復雜的問題，眾多學者對運動性疲勞產(chǎn)生的原因以及其中的相關(guān)機制的研究存在諸多爭議，形成了較多的假說。其中較為共識的一種說法是：在進行長期的大強度耐力訓練時，體內(nèi)自由基產(chǎn)生就會增多，導致體內(nèi)原有的自由基產(chǎn)生與清除之間的平衡被破壞，結(jié)果自由基濃度超過了傷害的“閾值”，進而引起了大量的細胞和組織損傷并導致多種疾病與絮亂[3]。因此，有必要在運動員耐力訓練后，及時對機體自由基進行清理，避免耐力訓練打破身體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡?；钚宰杂苫姆e累使機體處于氧化應激狀態(tài)，攻擊大分子和細胞器官，給身體造成傷害。關(guān)于對機體自由基進行清理的研究，有研究者認為[4]：肌肉細胞含有復雜的內(nèi)源性細胞防御機制來清除活性氧（如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT））及抵抗其他運動性氧化應激損傷。而有學者質(zhì)疑：僅憑肌肉細胞內(nèi)的內(nèi)源性細胞防御機制來清除自由基并不能起到抗疲勞的效果。但有研究發(fā)現(xiàn)[5]：外源性膳食抗氧化劑還可以減少運動性氧化應激的影響并提高動物的生理狀態(tài)。原因可能是外源性抗氧化劑可以與內(nèi)源性抗氧化劑相互作用或促進，形成抗氧化細胞網(wǎng)絡。然而，其機制尚未完全闡明。關(guān)于外源性膳食抗氧化劑的提取，眾多研究者都做了相關(guān)的研究，在一些植物中，諸如：紅曲米、雪蓮組織培養(yǎng)提取物、錫蘭發(fā)柄花中都發(fā)現(xiàn)含有內(nèi)源性抗氧化劑的存在。耿進霞等人發(fā)現(xiàn)[6]：雪蓮可能具有增強運動耐力、抗疲勞、抗體力性疲勞和消除疲勞的作用，但是雪蓮中的內(nèi)源性抗氧化劑含量極少，只有通過大劑量的雪蓮才能起到抗疲勞的作用。但是這一發(fā)現(xiàn)，促進了更多學者去探索某種飲食對抗疲勞的作用及效果，以便去提取更多的天然抗氧化成分，既可以減少氧化損傷和對抗疲勞，又沒有其他抗疲勞藥物產(chǎn)生的副作用。

隨著研究的不斷深入和發(fā)展，眾多研究表明[7]：林蛙油可以有效促進蛋白質(zhì)的合成，抑制氨基酸和蛋白質(zhì)分解，提高運動訓練大鼠血紅蛋白和糖原的儲備。林蛙油來自于曬干的雌林蛙輸卵管，也稱為蛤蟆油。更早的研究已表明林蛙油主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，占50%或更多，主要分布在中國東北。作為最有名及價值極高的東方食品和藥物，中醫(yī)認為蛤蟆油能滋陰、潤肺和補腎精。林蛙油雖然對機體運動性疲勞具有較好的恢復效果，但是始終未能清晰林蛙油抗疲勞和抗氧化的生理機制?；诖?，本研究試圖探討林蛙油水解產(chǎn)物（ORPH）的抗氧化和抗疲勞作用，通過3種蛋白水解酶來制備ORPH，通過觀察ORPH對機體生理指標的影響及變化，總結(jié)ORPH對運動性疲勞恢復的生理機制，為藥物臨床研究提供有力支持。

1 材料與方法

1.1 材料 林蛙油來源于中國棕色成熟期雌蛙（中國吉林省白頭山中國林蛙養(yǎng)殖場）。中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶購自上海凱陽生物技術(shù)有限公司。肝糖原（LG）、腓腸肌糖原（MG）、血漿乳酸（BLA）、血尿素氮（BUN）等試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 ORPH提取方法

1.2.1.1 林蛙油預處理 去除林蛙筋膜，壓碎、40目篩過濾得林蛙油粉。將林蛙油粉倒入石油醚，脫脂3次。室溫蒸發(fā)溶劑，在烘箱中于35℃干燥林蛙油。

1.2.1.2 ORPH的提取 1）分離林蛙油蛋白粉。將林蛙油剪碎，與PBS（0.01mol/L）緩沖液按照1∶10的比例混合，利用超聲波破碎細胞15min，將破碎的細胞液置于冰浴下間歇冷卻（30s∶30s），再將破碎的細胞液置于4℃的氣溫下，按照8000r/min離心20min后，吸取上清液，將固體硫酸銨緩慢加入上清液，至其飽和度達到95%。再將其置于4℃的氣溫下，按照8000r/min離心20min后，收集沉淀，透析真空，冷凍干燥[8]。2）采用中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶消化林蛙油蛋白。使用攪拌器將林蛙油蛋白粉與水（1∶10m/v）混合。將混合物置于恒溫水浴10h，使用NaOH（0.05mol/L）調(diào)節(jié)pH，接著將混合物加熱到100℃，保持10min，使酶失活。3種混合物冷卻至室溫后，將pH值調(diào)節(jié)為中性。3種混合物按照8000r/min離心20min，收集清澈上清液。然后，根據(jù)自由基清除能力選擇最合適的蛋白酶。

1.2.1.3 ORPH的制備 采用軟件設(shè)計正交實驗，然后根據(jù)對自由基的清除能力選擇最佳的水解條件。

表1 正交實驗設(shè)計（L9（34））

1.2.2 ORPH抗氧化性的測定 由于用于抗氧化能力評估的自由基系統(tǒng)可能顯著影響結(jié)果，普遍提倡使用不同的自由基系統(tǒng)來評估這種能力[9]。蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化性是通過對羥基自由基和DPPH自由基的清除能力來確定的。具體做法是通過添加不同劑量的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物（2、4、6、8、10mg/ml）測定其清除能力，進而評價蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化性。

ORPH屬于蛋白水解產(chǎn)物，對ORPH抗氧化性的測定采取不同自由基系統(tǒng)來評估，為了能最大效度地發(fā)揮ORPH抗氧化性，通過木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶3種蛋白酶制備了3種ORPH，并分別對3種ORPH進行測定，選擇對自由基清除能力最強的ORPH水解條件。1.2.2.1 對羥基自由基清除能力的測定 測定羥基自由基清除能力[10]，將2.0ml FeSO4（9.0mmol/L）、2.0ml水楊酸-乙醇溶液（9.0mmol/L）混合物與不同濃度的樣品溶液混合。然后加入2.0mlH2O2（0.01%）混勻?；旌衔镌?7℃孵育30min，測510nm處吸光度（UV754，中國上海先健科學儀器有限公司），采用2.0ml蒸餾水作為對照，重復3次。

采用如下公式：

羥基自由基清除能力（%）=[（A0-A1）/A0]×100%A0：使用蒸餾水的空白溶液吸光度；A1：樣品吸光度。

1.2.2.2 對DPPH自由基清除能力的測定 測定DPPH自由基清除能力[11]。2.0ml不同濃度的樣品溶液與2.0ml含有0.10mmol/L DPPH-純乙醇的溶液混合。使用攪拌器（QT-1攪拌器，中國上海天辰科技有限公司）用力振搖混合物，置陰暗處30min。測定最終溶液在517nm處的吸光度。采用2.0ml蒸餾水作為對照，重復3次。

采用如下公式計算清除能力：

對DPPH自由基的清除能力（%）＝[（A2－A1）/A0]×100%

A0：混合有蒸餾水DPPH吸光度；A1：混合有純乙醇樣品溶液吸光度；A2：混合有DPPH-純乙醇樣品溶液吸光度。

1.2.2.3 對超氧陰離子清除能力的測定 測定超氧陰離子清除能力[12]。4.0mlTris-HCl（pH8.2，50.0mM）與2.0ml不同濃度的樣品溶液混合物與1.0ml焦棓酚（25.0mM）混合，25℃培養(yǎng)20min。加50μl濃煙酸（10M）終止反應。測定最終溶液在420nm處的吸光度。采用2.0ml蒸餾水作為對照。重復3次。

采用如下公式計算清除能力：超氧陰離子清除能力（%）=[1-（A2-A1）/A0]×100 %A0：無樣品的焦酚吸光度.A1：無焦酚的樣品吸光度A2：有樣品的焦酚吸光度。

1.2.3 實驗設(shè)計

1.2.3.1 動物和飲食 5周大雄性昆明小鼠購自中國吉林大學藥理學實驗中心。小鼠按下列條件飼養(yǎng)：環(huán)境溫度23±1℃、相對濕度55±10%、換氣速率每小時10次、12：12h明暗周期。動物任意攝取市售標準小鼠飲食和水。所有實驗均獲得批準，并按照《動物護理和使用指南》（中國動物倫理委員會，根據(jù)美國營養(yǎng)學會AIN-93）實施，食物和水任意供給。1周適應期后，40只體重為20±2g的小鼠隨機分為5個實驗組：對照組和ORPH 50、100、500、1000mg/kg劑量組，每天游泳訓練前下午3：00灌胃給藥，持續(xù)4周。

1.2.3.2 訓練計劃 采用專門游泳訓練模型。小鼠置于游泳水槽（50cm×40cm×40cm），水深30cm，灌胃給予ORPH后，在25±1℃水溫下進行游泳訓練，訓練持續(xù)4周。在第1周，小鼠每天游泳10min。從第2至第4周，小鼠分別游泳15、20、25min。

1.2.3.3 力竭游泳測試 本研究采用力竭游泳測試（力竭時間定義為小鼠7s后不能浮出水面呼吸的時間[13]）評估ORPH抗疲勞作用。4周后，每組取8只小鼠進行測試。簡單來說，最后一次使用ORPH或蒸餾水治療后，小鼠分開放置于游泳水槽（50cm×40cm×40cm），注水至水深30cm，水溫控制在25±1℃。每只小鼠尾根部系上鉛錘（體重的10%）。力竭定義為小鼠在10s內(nèi)不能浮出水面。立即記錄游泳時間。將小鼠從泳池取出，用紙巾擦干，放回原來的籠子。每個環(huán)節(jié)完畢后更換池水。

1.2.3.4 測量疲勞相關(guān)的生化指標 游泳能力測試結(jié)束后，力竭動物用10%水合氯醛（3.5ml/kg體重，腹腔注射）立即麻醉。采用肝素化管從腹主動脈收集血液樣品。于4℃200×g分離血清10min，保存在-80℃深凍冰箱待分析?？焖偾虚_肝和腓腸肌肌肉，用冰冷的鹽溶液清洗。然后將樣品冷凍在-80℃的液氮中，直到分析糖原含量。使用購買的試劑盒，用比色法測定生化指標，包括肝糖原（LG）、腓腸肌肌糖原（MG）、血漿乳酸（BLA）。使用蒽酮試劑在620nm處測定LG和MG含量。采用氯化硝基四氮唑藍試劑在530nm處測定BLA。采用谷氨酸脫氫酶耦合酶方法通過尿素酶評估BUN。

1.2.3.5 脂質(zhì)過氧化測定 通過硫代巴比妥酸反應產(chǎn)物（TBARS）水平測定脂質(zhì)過氧化[14]。采用分光光度法，通過TBARS濃度測定肝臟和腓腸肌丙二醛（MDA）。TBARS結(jié)果表示為nmol/mg蛋白質(zhì)。每組樣品在10mmol/L冰冷磷酸緩沖液中勻漿，然后與8.1%十二烷基硫酸鈉、20%乙酸和0.75%2-硫代巴比妥酸溶液完全混勻?；旌先芤河?5°C烘箱加熱30min。冷卻后，3 500rpm離心15min去除凝絮。采用分光光度計在532nm處測定上層吸光度，并與制備好的1，1，3，3-四甲氧基丙烷標準曲線比較。根據(jù)Lowry的方法使用牛血清作為標準品測定樣品蛋白含量[15]。

1.2.3.6 SOD活性試驗 采用SOD活性試劑盒-WST（日本熊本同仁化學實驗室）測定總SOD活性。簡單而言，樣品進行勻漿，使用Bradford方法[16]分析上清液的蛋白濃度。上清液采用黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶和水溶性四唑鹽WST-1的分析試劑培養(yǎng)。在黃嘌呤氧化酶作用下，由黃嘌呤底物生成的超氧化自由基將WST-1還原成WST-1二甲，在450nm處吸光度最大。胚胎中的SOD抑制WST-1還原，因為它可催化超氧化離子的歧化作用，生成分子氧和過氧化氫。采用分光光度計在450nm處測定WST-1的還原。

1.2.4 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)用平均值±標準差（n=8）表示。使用方差分析與Tukey’s HSD事后檢驗測定平均值差異，用Spss20.0分析。P＜0.05表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 ORPH抗氧化能力的測定結(jié)果

2.1.1 對羥基自由基清除能力的測定 如圖1所示，所有蛋白酶均顯示有清除羥基自由基的能力，其中中性蛋白酶水解產(chǎn)物和木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物活性最大。水解產(chǎn)物的羥基自由基清除能力范圍為14.82%～39.33%。中性蛋白酶水解產(chǎn)物的羥基自由基清除率比木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物稍高。中性蛋白酶水解產(chǎn)物的清除率顯著高于與堿性蛋白酶水解產(chǎn)物。3種蛋白酶水解產(chǎn)物的羥基自由基清除率隨著濃度增加而增加。當?shù)鞍姿猱a(chǎn)物濃度為10mg/ml，清除率達39.33%?？紤]到自由基的生物學影響，這些結(jié)果具有生理學意義。

圖1 羥基自由基清除能力

2.1.2 對DPPH自由基清除能力的測定 如圖2所示，所有水解產(chǎn)物均能清除DPPH自由基。水解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力范圍為23.86%～47.00%。3種酶中，中性蛋白酶作用的水解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力最高，清除率可達到47%。堿性蛋白酶作用下的蛋白水解產(chǎn)物隨著濃度增加，清除自由基的能力稍微增加，該變化太小而難以看出，可能是由于堿性蛋白酶需要的堿性環(huán)境影響或破壞林蛙油的抗氧化劑。

圖2 清除DPPH自由基的能力

2.1.3 對超氧陰離子清除能力的測定 如圖3顯示，由3種酶水解的蛋白水解產(chǎn)物中，由中性蛋白酶制備的蛋白水解產(chǎn)物清除超氧化陰離子的能力最強。3種蛋白酶水解產(chǎn)物清除超氧化陰離子的能力隨著濃度增加而增加。當?shù)鞍姿猱a(chǎn)物濃度為10mg/ml，清除率可達到32.61%。

圖3 不同林蛙油蛋白水解產(chǎn)物對O2的清除能力

采用3種蛋白酶制備蛋白水解產(chǎn)物。根據(jù)這些結(jié)果，由中性蛋白酶制備的蛋白水解產(chǎn)物清除羥基自由基、超氧化陰離子、DPPH自由基的清除率均非常高。因此，后面實驗選擇中性蛋白酶。

2.1.4 正交實驗結(jié)果 從正交結(jié)果來看，A2B2C2D2是最佳的水解組合。溫度（A）為50℃，pH值（B）為7.5，酶劑量（C）為4%，水解時間（D）為10h。C的極值R意味著水解酶劑量是影響水解的主要因素。D、B、A依次下降表示水解影響因素的程度大小排列為：C＞D＞B＞A?？紤]到成本，C2是最佳選擇。A2的平均值高于A1和A3，因此A2是最佳水解水平。同樣地，B2和D2是最佳水平。因此A2B2C2D2確定為最佳水解條件。我們另外進行實驗證實正交結(jié)果，水解產(chǎn)物的羥基自由基清除率達到39.35%，高于最大正交清除測試組，表明正交實驗結(jié)果是真實的。

2.2 ORPH對小鼠游泳能力的影響 力竭游泳的測定可直接客觀地反映個體的抗疲勞能力。表3顯示，與對照組相比，蛋白水解產(chǎn)物中，高及最高劑量組的小鼠游泳時間顯著增加。中劑量組和對照組之間有顯著差異（P＜0.05），高和最高劑量組與對照組相比均有非常顯著的差異（P＜0.01）。但低劑量組和對照組之間無顯著差異（P＜0.05）。證實蛋白水解產(chǎn)物可顯著提高小鼠游泳時間，結(jié)果提示蛋白水解產(chǎn)物有明顯的抗疲勞作用。

表2 正交實驗設(shè)計和結(jié)果

表3 林蛙油酶解水解產(chǎn)物對游泳時間的影響

2.3 ORPH對小鼠疲勞相關(guān)生化指標的影響

2.3.1 ORPH對小鼠LG和MG的影響 隨著運動負荷量的增加，脂肪酸代謝增大，肝糖原（LG）和肌糖原（MG）比率減少。肝糖原和肌糖原是影響疲勞形成的重要因素。表4（見下頁）顯示，林蛙油蛋白治療組運動后肝糖原和肌糖原含量比對照組高。這些數(shù)據(jù)表明林蛙油蛋白治療顯著增加小鼠游泳后肝糖原和肌糖原的水平（P＜0.05）。

2.3.2 ORPH對小鼠BLA和BUN的影響 血漿乳酸（BLA）和血尿素氮（BUN）是判斷疲勞程度的重要指標。表5顯示（見下頁），游泳練習后，林蛙油蛋白治療組的乳酸和血尿素氮水平低于對照組。林蛙油蛋白治療組的乳酸水平分別下降8%、20%、39%和42%。此外，林蛙油蛋白治療組的血尿素氮水平分別下降13%、18%、34%和45%。與對照組相比，林蛙油蛋白治療組顯著減少血漿乳酸和血尿素氮水平，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。

表4 林蛙油蛋白對小鼠LG和MG的影響

表5 林蛙油蛋白對BLA和BUN的影響

2.4 ORPH對肝臟MDA含量和SOD活性的影響 丙二醛水平（MDA）是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物。表6顯示，50、100、500、1000mg/kg林蛙油蛋白治療組的MDA濃度與對照組相比分別下降4%、5%、17%和22%。500、1000mg/kg治療組與對照組相比肝臟內(nèi)MDA濃度顯著降低（P＜0.05）。

表6 林蛙油蛋白對肝臟MDA含量和SOD活性的影響

肝蛋白（SOD）屬于生命體的活性物質(zhì)。表6顯示，對照組SOD活性為9.5±0.59。林蛙油蛋白治療組SOD活性分別為10.1±0.76、10.9±0.64、12.5±0.72和11.6±0.98單位/mg蛋白。林蛙油蛋白治療組肝臟內(nèi)SOD活性與對照組相比顯著增加（P＜0.05）。此外，50和100mg/kg林蛙油蛋白治療組與對照組相比無顯著差異。

2.5 ORPH對腓腸肌內(nèi)MDA含量和SOD活性的影響 表7顯示，50、100、500、1000mg/kg林蛙油蛋白治療組的MDA濃度與對照組相比分別下降10%、26%、19%和31%。500、1000mg/kg治療組與對照組相比腓腸肌內(nèi)MDA濃度顯著降低（P＜0.05）。

表7 林蛙油蛋白對腓腸肌內(nèi)SOD活性和MDA含量的影響

表7顯示，對照組SOD活性為5.9±0.25。林蛙油蛋白治療組SOD活性分別為6.3±1.25、7.4±0.24、7.9±0.72和9.2±0.98單位/mg蛋白。林蛙油蛋白治療組腓腸肌的SOD活性與對照組相比顯著增加（P＜0.05）。此外，50和100mg/kg林蛙油蛋白治療組與對照組相比無顯著差異。

3 討論與分析

運動性疲勞指高強度運動后機體運動能力暫時性抑制[17]。在充足的休息和調(diào)節(jié)后，身體恢復作業(yè)能力。如果運動員在上次疲勞完全恢復之前誘發(fā)新的疲勞，累積疲勞最終會導致過度疲勞。過度疲勞會影響一個人的整體健康和運動能力。如果采取干涉措施消除或減少疲勞并促進體力全面恢復，可持續(xù)滿足機體的能量需求，且可保持甚至增加鍛煉強度，具有明確的運動益處。在高強度運動中，能量損耗和肌肉疲勞可能限制運動能力。通過注射蛋白或氨基酸來補充運動后的營養(yǎng)是加快疲勞恢復的關(guān)鍵[18]。與蛋白質(zhì)相比，蛋白水解產(chǎn)物可快速輕松地被吸收。通過羥基自由基清除能力測定、DPPH自由基清除能力測定以及超氧化陰離子清除能力測定證明ORPH的抗氧化作用。

本研究證實蛋白水解產(chǎn)物可顯著增加小鼠游泳時間，結(jié)果說明蛋白水解產(chǎn)物具有明顯的抗疲勞作用。本文探討了從林蛙油提取的蛋白水解產(chǎn)物是否能改善運動性疲勞。為評估林蛙油蛋白水解產(chǎn)物可能的作用機制，通過分析及測定小鼠的肝臟和血尿素氮（BUN）及乳酸水平，評估疲勞小鼠的肝臟和肌糖原。結(jié)果顯示由中性蛋白酶消化制備的蛋白水解產(chǎn)物不僅在體外有抗氧化作用，而且在小鼠體內(nèi)有抗氧化作用。本研究結(jié)果顯示，大量運動誘導氧化應激，但林蛙油蛋白水解產(chǎn)物可通過抗氧化作用緩解疲勞。目前正在進行的實驗可更深入地了解保健產(chǎn)品對預防小鼠因大量運動引起的氧化應激損傷的有用性、安全性及有效性，但未來仍需進行更多的研究。

4 結(jié) 論

中性蛋白酶制備ORPH最佳水解條件為:溫度為50℃，pH值為7.5，酶劑量為4%，水解時間為10h。ORPH對游泳耐力訓練大鼠運動性疲勞的恢復具有良好的作用，ORPH通過增加SOD活性改善酶抗氧化系統(tǒng)，從而達到抗疲勞、延長運動訓練時間的作用，其生理機制可能是通過補充肝糖原和肌糖原，消除血乳酸、血尿素氮和肝臟、腓腸肌丙二醛，以及增強抗氧化酶的活性來實現(xiàn)的。

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