沙苑子對運動大鼠海馬GAD67、GABA-T、SSADH酶基因表達的調(diào)控研究

劉志剛，聶玉芝，劉 琴

(1.玉溪師范學院 體育學院，云南 玉溪 653100;2.北京市第66中學，北京 100053;3.玉溪師范學院 資環(huán)學院，云南 玉溪 653100)

沙苑子對運動大鼠海馬GAD67、GABA-T、SSADH酶基因表達的調(diào)控研究

劉志剛1，聶玉芝2，劉 琴3

(1.玉溪師范學院 體育學院，云南 玉溪 653100;2.北京市第66中學，北京 100053;3.玉溪師范學院 資環(huán)學院，云南 玉溪 653100)

目的：研究沙苑子對運動大鼠海馬Glu和GABA代謝相關(guān)的酶GAD67、GABA-T、SSADH基因表達的影響。方法：SD大鼠隨機分為安靜組(Control group)，一般訓練組(training control group，TC group)，強化訓練組(intensive training group，IT group)，沙苑子干預強化訓練組(SAC intervention and intensive training group，SACIT group)。第7周末取材，分離大鼠海馬組織，研磨后以Trizol抽提RNA，經(jīng)RT-PCR后產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳。凝膠分析系統(tǒng)掃描各電泳條帶并定量。各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，以S-N-K檢驗并計算效應量Cohen’s d值。結(jié)果：GAD67: IT group極顯著高于其他三組(P<0.01,P<0.01,P<0.01)；TC和SACIT group極顯著高于Control group(P<0.01,P<0.01)；GABA-T：IT group極顯著低于其他三組(P<0.01,P<0.01,P<0.01)；SSADH: IT group 極顯著低于其他三組(P<0.01,P<0.01,P<0.01)，SACIT group極顯著低于 TC group(P<0.01)。結(jié)論：1)運動能夠極顯著提高大鼠海馬GAD67表達的同時降低GABA-T和SSADH的表達，促進了中樞抑制且與運動強度相關(guān)。2)沙苑子能極顯著降低運動大鼠海馬GAD67的表達而提高GABA-T和SSADH的表達，減少中樞Glu向GABA轉(zhuǎn)化，使大鼠海馬整體興奮性上升，有效對抗大強度運動產(chǎn)生的中樞抑制和中樞疲勞。3)沙苑子對大鼠海馬GAD67、GABA-T和SSADH的調(diào)控作用可能與它突出的谷氨酸含量、顯著的抗氧化能力以及改善腦缺氧的作用有關(guān)。4)支持以巴甫洛夫為代表的對運動性疲勞的“保護性抑制”學說，但并不完全支持該學說所主張的運動性疲勞的“是一種主動而不是被動的過程”。

沙苑子；海馬；基因調(diào)控；中樞疲勞

沙苑子(semen astragali complanati，SAC)是豆科黃芪屬植物扁莖黃芪(astragatus complanatus)的種子?；瘜W分析表明[1-2]，沙苑子含有三萜和黃酮類等生物活性物質(zhì)，具有抗疲勞、增強免疫和保肝的作用。已有的研究表明[3]，興奮、抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)在腦內(nèi)代謝失衡是導致運動性中樞疲勞的重要因素。海馬回主要負責短期的學習和記憶，與運動技能的形成密切相關(guān)。海馬神經(jīng)元電生理活動受運動強度的影響而產(chǎn)生不同變化，運動疲勞可明顯改變大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的自發(fā)和誘發(fā)放電活動，并可導致海馬回出現(xiàn)長時程抑制(long-term depression，LTD)，使其學習和記憶能力降低[4]。本實驗通過研究運動大鼠海馬部位與谷氨酸(glutamic acid，Glu)和γ-氨基丁酸(γ- aminobutyric acid，GABA)代謝相關(guān)的酶—谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)、γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(GABA transaminase，GABA-T)、琥珀酸半醛脫氫酶(Succinic semialdehyde dehydrogenase，SSADH)mRNA表達的變化，研究沙苑子對運動大鼠中樞疲勞的影響和對氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與儀器

1.1 材料

選用3月齡SPF(Specific pathogen Free，SPF)級SD(Sprague-Dawley)雄性健康大鼠48只，體重210 g～230 g。購自陜西省中醫(yī)藥研究所動物飼養(yǎng)中心(動物合格證：陜醫(yī)動字第08-005號)，同時購入國家標準嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)，自由飲水、攝食。飼養(yǎng)溫度20℃～25℃，環(huán)境相對濕度40%～60%，噪聲≤50 dB，自然光照明。沙苑子購自陜西省恒心堂制藥有限公司，為商品藥物顆粒制劑，輔料為蔗糖、糊精(成分配比為：60%沙苑子浸膏:蔗糖:糊精 = 1:3:3，輔料僅起填充、粘合和賦形作用)。

1.2 主要儀器

德國Hettich MIKRO 22R冷凍離心機；天津泰斯特DK-98-1A恒溫水浴鍋；德國Sartorius BP-310S電子天平；杭州段氏DSPT-202型大鼠跑臺；上海申安LDZX-30KBS高壓滅菌鍋；廣東科龍BCD-272電冰箱；德國Eppendorf微量移液器；日立U-3900紫外分光光度計；蘇州凈安泰SW-CJ-2FD超凈工作臺；美國Stratgene Mx3000P PCR儀；北京六一廠DYCP-31E電泳儀；英國劍橋UVItec凝膠分析系統(tǒng)。

2 動物訓練方案

2.1 動物分組

SD大鼠隨機分為4組，每組12只。安靜組(Control group)，不給予任何訓練；一般訓練組(training control group，TC group)，先進行5周適應性訓練后再進行2周一般性訓練；強化訓練組(intensive training group，IT group)，先進行5周適應性訓練后再進行2周強化訓練；沙苑子干預強化訓練組(SAC intervention and intensive training group，SACIT group)，先進行5周適應訓練后再進行2周強化訓練，同時喂服沙苑子。

2.2 運動模型

表1 實驗動物運動方案

采用Benford運動模型，略有改動。適應環(huán)境2 d后開始按計劃訓練，以強度遞增的方式在水平放置的跑臺上運動，零坡度。每天18:00-18:30為固定訓練時間。從訓練第1周起開始，每周遞增速度依次為15 m/min→22 m/min→27 m/min→31 m/min→35 m/min。每次訓練持續(xù)20 min，每周訓練5 d，持續(xù)5周。第5周后按下列方案訓練：

一般訓練：第6、7周(每周7 d)，大鼠以35 m/min速度，在水平跑臺上訓練20 min。

強化訓練：第6、7周(每周7 d)，大鼠以35 m/min速度，在水平跑臺上訓練30 min。

造模共持續(xù)7周，于第7周末取材。

2.3 給藥方案：按照實驗動物與人用藥量的換算關(guān)系以及參考文獻[5]，確定SACIT group大鼠每日固定的時間(9:00-9:30)按1.8 g/kg的給藥劑量，以2 mL生理鹽水溶解后經(jīng)口腔灌胃。其余組喂服等量生理鹽水，每天一次。

2.4 取材和測試

實驗動物按照運動方案完成全部訓練后，于第7周末按照SACIT group、IT group、TC group、Control group的順序依次取材。大鼠用乙醚麻醉，離斷頸椎處死，開顱取出完整大腦，分離大腦海馬組織，以預冷的生理鹽水沖洗殘余血液，濾紙吸干。

3 測試步驟

采用半定量RT-PCR技術(shù)測定大鼠海馬GAD67、GABA-T、SSADH基因表達變化。

3.1 總RNA的提取

從大鼠海馬分離少許新鮮組織，稱重后立即投入液氮中進行研磨，并按1mL Trizol/100 mg組織加入Trizol勻漿并抽提RNA。

1)按照1mL Trizol/100 mg組織的配比加入Trizol，室溫下震搖5～10 min，充分裂解；

2)按照體積1 : 5的比例在Trizol中加入氯仿，室溫下劇搖15 s，靜置5 min；

3)4℃離心15 min，12 000 rpm；

4)吸上清于另一個Eppendorf管中(只留管中少量沉淀)，加入0.8 mL異丙醇混勻，靜置10 min；

5)4℃離心15 min，12 000 rpm；

6)用1 mL 75%乙醇洗滌沉淀；

7)4℃離心10 min，10 000 rpm，棄上清。沉淀RNA，并風干10 min(不宜太干燥，否則RNA不易溶解，溶解的RNA OD260：OD280=1.8-2.0)

8)以50 μL DEPC水溶解RNA后加入20 μL RNasin，于-20℃保存。

采用甲醛變性凝膠電泳鑒定RNA是否降解，紫外分光法鑒定RNA的純度及對RNA進行定量。取1 μL總RNA加入4 μL樣本緩沖液，加1 μL的溴化乙錠(ethidium bromide，EB)后，于65℃變性10 min，以1%瓊脂糖凝膠(含18%的甲醛)于45℃恒溫電泳4 h，觀察28S、18S和5S三條帶是否清晰，有無降解，以及是否存在DNA污染。取1 μL RNA樣品溶于99 μL DEPC處理的雙蒸水中，紫外分光法測定吸光度值。純凈的RNA其 A260/A280=1.8-2.0，若該比值低于1.8，說明RNA被蛋白質(zhì)或酚污染，需重新抽提。同時此法可以對RNA進行定量，1個A260單位相當于40 μg/mL RNA。

3.2 RT-PCR

按試劑盒說明操作合成cDNA第一鏈，然后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1)冰盒內(nèi)，將10 μL RNA，1 μL隨機聚體引物，1 μL H2O加入0.5 mL離心管，在70℃反應5 min；

2)冰盒內(nèi)，加4 μL 5×緩沖液，1 μL RNasin，2 μL dNTP(10 mM)，25℃反應5 min；

3)加1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶AMV，25℃反應10 min；

4)42℃溫水浴60 min；

5)70℃10 min反應終止；所得cDNA可用于PCR擴增。

PCR擴增按試劑盒說明操作。取cDNA 10 μL作為模板，50 pM上、下游引物各1 μL，2×MasterMix反應體系12.5 μL，最后以無菌雙蒸水補至25 μL，并混勻。加石蠟油50 μL覆蓋。先95℃預變性5 min，然后94℃變性 60 s，55℃～60℃變性60 s，72℃變性60 s，28個循環(huán)后，72℃延伸300 s。

GAD67、GABA-T、SSADH和β-actin的cDNA序列由Genbank獲取。

GAD67、GABA-T、SSADH和內(nèi)參照β-actin基因引物序列設計如表2所示：

表2 引物序列

3.3 電泳定量結(jié)果

RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后在波長256 nm紫外燈下觀察并拍照。用UVI凝膠圖像分析系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物電泳條帶進行光密度分析，通過GAD67/β-actin、GABA-T/β-actin和SSADH/β-actin的OD比值對這三種基因的mRNA表達作相對定量(圖1、圖2、圖3、表3)。

圖1 各組大鼠海馬GAD67 mRNA表達情況

圖2 各組大鼠海馬GABA-T mRNA表達情況

圖3 各組大鼠海馬SSADH mRNA表達情況

基因/組別Controlgroup?TCgroup?ITgroup?SACITgroup?GAD67mRNA1．14±0．02?1．25±0．03??1．39±0．071．28±0．02??GABA-TmRNA0．98±0．04?0．97±0．02?0．94±0．010．97±0．01?SSADHmRNA0．97±0．01?0．98±0．02?0．93±0．020．96±0．01??

注：和IT group比，P<0.01；和Control group比，P<0.01；和TC group比，P<0.01。

結(jié)果如表3所示，GAD67: IT group極顯著高于其他三組(P<0.01，P<0.01，P<0.01。Cohen’d=0.92/0.79/0.73)；TC和SACIT group極顯著高于Control group(P<0.01，P<0.01。Cohen’d=0.91/0.96)；GABA-T：IT group極顯著低于其他三組(P<0.01，P<0.01，P<0.01。Cohen’d=0.57/0.69/0.83)；SSADH: IT group 極顯著低于其他三組(P<0.01，P<0.01，P<0.01。Cohen’d=0.78/0.78/0.69)，SACIT group極顯著低于 TC group(P<0.01，Cohen’d=0.53)。

按照Cohen的標準，d值越大t檢驗的結(jié)果越可靠。通常把d值小于0.2時認為具有很小的效應量，即t檢驗結(jié)果可靠性較低；而d值在0.5附近具有中等效應量；d值大于0.8時具有大的效應量，即t檢驗結(jié)果具有比較大的可靠性。

4 討 論

眾多研究顯示氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)參與介導了運動疲勞導致的海馬興奮性變化。Glu是中樞內(nèi)興奮性最強的氨基酸遞質(zhì)，而GABA則是抑制性最顯著的氨基酸遞質(zhì)。Glu/GABA比值可反映大腦的興奮狀態(tài)和水平。運動導致大鼠海馬Glu/GABA比值降低，使大鼠海馬神經(jīng)元突觸后抑制增強，興奮性下降，可發(fā)展為中樞疲勞[6]。Glu與GABA的代謝存在如圖4所示的關(guān)系。由圖4可以看出，如果運動中GAD活性增高而GABA-T與SSADH活性下降，則會導致GABA生成增多而氧化減弱，致使GABA在中樞堆積。

圖4 Clu與GABA代謝關(guān)系

海馬回作為支配運動技能形成的中樞結(jié)構(gòu)和記憶環(huán)路，其興奮水平的變化直接影響到運動技能的完成。運動導致海馬GABA增多和Glu減少，Glu/GABA比值降低是運動性中樞疲勞的重要原因[7-8]。對實驗數(shù)據(jù)的分析顯示，沙苑子則可以有效對抗和延緩運動性中樞疲勞的發(fā)生和發(fā)展，具有明顯的抗疲勞的作用。

GAD有GAD65和GAD67兩種亞型，前者主要存在于神經(jīng)末梢，通常以脫輔基酶的形式存在，因而不太活躍；后者主要存在于神經(jīng)元胞體內(nèi)，以結(jié)合輔基的形式存在，十分活躍。因此選擇GAD67作為觀測指標更靈敏[9]。如表3所示，GAD67在大鼠海馬的表達隨著運動強度增加而上調(diào)，經(jīng)沙苑子干預后，SACIT group顯著低于對照組IT group(P<0.01)，說明在大強度運動時沙苑子可以抑制GAD67在大鼠海馬中的高表達。

實驗數(shù)據(jù)如表3顯示，GABA-T在大鼠海馬中的表達隨著運動強度的增加而降低，IT group均顯著低于其他三組(P<0.01，P<0.01，P<0.01)。經(jīng)沙苑子干預后，SACIT group顯著高于對照組IT group(P<0.01)。這說明沙苑子可以顯著促進運動大鼠GABA-T表達上調(diào)，加強GABA的氧化過程，減少GABA在中樞的堆積，因而顯示出沙苑子的抗運動性中樞疲勞作用。SSADH基因在各組大鼠海馬的表達情況也出現(xiàn)了類似的結(jié)果。運動導致SSADH 基因表達下調(diào)，且與運動強度呈正相關(guān)。表3顯示SACIT group顯著高于TC group(P<0.01)，說明沙苑子干預可以顯著遏制運動導致的SSADH基因表達下調(diào)。由于GAD67、GABA-T和SSADH是Glu和GABA在大腦中代謝平衡的關(guān)鍵酶，且由于Glu和GABA難以通過血腦屏障而主要在腦細胞內(nèi)代謝，因此以上實驗結(jié)果提示：第一，運動會導致大鼠海馬GAD67表達上調(diào)而GABA-T和SSADH表達下調(diào)，且與運動強度有明顯的相關(guān)性。第二，對實驗數(shù)據(jù)的分析可知，沙苑子可以顯著下調(diào)運動中大鼠海馬GAD67表達和上調(diào)GABA-T與SSADH表達的作用，有效抑制和延緩Glu/GABA比值的下降，使大鼠海馬維持較高水平的興奮性而表現(xiàn)出抗疲勞的作用。第三，根據(jù)運動性疲勞的“保護性抑制”學說[10]，具有興奮性的Glu在運動中代謝為抑制性的GABA，加強了中樞抑制并發(fā)展為運動性疲勞，避免機體在運動中產(chǎn)生過度“損耗”，是一種負反饋調(diào)節(jié)，可以看做是機體在運動中產(chǎn)生的一種自我保護。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)[11-12,13,15]，力竭訓練使大鼠血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase，AST)和尿素氮(blood usea nitrogen，BUN)顯著升高，嚴重損害其肝腎功能。沙苑子對運動大鼠海馬GAD67、GABA-T和SSADH的調(diào)控作用可能與其補益肝腎的作用有關(guān)。從中醫(yī)的角度看，沙苑子性溫味甘，有溫補肝腎、固精、縮尿、明目的作用。而腎主骨、藏精、生髓，為先天之本、元氣所在，是“側(cè)力”產(chǎn)生的源泉。肝藏血，主疏泄，若疏泄失調(diào)則可導致身體機能下降，降低運動能力，促使疲勞出現(xiàn)[14]。沙苑子補腎、固精、益肝的作用亦被現(xiàn)代醫(yī)學所證實。黃崇剛等用沙苑子干預醋酸棉酚和環(huán)磷酰胺所致的大鼠生精障礙模型后發(fā)現(xiàn)，沙苑子提取物能明顯增加大鼠的精子數(shù)和精子活動率，降低畸形率并提高其精囊腺指數(shù)[16-17]。孫利兵等[18]的研究證實沙苑子黃酮對四氯化碳所致的小鼠肝損傷有明顯的保護和抗脂質(zhì)過氧化作用。王文心[19]的研究認為沙苑子可以明顯改善抑郁癥小鼠的抑郁狀態(tài)，有明顯的抗抑郁作用。而抑郁癥與大腦突觸間隙的神經(jīng)遞質(zhì)代謝失調(diào)密切相關(guān)。

沙苑子對大鼠海馬GAD67、GABA-T和SSADH的調(diào)控作用還可能與它的氨基酸含量和構(gòu)成有關(guān)。沙苑子含有14種氨基酸，其中以Glu含量最高，達到68%[1,20]。我們推測沙苑子突出的Glu含量可能與其抗中樞疲勞的作用存在一定關(guān)聯(lián)。雖然正常情況下外周血中的Glu并不能通過血腦屏障，但由于大腦是耗氧量很大且高度依賴氧的器官，運動時血流重新分配導致腦組織缺血、缺氧，引起NO升高、pH值下降、胞內(nèi)Ca2+濃度升高并通過蛋白激酶、蛋白磷酸酶、Rho激酶調(diào)控構(gòu)成血腦屏障的咬合蛋白、ZO-1蛋白、ZO-2蛋白、閉鎖蛋白-5構(gòu)象變化，使拉鏈結(jié)構(gòu)遭到破壞，引起血腦屏障通透性增大[21-22]，在此基礎上可能會有部分Glu進入腦內(nèi)并影響大腦的興奮狀態(tài)。

運動時的腦缺血缺氧還會使有氧代謝受阻，誘導NO產(chǎn)生增多，后者可抑制GABA-T活性，使GABA堆積增多。沙苑子多酚不僅具有很強的抗氧化能力，改善腦血流恢復時產(chǎn)生的缺血再灌注損傷，而且還可以改善腦的缺氧狀態(tài)，而缺氧正是抑制GABA-T表達的因素之一。[6,23]

5 結(jié) 論

1)運動顯著提高大鼠海馬GAD67表達的同時降低GABA-T和SSADH的表達，促進了中樞抑制且與運動強度相關(guān)。2)沙苑子能顯著降低運動大鼠海馬GAD67的表達而提高GABA-T和SSADH的表達，減少中樞Glu向GABA轉(zhuǎn)化，使大鼠海馬整體興奮性上升，有效對抗大強度運動產(chǎn)生的中樞抑制和中樞疲勞。3)沙苑子對大鼠海馬GAD67、GABA-T和SSADH的調(diào)控作用可能與它突出的谷氨酸含量、顯著的抗氧化能力以及改善腦缺氧的作用有關(guān)。4)支持以巴甫洛夫為代表的對運動性疲勞的“保護性抑制”學說，但并不完全支持該學說所主張的運動性疲勞的“是一種主動而不是被動的過程”。

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Regulation and control effects of semen astragali complanati on GAD67, GABA-T and SSADH gene expression in the hippocampus of exercised rats

LIU Zhi-gang1,NIE Yu-zhi2,LIU Qin3

(1.Inst.ofPE,YuxiNormalUniversity,Yuxi653100;2.BeijingNo. 66MiddleSchool,Beijing100053;3.SchoolofResourcesandEnvironment,YuxiNormalUniversity,Yuxi653100,China)

Objective: Study on the regulation and control effects of semen astragali complanati (SAC) on GAD67, GABA-T and SSADH gene expression in the hippocampus of exercised rats.Methods: SD rats randomly divided into 4 groups: a control group; training control group (TC group); intensive training group (IT group); SAC intervention and intensive training group(SACIT group). The rat’s hippocampus tissue was isolated after 7 weeks training. The tissue homogenate was prepared and extracted with Trizol. After RT-PCR, the products were separated by 1% agarose gel electrophoresis. Gel analysis system scans the electrophoresis bands and carries out quantitative analysis. All data of each group are tested by S-N-K of one way ANOVA.Results: GAD67: IT group significantly enhanced than the other three groups (P<0.01,P<0.01,P<0.01, TC and SACIT group significantly enhanced than Control group (P<0.01,P<0.01);GABA-T: IT group significantly decreased than the other three groups (P<0.01,P<0.01,P<0.01); SSADH: IT group significantly decreased than the other three groups (P<0.01,P<0.01,P<0.01), and SACIT group significantly decreased than TC group (P<0.01).Conclusions:1) exercise significantly enhanced GAD67while decreased GABA-T and SSADH expression in the hippocampus of exercised rats. 2) SAC can significantly decrease GAD67while enhance GABA-T and SSADH expression in the hippocampus of exercised rats. So SAC can resist Glu convert to GABA and improve the excitability of the hippocampus and delay the central fatigue in exercised rats. 3) The regulation effect of semen astragali complanati on GAD67, GABA-T and SSADH in hippocampus of exercised rats may be related to its Glu content, anti-oxidant capacity and the effect of improving cerebral anoxia. 4)This study support for Pavlov's theory of "protective inhibition of sports fatigue", but does not fully support the theory that "sports fatigue is an active rather than a passive process".

semen astragali complanati; hippocampus; gene regulation and control; central fatigue

2016-11-07

國家自然科學基金項目(編號：51568066)。

劉志剛(1977- )，男，河北石家莊人，碩士，講師，研究方向運動生化與營養(yǎng)。

G804.7

A

1009-9840(2017)01-0053-06