一株高效氨氮降解菌的分離及其氨氮去除能力分析

劉亞樵, 韓學軍, 譚好臣, 陸洪省

(山東科技大學 化學與環(huán)境工程學院，山東 青島 266590)

一株高效氨氮降解菌的分離及其氨氮去除能力分析

劉亞樵, 韓學軍, 譚好臣, 陸洪省

(山東科技大學 化學與環(huán)境工程學院，山東 青島 266590)

篩選和鑒定高效降解氨氮的細菌，并應用到污水脫氮處理中。首先從活性污泥中分離篩選出12株氨氮降解菌，選取其中氨氮降解能力最強的菌株(命名為AN-1)為研究對象，對該菌株形態(tài)、生理生化性質(zhì)、系統(tǒng)分類學位置、不同影響條件下的氨氮降解能力進行分析。結果表明：菌株AN-1為革蘭氏陰性菌，桿狀，菌落為乳白色，接觸酶和氧化酶反應均為陽性。菌株AN-1降解氨氮的最適宜溫度為30 ℃，pH為8.0，氨氮降解率最高達78%；該菌株16S rDNA序列與Shinellazoogloeoides(GU930756)相似度最高(95%)。因此，該氨氮降解菌AN-1具有高效降解氨氮的能力，屬于申氏桿菌屬(Shinella)。

氨氮降解菌；申氏桿菌；活性污泥；分離

對氨化細菌分離篩選的研究[2-8]很多，目前已知的氨化細菌有芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminuta)、 糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、變形桿菌屬(Proteus)、沙雷菌屬(Serratia) 及微球菌屬(Micrococcus)[9-10]。本研究是從山東某污水廠活性污泥中篩選、分離氨氮降解菌，對其形態(tài)、生理生化性質(zhì)、氨氮降解能力以及分類學位置進行了分析，為污(廢)水中高效氨化細菌的分離篩選以及水體富營養(yǎng)化控制提供一定的理論基礎。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑和儀器

分離氨氮降解菌的活性污泥來自于山東某污水處理廠。

使用的化學試劑: 硫酸銨、氯化鈉、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、碳酸氫鈉、對氨基苯磺酸、α-奈胺，均為分析純。

納氏試劑的配制：稱取60 g氫氧化鉀，溶于約250 mL無氨水中，冷卻至室溫。另外稱取20 g碘化鉀溶于100 mL無氨水中，邊攪拌邊逐步加入二氯化汞結晶粉末(約10 g)，至出現(xiàn)朱紅色沉淀不易溶解時，改為滴加飽和二氯化汞溶液，保持攪拌，到出現(xiàn)少量朱紅色沉淀不易溶解時，停止滴加飽和二氯化汞溶液。然后把該溶液緩慢注入上述已冷卻的氫氧化鉀溶液中，邊注入邊充分攪拌，并用無氨水稀釋至400 mL，然后靜置過夜。最后將該溶液的上清液轉(zhuǎn)移至聚乙烯塑料瓶中，常溫避光保存。

格里斯試劑配制：對氨基苯磺酸0.5 g，溶入150 mL 10%醋酸溶液中，得到溶液I；稱取α-萘胺0.1 g，加入50 mL去離子水中，煮沸，再緩緩加入150 mL 10%醋酸溶液，得到溶液II。溶液I和溶液II分別保存在棕色瓶中，待用。

1.2 培養(yǎng)基組成

氨氮降解菌富集培養(yǎng)基[11]組成：(NH4)2SO4，2 g/L；NaCl，0.3 g/L；FeSO4·7H2O，0.03 g/L；K2HPO4，1 g/L ； MgSO4·7H2O，0.03 g/L；NaHCO3，1.6 g/L；H2O，1 L；pH，7.2。121℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基配制時加入瓊脂粉(15 g/L)，半固體培養(yǎng)基配制時加入瓊脂粉(3 g/L)。

1.3 實驗方法

1.3.1 氨氮測定

氨氮測定采用納氏試劑分光光度法(國標法，HJ 535—2009)。測定步驟：首先配制一系列濃度的銨標準使用液各50 mL，再分別加入1.0 mL酒石酸鉀鈉溶液和1.5 mL的納氏試劑，在425 nm處測定吸光度，并繪制標準曲線。吸取適量水樣，定容到50 mL，分別加入酒石酸鉀鈉溶液(1.0 mL)和納氏試劑(1.5 mL)，在425 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線，計算出水樣中氨氮濃度。

1.3.2 氨氮降解菌富集及分離

取10 mL活性污泥加入到盛有200 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃條件下振蕩(160 r/min)培養(yǎng)，每隔1 d取培養(yǎng)液，用格里斯試劑檢驗亞硝酸鹽的生成情況，根據(jù)紅色深淺判斷氨氮降解菌的繁殖情況。培養(yǎng)7 d后取10 mL富集培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新鮮的200 mL富集培養(yǎng)基中，重復上述操作3次。

取富集3次后的培養(yǎng)液0.03 mL劃線培養(yǎng)到固體平板培養(yǎng)基上，30℃條件下靜置培養(yǎng)7 d, 分別取其中的單菌落重復劃線培養(yǎng)3次，將純化得到的12個單菌落分別保存到半固體氨氮降解菌富集培養(yǎng)基中，待用。

1.3.3 高效氨氮降解菌的篩選及其生理生化、生長曲線測定

對上述純化得到的12個單菌落分別用富集液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每隔1 d取培養(yǎng)液用格里斯試劑檢驗，根據(jù)顏色深淺比較不同菌株的氨氮降解能力，選取顏色變化最深的菌株并將該菌株命名為AN-1，菌株AN-1即為氨氮降解能力最強的菌。然后對菌株AN-1的生理生化性質(zhì)進行測定，包括革蘭氏染色、接觸酶、氧化酶、V.P實驗、硝酸鹽、亞硝酸鹽利用等進行測定，操作方法見文獻[12]。

生長曲線測定：用液體富集培養(yǎng)基對菌株AN-1進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基pH為7，培養(yǎng)溫度為30℃，振蕩培養(yǎng)(160 r/min)，每隔1 d 測定培養(yǎng)液吸光度(OD560)，作出時間～吸光度曲線。

1.3.4 不同條件對氨氮降解能力的影響測定

1) 不同pH條件對氨氮降解能力的影響

將菌株AN-1接種到液體富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d， 分別取富集培養(yǎng)液5 mL接種到 pH分別為6.0、7.0、8.0和9.0的195 mL富集培養(yǎng)基中，30℃條件下振蕩培養(yǎng)(160 r/min)， 培養(yǎng)5 d后測定培養(yǎng)液中剩余氨氮含量，求出氨氮降解率。

2) 不同溫度條件對氨氮降解能力的影響

取1.3.4(1)中富集培養(yǎng)液5 mL接種到195 mL富集培養(yǎng)基中，分別在10、20、30和40℃條件下振蕩(160 r/min)培養(yǎng)5 d，測定培養(yǎng)液中剩余氨氮含量，求出氨氮降解率。

1.3.5 菌株AN-1的系統(tǒng)分類位置確定

1) DNA提取

菌株AN-1 DNA的提取采用柱式基因組抽提試劑盒(生工生物工程公司(上海)股份有限公司UNIQ-10)，提取方法按試劑盒說明書。

2) PCR對菌株16S rDNA 的擴增

PCR擴增引物采用細菌16S rDNA通用引物[13]，引物序列：

正向引物7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；

反向引物1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。

3) PCR反應體系以及反應條件

PCR反應體系(25 μL)：2.5 μL 5×Buffer(含Mg2+)，0.5 μL模板DNA，各0.5μL 7F(10 uM)和1540R(10 uM)，1μL dNTP(各2.5 mM)，超純水定容至25 μL。PCR反應條件：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性25 s，55 ℃退火25 s，72 ℃延伸1 min， 30個循環(huán)，再72℃延伸10 min，PCR擴增的序列由上海生工生物工程公司進行測序。

4) 系統(tǒng)樹的創(chuàng)建

將測得的16S rDNA序列發(fā)送到DDBJ (DNA Data Bank of Japan, http://www.ddbj.nig.ac.jp/)數(shù)據(jù)庫中的Blast中進行比對，利用CustalX2.1和Mega5.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟件創(chuàng)建系統(tǒng)樹，采用的方法為鄰接法(Neighbor-Joining)[14-17]。

2 結果

2.1 菌株的分離和篩選

首先利用格里斯試劑對富集培養(yǎng)液進行初步檢測，篩選具有降解氨氮能力的菌株。然后對菌株進行多次馴化培養(yǎng)，最后用線培養(yǎng)法進行分離，共分離培養(yǎng)得到12株氨氮降解菌，從中選取氨氮降解能力最強的菌株AN-1為代表菌株，用于后面的實驗。

2.2 生理生化

菌株AN-1在固體平板培養(yǎng)基上生長時，其菌落為乳白色圓形，表面濕潤光滑，顯微鏡觀察該菌為桿狀(圖1)。根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對氨氮降解菌AN-1的形態(tài)特征、生理生化特征等進行了鑒定,結果如表1所示。

2.3 菌株AN-1生長曲線測定

將菌株AN-1在液體培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)，每隔1 d測定培養(yǎng)液的吸光度(OD560)，作成如圖2所示的生長曲線。從圖2可以看出，菌株AN-1的停滯期較短，經(jīng)過24 h左右的培養(yǎng)后便進入了對數(shù)增長期。在培養(yǎng)到72 h時生物量達到最大，在此后的培養(yǎng)過程中，生物量基本保持不變。

圖1 氨氮降解菌株AN-1分離、純化菌落

鑒定指標菌株AN-1革蘭氏染色(Gram-stain)—接觸酶(Catalase)+氧化酶(Oxidase)+乙酰甲基甲醇(V.P.)實驗(Voges-Proskauerreaction)—硝酸鹽還原(Nitratesreducedtonitrites)—亞硝酸鹽還原(Nitritesreducedtonitrites)+葡萄糖(Glucose)+淀粉水解(Amylase)—

注：“+”：陽性或有反應；“-”：陰性或沒反應

2.4 不同pH條件下的氨氮去除率

將菌株AN-1分別接種到pH為6.0、7.0、8.0和9.0的培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)到5 d時，測定培養(yǎng)液中剩余氨氮含量，分別求出氨氮降解率，作出pH～氨氮降解率曲線，如圖3所示。可以看出，菌株AN-1 在pH 8.0左右表現(xiàn)出最高的氨氮降解率，為78%。pH為9.0的培養(yǎng)基中生長時，菌株AN-1的降解率僅有47%，pH為6.0時的氨氮降解率為50%。由此可見，菌株AN-1的氨氮降解最適pH值在8.0左右，pH過高和過低都不利于氨氮降解。

圖2 菌株AN-1生長曲線

圖3 菌株AN-1在不同pH條件下的氨氮去除率

2.5 不同溫度條件下的氨氮去除率

分別在10、20、30和40 ℃條件對菌株AN-1進行振蕩(160 r/min)培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)基pH均為8.0，每隔1 d測定培養(yǎng)液中氨氮含量，求出氨氮去除率并作不同溫度條件下的培養(yǎng)時間～氨氮去除率曲線，如圖4所示。從圖4可以看出，菌株AN-1在30℃培養(yǎng)時，氨氮去除率最高，達77%。10℃條件下培養(yǎng)，其氨氮去除率僅為20%，40℃培養(yǎng)條件下的氨氮去除率為25%，稍高于10℃培養(yǎng)條件下的氨氮去除率?？梢钥闯觯闍N-1適宜生長的溫度為30℃左右，溫度過高或過低，都會降低其氨氮去除率。

圖4 培養(yǎng)溫度對菌株AN-1氨氮去除率影響

2.6 氨氮降解菌系統(tǒng)分類位置

經(jīng)過序列測定，菌株AN-1 的16S rRNA的基因片段為1398 bp。通過數(shù)據(jù)庫DDBJ(DNA Data Bank of Japan, http://www.ddbj.nig.ac.jp/)，獲得菌株AN-1的登錄號為AB917468。在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)中，選取與菌株AN-1 16S rRNA序列同源性較高的基因序列，利用軟件CustalX2.1和Mega5.0 創(chuàng)建系統(tǒng)樹(圖5)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫對菌株AN-1的16 S rRNA序列進行同源性分析，結果表明菌株AN-1與Shinellakummerowiae(EF070131)相似度最高，為96%。結合菌株AN-1在系統(tǒng)樹中的位置，可以判斷菌株AN-1屬于申氏桿菌屬,并初步命名為Shinellasp. AN-1(AB917468)。

圖5 菌株AN-1(AB917468)與申氏桿菌屬(Shinella)中近緣菌株16S rDNA序列的無根系統(tǒng)發(fā)育樹(采用方法為緊鄰法)

3 討論

本研究篩選得到的申氏桿菌Shinellasp. AN-1(AB917468)具有較強的去除水體中氨氮的能力，氨氮去除率為78%，為高氨氮廢水如養(yǎng)殖廢水中去除氨氮提供了新的菌種資源。但要應用到實際的氨氮廢水處理中，還需要對具體的環(huán)境因素進行分析。另外，如果對菌株AN-1進行新菌種鑒定還需要進行DNA-DNA雜交，DNA G+C含量測定、脂肪酸組成分析等工作。

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(責任編輯：呂海亮)

Isolation of an Ammonia-nitrogen Degrading Bacterium and Its Removal Capability

LIU Yaqiao, HAN Xuejun, TAN Haochen, LU Hongsheng

(College of Chemical and Environmental Engineering, Shandong University of Science and Technology, Qingdao, Shandong 266590, China)

The objective of this study is to isolate and identify the bacteria with high ammonia-nitrogen degrading capability degrading and to apply the bacteria to wastewater denitrification treatment. 12 strains of ammonia-nitrogen degrading bacteria were isolated from activated sludge and the bacterium with the highest ammonia-nitrogen degrading capability (strain AN-1) was selected and its morphology, biochemical properties, phylogenetic position and ammonia-nitrogen degrading capability under different conditions were examined. The results indicate that strain AN-1 is a Gram-negative, rhabditiform bacterium, whose colony is milk white, and both its catalase and oxidase are positive. Strain AN-1 has the optimum ammonia-nitrogen degradation effect when the temperature is 30 ℃ and the pH value is 8.0. Its maximum removal rate can reach 78%. The 16S rDNA sequence of strain AN-1shows the highest similarity of 95% with its closely related bacteria ofShinellazoogloeoides(GU930756). It is thus concluded that strain AN-1, with high ammonia-nitrogen degrading capability, is one member of genusShinella.

ammonia-nitrogen degrading bacterium; genusShinella; activated sludge; isolation

2016-11-02

山東省博士后基金項目(20101008);山東省博士后創(chuàng)新基金項目(201201008)

劉亞樵(1991—)，女，山東濟寧人，碩士研究生，主要從事污水處理研究. 陸洪省(1972—)，男，山東沂水人，副教授，博士，主要從事污水處理以及土壤環(huán)境修復研究，本文通信作者.E-mail：hslu628@163.com

X172

A

1672-3767(2017)02-0070-06