微波水熱法降解殼聚糖的研究

武泰恒, 邵 謙, 趙雯麗

(山東科技大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山東 青島 266590)

微波水熱法降解殼聚糖的研究

武泰恒, 邵 謙, 趙雯麗

(山東科技大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山東 青島 266590)

在H2O2和α-淀粉酶存在的條件下，使用微波水熱法，在低濃度醋酸溶液中快速降解殼聚糖。研究了醋酸濃度、H2O2和α-淀粉酶用量以及微波水熱時(shí)間對(duì)殼聚糖降解的影響，并利用FTIR對(duì)降解的殼聚糖進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，在V(H2O2):m(殼聚糖) =2 mL/g，m(殼聚糖):m(α-淀粉酶)=3的條件下，40 ℃微波水熱反應(yīng)40 min，即可使殼聚糖粘均分子量下降99.8 %以上，而用普通水熱法達(dá)到相同分子量則需約9 h，微波水熱法大大提高了降解殼聚糖的效率，同時(shí)不破壞殼聚糖本身的結(jié)構(gòu)，是一種高效環(huán)保的殼聚糖降解方法。

殼聚糖；微波水熱；降解；H2O2；α-淀粉酶

殼聚糖 (chitosan) 又被稱作脫乙酰甲殼素，是由自然界中相當(dāng)普遍的幾丁質(zhì) (chitin) 脫乙酰化而得到的，化學(xué)名稱為聚葡萄糖胺 (1-4)- 2- 氨基-B-D 葡萄糖。自1859年法國人Rouget第一次得到殼聚糖，這類高分子的生物安全性、官能性、微生物降解性、血液相容性等良好的性能就被很多行業(yè)廣泛關(guān)注[1]，近年來，在食品、醫(yī)療、化妝品、化學(xué)化工、污水處理、貴重金屬回收、生物工程等方面的應(yīng)用獲得了突破性進(jìn)展[2-4]。然而，殼聚糖的分子量從幾十萬到幾百萬甚至上千萬不等，且分子間和分子內(nèi)部存在著大量氫鍵，因而不易溶于水及一些普通的溶劑，而且難以被人體吸收利用，限制了殼聚糖的應(yīng)用。

低聚殼聚糖是殼聚糖降解后的產(chǎn)物，有較高的溶解度，易被吸收利用。近些年來，隨著研究的深入，低聚殼聚糖展現(xiàn)出了獨(dú)特的生理活性和功能，如抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和生長、具有明顯的抗菌抑菌效果、降低血脂含量以及膽固醇含量、提高巨噬細(xì)胞的功能、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、活化植物細(xì)胞促進(jìn)植物生長以及具有顯著的保濕能力等[5]。目前，針對(duì)殼聚糖的降解方法大致可以劃分為酸降解法、氧化降解法以及酶降解法，還有通過這三種方法結(jié)合而衍生出來的一些切合實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的復(fù)合降解法。酸降解法通常使用強(qiáng)酸作為降解劑，并通過提高酸的濃度來提高降解效率，這種降解方法不僅不好控制并且會(huì)導(dǎo)致一系列環(huán)境問題。氧化降解法通常使用強(qiáng)的氧化劑，會(huì)破壞殼聚糖的官能團(tuán)如羧基、氨基，甚至?xí)淖儦ぞ厶堑幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)[6]，所以很少被廣泛使用。而過氧化氫容易控制、環(huán)境友好[7-8]，同時(shí)產(chǎn)生的自由基能夠攻擊糖單元間的β- (1,4) 糖苷鍵而導(dǎo)致殼聚糖降解，保持殼聚糖原有的由2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖單元和2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖單元組成的共聚體化學(xué)結(jié)構(gòu)。但是使用H2O2降解殼聚糖的降解效率較低，所以一般很少單獨(dú)使用[9]。酶降解法具有眾多優(yōu)點(diǎn)，例如溫和的反應(yīng)條件、特異性高、不改變殼聚糖結(jié)構(gòu)等[10]，但是特異性酶成本較高，不利于商業(yè)應(yīng)用和大批量生產(chǎn)低聚殼聚糖。

本研究結(jié)合了H2O2和酶降解法環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)，在低醋酸濃度(1%V/V)下用H2O2和價(jià)格低廉的α-淀粉酶降解殼聚糖，采用微波水熱法將反應(yīng)體系置于微波反應(yīng)釜中進(jìn)行降解，降解40 min即可使殼聚糖粘均分子量下降99 %以上，大大提高了降解效率。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

主要儀器：XH-800S微波水熱反應(yīng)儀 (中國北京)，烏氏粘度計(jì) (中國沈陽)，DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器 (中國上海)，Nicolet-380傅里葉變換紅外分析儀 (美國)。

實(shí)驗(yàn)試劑：殼聚糖 (生物純，BR，粘均分子量3.1×107Da)，過氧化氫 (分析純，AR)，α-淀粉酶 (生物純，BR)。

1.2 水熱法降解殼聚糖

向三口燒瓶中加入3 g殼聚糖和300 mL濃度為2 % (V/V)醋酸溶液，同時(shí)開動(dòng)攪拌和加熱，設(shè)定水浴溫度為40 ℃，當(dāng)殼聚糖完全溶于醋酸溶液中時(shí)，使用恒壓滴液漏斗逐滴緩慢滴加6 mL的H2O2，并緩慢加入1 g α-淀粉酶，直至全部溶解。然后恒溫反應(yīng)7 h。反應(yīng)結(jié)束后，將所得溶液烘干，得到深棕色固體，將該固體研磨成粉末狀，即為殼聚糖降解后的產(chǎn)物。測(cè)定其脫乙酰度和粘均分子量。

1.3 微波水熱法降解殼聚糖

向三口燒瓶中加入3 g殼聚糖和300 mL濃度為1 % (V/V)醋酸溶液，并按1.2中的方法加入H2O2和α-淀粉酶直至完全溶解。然后將溶液倒入微波水熱反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜置于微波水熱儀中，于800 W、40 ℃下分別反應(yīng)40、60、90、180 min。將所得溶液烘干，得到深棕色固體，將該固體研磨成粉末狀，即為殼聚糖降解后的產(chǎn)物。測(cè)定其脫乙酰度和粘均分子量。

1.4 殼聚糖脫乙酰度的測(cè)量

用傅立葉變換紅外光譜儀在 4 000～400 cm-1的范圍內(nèi)掃描降解過后的殼聚糖，所有掃描都在室溫下進(jìn)行。殼聚糖脫乙酰度按照 Baxter方法計(jì)算[11]。

A1320/A1420=0.382 2+0.031 3 (100-DD%)。

(1)

其中：DD為脫乙酰度，A1320為殼聚糖在1 320 cm-1處的吸收峰，A1 420為殼聚糖在1 420 cm-1處的吸收峰。

1.5 殼聚糖粘均分子量的測(cè)定

測(cè)定高聚物分子量的方法有很多，其中黏度法設(shè)備簡單且操作方便，并有很好的實(shí)驗(yàn)精度，是常用的測(cè)量高聚物平均分子質(zhì)量的方法。粘均分子量(MV) 采用烏氏粘度計(jì)測(cè)定[12]。將殼聚糖樣品溶于 0.2 mol/L 的 CH3COOH/CH3COONa 緩沖溶液中，通過烏式粘度計(jì)在溫度 (25±0.5) ℃下測(cè)得流出時(shí)間 (ts) 和溶劑的流出時(shí)間 (t0)。其中，特性粘度 [η] 通過以下公式計(jì)算：

(2)

(3)

ηsp=ηr-1。

(4)

其中：ηr為相對(duì)粘度，ηsp為增比粘度，c為殼聚糖溶液的濃度。

根據(jù)特性粘度[η]，粘均分子量MV可以利用Mark-Houwink方程式[13]求得。

(5)

其中，K= 1.64×10-30×DD14。

(6)

α= -1.02×10-2×DD+1.82。

(7)

圖1 殼聚糖降解前后的FTIR光譜

圖2 醋酸濃度c與殼聚糖溶液特性粘度[η]的關(guān)系圖

式中DD為殼聚糖脫乙酰度的百分比表示形式[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 FTIR光譜分析

未降解的殼聚糖和降解后的殼聚糖FTIR光譜如圖1所示。在>3 000 cm-1處是殼聚糖—OH 和—NH—的一個(gè)強(qiáng)的伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 656 cm-1處是—NH2中的N—H彎曲振動(dòng)峰和酰胺Ⅰ帶吸收峰[15]，1 320 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是N-乙酰氨基葡萄糖特征峰[11]，1 420 cm-1處出現(xiàn)的峰是酰胺Ⅲ帶吸收峰[15]。從圖中可見，降解前后殼聚糖的FTIR譜圖十分相似，不同分子量的殼聚糖的紅外吸收峰的位置一致，峰的相對(duì)強(qiáng)弱略微有所不同，但基本保持一致，這表明降解前后殼聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)沒有明顯改變，降解反應(yīng)主要發(fā)生在糖單元間的β-(1, 4) 糖苷鍵的斷裂。

2.2 醋酸濃度對(duì)殼聚糖降解的影響

圖3 R與殼聚糖特性黏度[η]的關(guān)系圖

圖4 殼聚糖與α-淀粉酶質(zhì)量比與殼聚糖特性粘度[η]的關(guān)系圖

2.3 H2O2用量對(duì)殼聚糖降解的影響

圖3為殼聚糖溶液的特性粘度隨溶液中H2O2用量變化的關(guān)系曲線，其中R(mL·g-1)為H2O2體積與殼聚糖質(zhì)量之比。從圖中可見隨著H2O2用量的增加，特性粘度先減少后上升，在R為2.00～2.50范圍內(nèi)溶液的特性粘度可以達(dá)到最低。這是因?yàn)樵贖2O2降解殼聚糖的過程中，H2O2在溶液中分解形成的HO2·、HO·以及(O)等游離基團(tuán)的量會(huì)增加，如式(8)、(9)和(10)所示[6]。

H2O2→ H++ HOO-

(8)

HOO-→ OH-+ (O)

(9)

H2O2+HOO-→ HO· + O2-· + H2O

(10)

2.4 α-淀粉酶用量對(duì)殼聚糖降解的影響

圖4為殼聚糖在不同α-淀粉酶用量的溶液中降解后的特性粘度曲線。結(jié)果表明，隨著α-淀粉酶用量的增加，殼聚糖的特性粘度逐漸減少，這表明α-淀粉酶的加入對(duì)殼聚糖的降解有明顯的促進(jìn)作用。2 %(V/V)醋酸溶液提供了殼聚糖降解的均相反應(yīng)條件，而H2O2的存在又提供了氧化能力極強(qiáng)的HO·以及新生態(tài)的 (O)等游離基團(tuán)，α-淀粉酶的加入，能夠進(jìn)一步使殼聚糖的β-(1,4) 糖苷鍵水解，解決了單純使用H2O2容易導(dǎo)致褐變反應(yīng)的問題，能明顯加快降解速度，同時(shí)使得到的殼聚糖產(chǎn)物保持更好的生物活性和更窄的平均分子量分布[5]。因此醋酸、H2O2和α-淀粉酶相互協(xié)同降解殼聚糖，降解效果明顯高于單一降解法。然而隨著殼聚糖的降解，當(dāng)特性粘度下降到1.0時(shí)，m(殼聚糖):m(α-淀粉酶)=3.0，殼聚糖粘均分子量已經(jīng)下降了95.48%，此時(shí)再加入更多的α-淀粉酶對(duì)殼聚糖降解的影響越來越小，同時(shí)考慮到成本因素，所以選擇適宜α-淀粉酶的用量為m(殼聚糖):m(α-淀粉酶)=3.0。

2.5 微波水熱時(shí)間對(duì)殼聚糖降解的影響

在上述確定的普通水熱法降解殼聚糖的適宜條件下，對(duì)殼聚糖降解的時(shí)間不同，根據(jù)公式 (1) 測(cè)得的樣品的脫乙酰度DD均在80 %左右，同時(shí)計(jì)算得出降解不同時(shí)間殼聚糖的粘均分子量如表1所列。由表1可見降解7 h后，殼聚糖分子量才從31 000 kDa下降到約1 400 kDa，降解速率比較慢。為提高降解效率，在上述優(yōu)選出來的降解反應(yīng)體系條件下，采用微波水熱法替代普通水熱法，仍然在40℃下對(duì)殼聚糖進(jìn)行降解，不同時(shí)間下得到的殼聚糖粘均分子量如表2所示。

表1 不同普通水熱降解時(shí)間下的殼聚糖的粘均分子量

表2 不同微波水熱降解時(shí)間下殼聚糖的粘均分子量

由表2可見，采用微波水熱法降解殼聚糖，相比于普通水熱法，在相同的反應(yīng)體系與溫度條件下，微波水熱降解40 min效果與傳統(tǒng)水熱9 h的降解效果相當(dāng)，即殼聚糖粘均分子量下降99.8 %以上。微波水熱降解180 min后，殼聚糖粘均分子量從3.1×107Da 下降到2.4×104Da，大大提高了降解效率，縮短降解時(shí)間，并且降解后殼聚糖的脫乙酰度沒有明顯變化，均在80 %左右。

3 結(jié)論

使用微波水熱法，協(xié)同H2O2與α-淀粉酶在40℃下對(duì)殼聚糖進(jìn)行降解，降解40 min的效果即與普通水熱法降解9 h的相當(dāng)，降解時(shí)間大大縮短，有效提高了降解效率。FTIR光譜分析表明降解后的殼聚糖化學(xué)結(jié)構(gòu)沒有明顯的改變，并且脫乙酰度也基本未變，是一種高效環(huán)保的殼聚糖降解方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

[1]HUANG Y C,WU Y,HUANG W C,et al. Degradation of chitosan by hydrodynamic cavitation[J].Polymer Degradation and Stability,2012,98(1):37-43.

[2]LAYEK B,SINGH J. Chitosan for DNA and gene therapy[J].Chitosan Based Biomaterials,2017(2):209-244.

[3]SALEHI E,DARAEI P,SHAMSABADIA A.A review on chitosan-based adsorptive membranes[J].Carbohydrate Polymers,2016,152(5):419-432.

[4]SIONKOWSKA A,KACZMAREK B,GADZALA-KOPCIUCH R.Gentamicin release from chitosan and collagen composites[J].Journal of Drug Delivery Science & Technology,2016,35:353-359.

[5]韓永萍,林強(qiáng).殼聚糖降解制備低聚殼聚糖和殼寡糖的研究進(jìn)展[J].食品科技,2006,7(4):35-38. HAN Yongping,LIN Qiang.Progress of study on preparation of oligochitosan and chitobiose by degrading chitosan[J].Food Science and Technology,2006,7(4):35-38.

[6]QIN C Q,DU Y M,XIAO L.Effect of hydrogen peroxide treatment on themolecular weight and structure of chitosan[J].Polymer Degradation & Stability,2002,76(2):211-218.

[7]WU T,WU C,XIANG Y,et al.Kinetics and mechanism of degradation of chitosan by combining sonolysis with H2O2/ascorbic acid[J].RSC Advances,2016,6(80):76280-76287.

[8]姚邦濤,陳繼偉.過氧化氫氧化降解法制備水溶性殼聚糖工藝的研究[J].造紙科學(xué)與技術(shù),2015,34(6):60-62. YAO Bangtao,CHEN Jiwei.Study on the preparation of soluble chitosan through the chitosan degraded by hydrogen peroxide[J].Paper Science& Technology,2015,34(6):60-62.

[9]歐春艷,李林通.殼聚糖降解研究的最新進(jìn)展[J].廣州化工,2013,41(6):13-15. OU Chunyan,LI Lintong.Recent progress of study on degradation of chitosan[J].Guangzhou Chemical Industry,2013,41(6):13-15.

[10]LAFFLEUR F,HINTZEN F,RAHMAT D,et al.Enzymatic degradation of thiolated chitosan[J].Drug Development and Industrial Pharmacy,2013,39(10):1531-1539.

[11]BRUGNEROTTO J,LIZARDI J,GOYCOOLEA F M,et al.An infrared investigation in relation with chitin and chitosan characterization[J].Polymer,2001,42:3569-3580.

[12]CHEN R H,HUA H D.Effect of molecular weight of chitosan with the same degree of deacetylation on the thermal,mechanical,and permeability properties of the prepared membrane[J].Carbohydrate Polymers,1996,29(4):353-358.

[13]LU F L,CAO Z S,WANG C,et al.Preparation of low-molecular-weight chitosans[J].Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics,1997,18(4):178-179.

[14]WANG W,BO S,LI S,et al.Determination of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degrees of deacetylation[J].International Journal of Biological Macromolecules,1991,13(5):281-285.

[15]WANG W P,DU Y M,QIU Y L,et al.A new green technology for direct production of low molecular weight chitosan[J].Carbohydrate Polymers,2008,74:127 -132.

[16]覃彩芹,肖玲,杜予民,等.過氧化氫氧化降解殼聚糖的可控性研究[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào),2000,46(2):196-198. TAN Caiqin,XIAO Ling,DU Yumin,et al.Prediction and control of extent of deploymerization of chitosan by hydroperoxide[J].Wuhan University Journal of Natural Sciences,2000,46(2):196 -198.

[17]黃群增,王世銘,王瓊生.UV/H2O2降解殼聚糖的研究[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,20(4):63-67. HUANG Qunzeng,WANG Shiming,WANG Qiongsheng.Study on degradation of chitosan with UV/H2O2[J].Journal of Fujuan Normal University (Natural Science Edition),2004,20(4):63 -67.

(責(zé)任編輯：呂海亮)

Microwave Hydrothermal Degradation of Chitosan

WU Taiheng, SHAO Qian, ZHAO Wenli

(College of Chemical and Environmental Engineering, Shandong University of Science and Technology, Qingdao, Shandong 266590, China)

A novel method of degradation of chitosan was investigated by using microwave hydrothermal method in the presence of H2O2and α-amylase with dilute acetic acid solution as solvent. The effects of the concentration of acetic acid, the dosage of H2O2and α-amylase, and the time of microwave hydrothermal on the degradation of chitosan were evaluated. And the structure of the degraded product was characterized by FTIR(Fourier Transform Infrared Spectroscopy). The results show that with the microwave hydrothermal method, the viscosity-average molecular weight of chitosan can decrease by more than 99.8% after 40 minutes’ reaction at 40℃ under the condition ofV(H2O2):m(chitosan)=2 mL/g andm(chitosan):m(α-amylase)=3, while it takes 9 hours to get the same degree of degradation with the traditional hydrothermal method. Therefore, the microwave hydrothermal method, which greatly improves the efficiency of the degradation of chitosan without changing the main macromolecular structure of chitosan, is a high efficient and environmentally friendly degradation method.

chitosan; microwave hydrothermal method; degradation; H2O2; α-amylase

2016-04-17

山東科技大學(xué)優(yōu)秀教學(xué)團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(JXTD20160510)

武泰恒(1991—)，男，山東濟(jì)南人，碩士研究生，主要從事應(yīng)用化學(xué)研究. 邵 謙(1964—)，女，浙江寧波人，教授，博士，主要從事應(yīng)用化學(xué)研究， 本文通信作者. E-mail: shaoqian01@163.com

O636.1

A

1672-3767(2017)02-0081-06