BH3類似物促細(xì)胞凋亡機制及臨床研究進(jìn)展

張 岳，張伊佳，李學(xué)軍

（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，北京 100191）

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BH3類似物促細(xì)胞凋亡機制及臨床研究進(jìn)展

張 岳＊，張伊佳＊，李學(xué)軍

（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，北京 100191）

李學(xué)軍，現(xiàn)任北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系教授，博士生導(dǎo)師。曾任北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院副院長和藥理系主任等?，F(xiàn)兼任中國藥理學(xué)會副理事長，生化與分子藥理專業(yè)委員會主任委員和世界中聯(lián)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)會副會長，科技部、北京市科委、國家人事部世紀(jì)人才及國家自然科學(xué)基金委評審專家。研究方向為分子藥理學(xué)。研究課題包括藥物靶點的確認(rèn)和新藥發(fā)現(xiàn)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、水通道的生物學(xué)研究和新藥發(fā)現(xiàn)以及抗腫瘤藥物、心血管系統(tǒng)藥物等藥理學(xué)研究。已培養(yǎng)碩士、博士研究生40余人，發(fā)表SCI收錄文章80余篇。獲科技部重大專項、國家自然科學(xué)基金重大國際合作項目等10余項課題。曾獲國家教育部科技進(jìn)步獎、五洲女子科技獎和中國科協(xié)優(yōu)秀科技工作者等。

靶向細(xì)胞凋亡是目前癌癥治療中最具發(fā)展前景的治療方法之一。BCL-2家族的BH3-only蛋白（僅含BCL-2同源結(jié)構(gòu)域BH3）可以通過與家族中促存活蛋白結(jié)合，使促存活蛋白失效，從而使促凋亡成員發(fā)揮作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生程序性凋亡。BH3類似物即一類可以模仿BH3-only蛋白并誘發(fā)細(xì)胞凋亡的小分子化合物。BH3類似物的原型ABT-737可以選擇性靶向BCL-XL、BCL-2和BCL-W 3個促存活蛋白（但不能作用于髓細(xì)胞白血病因子-1蛋白或A1蛋白），而它的衍生物ABT-263（navitoclax）在臨床試驗中有顯著的促凋亡與抗腫瘤效應(yīng)。現(xiàn)階段，一些推測為BH3類似物的藥物已經(jīng)進(jìn)入了臨床階段，但很大一部分仍在進(jìn)行特征鑒定。本文在概述BH3-only蛋白作用機制的基礎(chǔ)上，綜述了多種已經(jīng)廣泛認(rèn)可的BH3類似物及正在研究當(dāng)中的最新BH3類似物。

抗腫瘤藥；BH3類似物；BCL-2蛋白；BH3-only蛋白

促進(jìn)細(xì)胞的程序性死亡是避免腫瘤細(xì)胞無限制生長的重要途徑，而這也為對抗癌癥提供了新的思路。這一思路引發(fā)了針對細(xì)胞凋亡抗癌癥策略的研究，例如抑制惡性腫瘤中存活因子的過度表達(dá)。在這些存活因子中，B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lym?phoma-2，BCL-2）家族吸引了眾多關(guān)注。

BCL-2家族蛋白是目前被廣泛認(rèn)可的與細(xì)胞存活和凋亡相關(guān)的關(guān)鍵蛋白。其中，BH3-only蛋白（BCL-2 homology domain only proteins，因只含BH3結(jié)構(gòu)域而得名）可以直接拮抗促存活蛋白對促凋亡蛋白的限制作用，從而使促凋亡蛋白發(fā)揮促凋亡作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的一類特異蛋白。由于BH3-only蛋白很難通過現(xiàn)有技術(shù)直接得到，因此人們想到可以用模擬BH3-only蛋白的小分子化合物來促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，這一類小分子化合物即稱為“BH3類似物”。本文主要對目前BH3類似物的種類及相應(yīng)的促細(xì)胞凋亡機制和臨床抗腫瘤研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 BCL-2家族蛋白及BH3類似物促進(jìn)細(xì)胞凋亡機制

BCL-2家族蛋白（含有4個BCL-2同源結(jié)構(gòu)域BH1～BH4中的至少1個）是細(xì)胞存活與凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，這已在有關(guān)科學(xué)研究領(lǐng)域達(dá)成了廣泛共識。BCL-2家族蛋白的主要功能為控制線粒體膜通透性，并可以使細(xì)胞色素c等基因性細(xì)胞凋亡因子釋放入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，從而級聯(lián)激活胱天蛋白酶［1］。家族中促存活蛋白，如BCL-2，BCL-XL，BCL-W，髓細(xì)胞白血病因子-1（myeloid cell leukemia-1，MCL-1）和A1的功能性活化可以隔絕促凋亡蛋白BAX和BAK，而這2種蛋白正是線粒體膜通透性增加的執(zhí)行分子。所有的促存活蛋白都可以隔離BAX，但只有BCL-XL和MCL-1可與BAK結(jié)合。這些促存活蛋白的抗凋亡作用可以被BH3-only成員拮抗，BH3-only蛋白如NOXA，BAD和BIM通過置換將它們的α-螺旋BH3結(jié)構(gòu)域插入促存活蛋白的疏水凹槽中，導(dǎo)致被隔離的BAX和BAK釋放和間接活化。這樣的相互作用具有選擇性。NOXA只與MCL-1和A1結(jié)合，BAD只與BCL-2，BCL-XL和BCL-W結(jié)合，而BIM可與全部5種促存活蛋白結(jié)合［1］。例如，El?gendy等［2］證實，傳統(tǒng)的BH3-only蛋白（NOXA）可以通過使促存活蛋白MCL-1失效來誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬。除了與促存活蛋白結(jié)合，BH3-only蛋白還存在一個直接的活化模式，即特定的“活化劑”BH3-only蛋白（BIM和tBID）結(jié)合并活化BAX和BAK。在這個模式中，“活化劑”蛋白被促存活蛋白隔離，而后者與“激活劑”BH3-only蛋白（BAD和NOXA）的互動（通過競爭性置換）引發(fā)“活化劑”蛋白的釋放［1］。無論在哪一種模式中，BH3-only蛋白與促存活分子的結(jié)合都會導(dǎo)致BAX/BAK的活化。

通過以上信息可以界定“BH3類似物”的概念［3］，即小分子物質(zhì)（非肽類物質(zhì)或者來源于BH3結(jié)構(gòu)域的物質(zhì)）通過將它們的BH3結(jié)構(gòu)域插入BCL-2促存活蛋白的疏水凹槽中，抑制它們的功能活性，引發(fā)細(xì)胞凋亡而模仿BH3-only蛋白的作用［3］。在實際應(yīng)用過程中，BH3類似物的概念已經(jīng)成為生成抗癌藥物不可或缺的重要信息。在已經(jīng)人工合成的大量化合物中，ABT-737是一個很好的BH3類似物實際應(yīng)用實例［4］，它與BCL-2，BCL-XL和BCL-W有很高的親和力（納摩爾級），但不與MCL-1或A1作用；ABT-737及其衍生物ABT-263（navito?clax）可在離體條件下引發(fā)BAX/BAK-依賴的細(xì)胞凋亡，并在動物模型中產(chǎn)生抗癌效果［5-6］。然而，BH3類似物在發(fā)展過程中也遇到很大的障礙，目前發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)化合物不能完全滿足一個標(biāo)準(zhǔn)BH3類似物的主要條件，即由Lessene等［7］提出的“與BCL-2促存活蛋白的高度親和誘導(dǎo)AX/BAK依賴的細(xì)胞凋亡”。由于出現(xiàn)脫靶效應(yīng)，這些化合物只被推定為BH3類似物?？紤]到MCL-1是在一系列惡性腫瘤和藥物抗性中出現(xiàn)的一個有爭議的促存活因子，識別MCL-1特異的BH3類似物成為當(dāng)務(wù)之急［8-9］。最新研究進(jìn)展已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種能與MCL-1有效結(jié)合的化合物。從開始時的棉子酚家族化合物及其衍生物（低于納摩爾級結(jié)合），到最新研究發(fā)現(xiàn)的BIM SAHB和MIM1（毫摩爾級結(jié)合），使人們看到了與MCL-1結(jié)合的BH3類似物的發(fā)展前景。

2 BH3-only蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機制

BCL-2調(diào)節(jié)的細(xì)胞凋亡通路是由BH3-only蛋白對上游信號做出回應(yīng)而改變的。一些BH3-only蛋白（主要是BIM，tBID，PUMA）通過直接結(jié)合的方式激活BAX/BAK。另外，所有的BH3-only蛋白可以間接激活BAX/BAK，同時抑制BCL-2促存活蛋白［10-11］。激活的BAX/BAK促使線粒體外膜通透性加強，使得細(xì)胞溶質(zhì)向細(xì)胞外釋放促細(xì)胞凋亡因子，如細(xì)胞色素c和Smac/DIABLO，這些因子可以激活胱天蛋白酶［12］。但是，目前仍不清楚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要途徑究竟是BH3-only蛋白與促細(xì)胞存活蛋白BCL-2類似蛋白結(jié)合還是直接與BAX/BAK結(jié)合。目前已知的結(jié)論是某些BH3-only蛋白（如BIM，PUMA和tBID）比另一些（如BAD，NOXA和BMF）在促進(jìn)細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮著更重要的作用。值得一提的是，發(fā)揮著更重要作用的蛋白可以與所有的BCL-2家族成員結(jié)合，而且可以與BAX/ BAK結(jié)合，而作用較少的蛋白則更加具有選擇性，而且不能與BAX/BAK結(jié)合［13］。

BH3-only蛋白的激活機制主要取決于細(xì)胞凋亡控制。其中轉(zhuǎn)錄激活占主導(dǎo)地位。有資料顯示，一些轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制也發(fā)揮著作用，如在某些特定環(huán)境中發(fā)揮作用的微RNA（microRNA，miRNA）。例如，由DNA損傷導(dǎo)致的抑癌基因p53激活是在翻譯后，之后其又通過轉(zhuǎn)錄上調(diào)PUMA和NOXA的水平［14］。E2F1同樣也可以誘導(dǎo)PUMA和NOXA產(chǎn)生［15］。而PUMA及BIM的表達(dá)則主要是轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a對因子撤銷（cytokine withdrawal）所做出的反應(yīng)［16］。

很多翻譯后的過程都與調(diào)節(jié)BH3-only蛋白的活性有關(guān)。BIM和BAD的作用可以由于磷酸化而被抑制［14］。BAD的磷酸化導(dǎo)致其在細(xì)胞質(zhì)中被14-3-3蛋白隔離，從而無法發(fā)揮促細(xì)胞凋亡的作用。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulat?ed kinase，ERK）誘導(dǎo)的BIM磷酸化對激酶的抗細(xì)胞凋亡活性產(chǎn)生至關(guān)重要的影響［17］。然而最新研究顯示，ERK誘導(dǎo)的BIM磷酸化并不能調(diào)節(jié)所有動物由BH3-only蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。因為BIM和BMF都可以與細(xì)胞骨架的成分結(jié)合，從而抑制了它們促細(xì)胞凋亡的過程［18］。

BH3-only蛋白的表達(dá)同樣被轉(zhuǎn)錄后的miRNA所調(diào)節(jié)。很多miRNA都與BIM的表達(dá)有關(guān)，包括小鼠的miR-17～92簇及人類癌細(xì)胞系（miR-32，miR-17-5p和miR-106-25）。PUMA也被認(rèn)為是由miR-483-3p，miR-221及miR-222調(diào)控的。對促細(xì)胞存活蛋白來說，BCL-2及MCL-1也都主要由特定的miRNA調(diào)控，包括miR-29和miR-153。BCL-2的表達(dá)還受miR-15，miR-16，miR-195及p53誘導(dǎo)的miR-34調(diào)節(jié)，BCL-XL的表達(dá)受miR-491調(diào)控［13］。

3 已鑒定的BH3類似物

早先的一些天然的或人工合成的小分子BCL-2抑制劑，例如三聯(lián)苯、HA14-1、抗霉素A、BH3-I和白屈菜赤堿的實際臨床效果并不盡如人意，主要表現(xiàn)為具有細(xì)胞毒性、特異性較低、與BCL-2蛋白疏水腔的親和度不高及不能引發(fā)BAX/BAK依賴的細(xì)胞凋亡等。目前，有很多已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗階段的BCL-2促存活蛋白拮抗劑已經(jīng)開始解決上述問題，并且在某些方面有了一定的突破。

3.1 ABT-737和ABT-263

ABT-737及其可口服的衍生物ABT-263是BH3類似物的原型。這2種化合物曾一度被認(rèn)為是Lessene等［19］設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)下唯一確定的BH3類似物，它們具有其他已知化合物所不具備的特性，比如能和促存活蛋白高度親和并且不會同時殺死BAX缺陷、BAK缺陷及野生型細(xì)胞。除了藥物代謝動力學(xué)特征，ABT-737和ABT-263的特征有很大程度的重疊。值得注意的是，這2種化合物與BCL-2，BCL-XL和BCL-W結(jié)合，而非與MCL-1或A1結(jié)合來模擬BH3-only蛋白BAD，因此它們又被稱為類BAD BH3類似物。ABT-737和ABT-263僅在MCL-1不表達(dá)或微弱表達(dá)時才表現(xiàn)出顯著的促凋亡和抗腫瘤效應(yīng)。這2種BH3類似物無法與MCL-1結(jié)合是藥物抗性產(chǎn)生的主要原因之一，尤其是當(dāng)腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)MCL-1時。Roberts等［20］記錄了臨床Ⅰ和Ⅱ期試驗中ABT-263在多種癌癥治療中的優(yōu)異表現(xiàn)。而在實際臨床應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)ABT-263的毒性會導(dǎo)致血小板減少癥。因此，需要嚴(yán)格控制其使用劑量，但同時也降低了其抑制腫瘤生長的作用［21］。

3.2 奧巴克拉（obatoclax）

奧巴克拉，又稱GX15-070，是靈桿菌素的人工合成衍生物，它能與全部5種BCL-2促存活蛋白結(jié)合，但親和度較低（微摩爾級）［22］。事實上，其親和度與ABT-737對MCL-1的親和度一樣低，且在殺傷BAX/BAK缺陷細(xì)胞的同時同樣地殺傷野生型細(xì)胞。因此，奧巴克拉并不滿足一個標(biāo)準(zhǔn)BH3要求的2個條件。相反的，它表現(xiàn)出多種脫靶效應(yīng)，例如胱天蛋白酶依賴的細(xì)胞死亡或細(xì)胞自噬，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致MCL-1/BAK結(jié)合的分離；而后者可導(dǎo)致MCL-1/BAK結(jié)合的分離［23］。在對多種腫瘤進(jìn)行的臨床Ⅰ和Ⅱ期試驗中，單獨使用奧巴克拉并沒有得到令人信服的結(jié)果。即使奧巴克拉的耐受性良好，其臨床劑量還是會受到神經(jīng)毒性的限制，因此并不能很高劑量使用。奧巴克拉在組合治療中的效果正在進(jìn)行第Ⅲ階段臨床試驗［24］。

3.3 棉子酚家族

棉子酚是一種植物衍生的多酚醛，在發(fā)現(xiàn)其推定的泛BH3類似物性質(zhì)前就長期應(yīng)用于臨床治療。棉子酚通過結(jié)合BCL-2和BCL-XL發(fā)揮作用，并與MCL-1有適度的親和力（低于微摩爾級）［25］。棉子酚可以阻止白細(xì)胞介素6促存活蛋白在多發(fā)性骨髓瘤癌細(xì)胞中的釋放，導(dǎo)致Ser70發(fā)生脫磷脂和MCL-1水平下調(diào)。棉子酚還可以激活磷脂酶A2和RhoA/ROCK1/PTEN以及誘導(dǎo)BIM和BID［26］。而它的（-）對映體被稱作AT-101，在體外和動物模型中較棉子酚有更強的促凋亡和抗腫瘤活性［23］。但這一化合物在臨床試驗中僅表現(xiàn)出有限的效力。棉子酚的派生物在設(shè)計時去掉了2個醛基群以降低毒性，apogossypol和apogossypolone（ApoG2）正進(jìn)行臨床前評估，而benzoylsulfonide派生物TW37已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅰ/Ⅱ階段試驗［27-28］。這些化合物有相似的結(jié)合能力（在BCL-W和BCL-B之間有少量差異）和適度的親和力，誘導(dǎo)具有BAX/BAK缺陷細(xì)胞的凋亡，并表現(xiàn)出幾項脫靶效應(yīng)，表明它們只有部分泛BH3類似物的作用。值得注意的是，apo?gossypol的衍生物BI-97C1（sabutoclax）與促存活蛋白（包括A1）具有較之前棉子酚衍生物更高的親和力，并可以引發(fā)BAX/BAK缺陷細(xì)胞輕微的細(xì)胞凋亡和少量脫靶效應(yīng)［24］。

3.4 其他BH3類似物

Walensky等［29］原計劃生成一系列穩(wěn)定的BCL-2結(jié)構(gòu)域α-螺旋（SAHB）來靶向與BCL-2促存活家族成員結(jié)合。這些小分子是源于BCL-2蛋白上BH3結(jié)構(gòu)域當(dāng)中碳?xì)浠衔?嵌入的肽類，并具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)、蛋白酶抗性和細(xì)胞通透性。這些化合物中的一個SAHBA以BH3-only蛋白BID為原型，與BCL-2和BCL-XL有適度親和力，可在體外引發(fā)BAX/BAK依賴的細(xì)胞凋亡，并在體內(nèi)引起抗白血病效應(yīng)。但是，還沒有臨床數(shù)據(jù)證明SAHB具有類BAD的效應(yīng)。有2個推定的泛BH3類似物也在進(jìn)行臨床前鑒定，人工合成雜環(huán)化合物S1和基于BIM的BH3結(jié)構(gòu)域的肽類072RB。這2種化合物都具有促凋亡和抗腫瘤作用（體內(nèi)也有抗腫瘤作用），但不能完全滿足BH3類似物的所有要求［30］。

另外，有2個不同的實驗室提出了可以人工設(shè)計類NOXA（針對重要的抗凋亡蛋白MCL-1）BH3類似物的理念，即BIMS2A是BIM的BH3結(jié)構(gòu)域的變形體［31］，而MCL-1 SAHB則直接源于MCL-1的BH3結(jié)構(gòu)域本身［32］。X-射線晶體學(xué)分析得出的超微結(jié)構(gòu)不但表明這兩種化合物都選擇性的與MCL-1的疏水凹槽結(jié)合，還揭示了這種結(jié)合的肽鏈決定因素。BIMS2A和MCL-1 SAHB與NOXA一樣，都是MCL-1介導(dǎo)的抗細(xì)胞凋亡的強效抑制劑，并在血液系統(tǒng)癌細(xì)胞系中表現(xiàn)出抗癌癥效應(yīng)。BIMS2A還在動物模型中表現(xiàn)出抗白血病活性（表1）。

最后，Gavathiotis等［33］報道，一種源于BIM的BH3 α-螺旋SAHB可以直接與BAX結(jié)合，且它們的相互作用位點與傳統(tǒng)的促存活蛋白BCL-2的結(jié)合凹槽不同。這些研究表明，BH3類似物概念可以用來設(shè)計以直接活化BAX為模式的化合物以模仿“活化劑”BH3-only蛋白。

表1概括了已確定的不同類別BH3類似物的來源、模擬通路及現(xiàn)階臨床試驗情況。

4 待進(jìn)一步鑒定的BH3類似物

4.1 S1及其衍生物

S1最初被認(rèn)為是一種泛BH3類似物的小分子抑制物，因為它可與BCL-2和MCL-1同時結(jié)合（盡管親和力一般，低于微摩爾級），破壞BCL-2/BAX和MCL-1/BAK復(fù)合體，并引起B(yǎng)AX/BAK依賴的細(xì)胞凋亡［34］。隨后的報導(dǎo)顯示，S1并非作為一種BH3類似物存在，而是引發(fā)了BH3-only蛋白NOXA（一種MCL-1的特殊抗性配合體），并因此導(dǎo)致BAX的釋放。近期數(shù)據(jù)給出了S1的深入鑒定。一份研究描述了BIM與BCL-2和MCL-1結(jié)合并導(dǎo)致BAK釋放的動態(tài)變化，并指出MCL-1過度表達(dá)細(xì)胞中S1的作用可能與這一機制相關(guān)［35］。另一研究表明，自我吞噬在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)緊張和BCL-2/BECLIN1結(jié)合破壞所致的S1觸發(fā)細(xì)胞死亡中扮演了重要角色［36］。然而，最新的研究顯示，S1并不是一個很好的BH3類似物。因為它并不能很好地抑制BCL-2依賴型慢性淋巴細(xì)胞性白血病。另外，S1的作用也經(jīng)常受到活性氧產(chǎn)生及病原誘導(dǎo)的影響，并不能直接反應(yīng)BCL-2和MCL-1的作用［37］。

表1 已鑒定的BH3類似物

人們合成了一系列S1衍生物，其中一種具有9～35倍與BCL-2、BCL-XL和MCL-1凹槽親和能力（10～20 nmol·L-1），并能較親代S1更好地引發(fā)腫瘤細(xì)胞系促細(xì)胞凋亡的發(fā)生［38］。這一S1替代物可能會被認(rèn)為是真正的泛BH3類似物，因為它保留了親代S1引發(fā)BAX/BAK凋亡的能力。

4.2 ApoG2

ApoG2是一個棉子酚衍生物（缺少2個醛基），也是一個推定的BH3類似物，它可以與BCL-2、BCL-XL和MCL-1適度結(jié)合（低于微摩爾級），并在多種腫瘤細(xì)胞中引發(fā)細(xì)胞凋亡。值得注意的是，近期一份研究表明，在ApoG2致凋亡過程中，BAX和BAK是必需的［39］，表明這個化合物在BH3模擬中起到一定的作用。這篇研究還表明ApoG2可以引發(fā)早期慢性淋巴細(xì)胞白血病的細(xì)胞凋亡?？紤]到多種BCL-2促存活蛋白家族成員（包括MCL-1）的過表達(dá)在阻礙細(xì)胞凋亡中的重要作用，ApoG2在早期慢性淋巴細(xì)胞白血病治療中的潛在價值得以體現(xiàn)。此外，ApoG2可以引起鼻咽癌過程中的細(xì)胞自我吞噬，從而很好地抑制癌細(xì)胞生長。

4.3 奧巴克拉

有2項研究對奧巴克拉這個推定的BH3類似物的新特征進(jìn)行了描述。一篇研究顯示，對AKT/ mTOR途徑的抑制是奧巴克拉的脫靶效應(yīng)［40］。另一篇結(jié)果則表明，這一化合物可以直接激活BAX［41］，支持了Gavathiotis等［33］關(guān)于BIM派生的SAHB能夠結(jié)合并激活BAX的報告。表明雖然奧巴克拉不能以高親和度與促存活蛋白BCL-2結(jié)合，也不能引發(fā)BAX/BAK依賴的細(xì)胞凋亡，但它可以模擬“活化劑”BH3-only蛋白。而最新的研究表示，奧巴克拉也可以在黑色素瘤［42］和急性淋巴細(xì)胞白血病［43］引起一些特定的細(xì)胞凋亡，此外，奧巴克拉還可以引發(fā)成淋巴細(xì)胞性白血病［44］和橫紋肌肉瘤細(xì)胞的壞死性凋亡［45］。最新的報告也指出，奧巴克拉同樣可以引導(dǎo)BIM，BAX和BAK依賴的細(xì)胞凋亡，比如粒細(xì)胞性白血?。?6］。目前，臨床上對于奧巴克拉的使用也很局限，臨床上嘗試了多種單獨及聯(lián)合給藥方案，結(jié)果奧巴克拉都僅有很低的治療活性［47］。

4.4 BI-97D6

BI-97D6是棉子酚家族的新化合物。這一ApoG2的（-）阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體可以阻止BH3肽段與BCL-XL，BCL-2，MCL-1和A1的結(jié)合，盡管親和度一般（微摩爾級）。BI-97D6在BCL-2-轉(zhuǎn)基因小鼠模型和癌癥異種移植小鼠模型中都表現(xiàn)出體內(nèi)效應(yīng)［28］。本課題組觀察到BI-97D6對于BAX/BAK缺陷的細(xì)胞僅表現(xiàn)出很小的細(xì)胞毒性，這表明其主要是通過BAX/BAK途徑發(fā)揮作用。盡管實際親和度尚不明確，但BI-97D6可能代表了BH3類似物中一種值得關(guān)注的化合物。

4.5 BH3-M6

BH3-M6是一種人工合成的以三聯(lián)苯為骨架，含有一些用來模擬BH3螺旋關(guān)鍵氨基酸的天然空間構(gòu)型功能集團(tuán)的化合物［48］。計算對接研究表明，這種化合物可與BCL-XL，BCL-2和MCL-1結(jié)合。在脫細(xì)胞和完整的人類腫瘤細(xì)胞中的研究顯示，BH3-M6可以阻止3種促存活蛋白與BH3-only蛋白BIM、BAD，促凋亡多BH結(jié)構(gòu)域蛋白BAX、BAK的結(jié)合。這些作用導(dǎo)致促凋亡蛋白釋放，細(xì)胞色素c釋放，胱天蛋白酶活化，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡?？傊?，BH3-M6是一個泛BCL-2家族的抑制劑［48］。然而BH3-M6的結(jié)合親和度尚不確定，其引發(fā)的凋亡是BAX依賴的，但不是BAK依賴的。因此，BH3-M6并不滿足“高親和度結(jié)合且BAX/BAK依賴的細(xì)胞凋亡”這一BH3類似物的主要標(biāo)準(zhǔn)。

4.6 聚喹啉派生物

幾種人工合成的聚喹啉派生物（尤其是喹啉的二聚派生物）可與BCL-XL，BCL-2，MCL-1和A1結(jié)合，但結(jié)合親和度低（微摩爾級）［49］。這些化合物抑制BIM與促存活蛋白的相互作用，可以在惡性人淋巴樣細(xì)胞中引發(fā)BAX/BAK依賴的細(xì)胞凋亡，但健康捐獻(xiàn)者的外周血單核細(xì)胞無反應(yīng)。雖然喹啉派生物代表了一類全新的泛BCL-2抑制劑，但受其低親和度限制無法成為真正的BH3類似物。

4.7 Marinopyrrole A（maritoclax）

有報道稱，這一源于一種海產(chǎn)鏈霉菌的天然產(chǎn)物可與MCL-1結(jié)合，但不與BCL-XL結(jié)合，它會破壞MCL-1/BIM復(fù)合體并引發(fā)白血病和淋巴瘤細(xì)胞系中MCL-1依賴型的細(xì)胞凋亡，但不能使BCL-XL或BCL-2依賴型細(xì)胞凋亡［50］。這些效應(yīng)與蛋白酶體降解MCL-1有關(guān)。另外，作者還表示其識別了一種全新的可結(jié)合并引發(fā)MCL-1降解的選擇性MCL-1抑制劑。對于Marinopyrrole A是否一個天然的靶向MCL-1的BH3類似物，仍需通過確定結(jié)合親和度及BAX/BAK途徑的參與度來評估。表2概括了待進(jìn)一步確定的不同類別BH3類似物的來源、靶向、親和力以及現(xiàn)階臨床試驗情況。

表2 待確定BH3類似物

5 最新發(fā)現(xiàn)具備臨床實際應(yīng)用價值的BH3類似物

最近有3個新的BH3類似物和一個明確的BAX活化劑分子被發(fā)現(xiàn)，它們的特征概述于表3。

5.1 高特異性BCL-2抑制劑ABT-199

ABT-199是ABT-263的合成派生物，它的研制是為了推動ABT-263的臨床應(yīng)用［51］。劑量限制血小板減少癥是使用ABT-263后可在患者身上迅速觀察到的不良反應(yīng)。血小板減少癥并非由于血小板生成量的減少，而是BCL-XL活性抑制的正常效應(yīng)，因為BCL-XL的生理效應(yīng)就是保護(hù)衰老血小板免遭細(xì)胞凋亡。在BCL-2小分子復(fù)合物的X射線晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上設(shè)計出ABT-263派生物，用來避免這一副作用。ABT-199僅與BCL-2高親和度結(jié)合，但不作用于BCL-XL，并能在很多血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞系中引發(fā)BAX/BAK依賴的細(xì)胞凋亡。除了保護(hù)血小板，這一真正的BH3類似物還提高了動物模型中BCL-2依賴的人類惡性血液病的復(fù)發(fā)。目前臨床上使用的ABT-199，主要從BCL-XL/ABT-737復(fù)合物的結(jié)構(gòu)中發(fā)展而來，從而獲得了既能高特異性結(jié)合BCL-2又能將毒性降到最低的化合物，大大增加了這一化合物在臨床上的可用性［52］。

5.2 BCL-XL和MCL-1拮抗劑BIM SAHB

LaBelle等［53］近期研究鑒定了一個以BIM（能結(jié)合5種主要的促存活蛋白BCL-2）的BH3螺旋為模板的SAHB的藥理學(xué)潛能。BIM SAHB與BCL-XL，BCL-W，MCL-1和A1以納摩爾級親和，阻礙BCLXL與BAX，MCL-1與BAK的結(jié)合，并直接引發(fā)BAX/ BAK依賴的線粒體細(xì)胞色素c釋放，這顯示了真正的泛BH3類似物的特點（表3）。BIM SAHB使線粒體共區(qū)域化，激活胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7，重啟對ABT-737有抗性的白血病/淋巴癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡（對良性細(xì)胞無作用），并在人急性髓性白血病的異種移植動物模型中表現(xiàn)出腫瘤抑制活性。這些體內(nèi)外的效應(yīng)依賴于BH3序列。選擇性活化骨髓BIM缺乏小鼠的異常淋巴浸潤中的細(xì)胞死亡，沒有明顯副作用等特點，使應(yīng)用這一新的真正的靶向大范圍BCL-2促存活蛋白（類BIM活性）的BH3替代物來完成BIM BH3替代策略有良好的治療前景。

5.3 新的小分子MCL-1特異性抑制劑MIM1

同時，Stewart等［54］對能從結(jié)合的MCL-1上取代MCL-1 SAHB的小分子進(jìn)行了高通量篩選，有超過70000種結(jié)構(gòu)差異的小分子被競爭性熒光偏振結(jié)合測定篩選出來。后續(xù)進(jìn)行不同的篩選產(chǎn)生28種化合物，接著進(jìn)行了基于脂質(zhì)體和基于細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)實驗。其中最活潑的分子，即MCL-1抑制劑分子1（MIM1）有一個噻唑核心，并輔以甲基、三乙基亞胺基和苯三酚等取代基。MIM1是一種高特異性MCL-1抑制劑，通過靶向MCL-1的疏水腔阻止MCL-1介導(dǎo)的促凋亡BAX抑制，并在MCL-1依賴的白血病細(xì)胞中引發(fā)BAX/BAK細(xì)胞凋亡，BCL-XL依賴細(xì)胞無此反應(yīng)［55］。隨著MIM1的提純研究，MIM1已經(jīng)成為新一代MCL-1特異性BH3類似物的原型，并在治療MCL-1為重要因素的惡性腫瘤中發(fā)揮了重要作用。MIM1可以與ABT-737發(fā)揮協(xié)同作用，在白血病細(xì)胞中產(chǎn)生MCL-1依賴型的毒素抑制其生長。另一項最新研究發(fā)現(xiàn)了另外一個MCL-1抑制劑A-1210477，其作用和MIM1基本相同，可以與navitoclax協(xié)作共同在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮作用［56］。

5.4 BAX直接活化劑BAM7

Gavathiotis等［33］報道，源于BIM的SAHB能與BAX的一個位點結(jié)合并直接引發(fā)其活性。通過在電腦中篩選能將SAHB從與其配合的BAX中置換出來的小分子，識別出一種BAX活化劑分子BAM7，它選擇性作用于BAX活化位點而非傳統(tǒng)的用于結(jié)合促存活BCL-2蛋白的BH3結(jié)合凹槽。這一化合物（以吡唑啉酮為核心輔以取代基）在BAK缺陷細(xì)胞中引發(fā)BAX活化和BAX介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這些資料支持了“活化劑”BH3類似物可以人工設(shè)計這一概念。

表3 BH3類似物ABT-199,BIM SAHB,MIM 1和BAM7的鑒定及其與ABT-737/ABT-263的對比

6 展望

小分子BAM7通過直接結(jié)合活化BAX引起細(xì)胞凋亡，推定的BH3類似物奧巴克拉可以直接活化BAX。這些發(fā)現(xiàn)表明，即使一個化合物不能滿足標(biāo)準(zhǔn)BH3類似物的全部要求，仍可以通過直接活化模式來發(fā)揮作用，開通了一條研究發(fā)展“活化劑”BH3類似物的道路。

至于促存活蛋白BCL-2活性的抑制劑，最近有8個新的小分子被識別。其中1個針對BCL-2，2個選擇性作用于MCL-1，另外5個針對多個抗凋亡蛋白。其中，BI-97D6、BH3-M6、聚喹啉、maritoclax和S1派生物都尚未滿足一個標(biāo)準(zhǔn)BH3類似物的要求。除非通過深入研究證明這些化合物可以像標(biāo)準(zhǔn)BH3類似物一樣發(fā)揮作用，否則為了避免誤導(dǎo)性脫靶效應(yīng)等原因，它們無法得到實際應(yīng)用。關(guān)于BH3模塊與BCL-XL和MCL-1的疏水凹槽特異性結(jié)合的分子決定因子（包括多肽序列的組織）的研究對于提高候選BH3類似物的親和度、生物學(xué)效率和治療潛力方面起著重要作用。三種真正的BH3類似物的發(fā)現(xiàn)正可謂錦上添花，因為它們代表三種新型BH3類似物。其中，ABT-199是BCL-2特異性的抗性配體，我們正期待著其臨床試驗的最終結(jié)果。另外2個是用SAHB方法鑒定出來的，MIM1對MCL-1呈高度特異性，而BIM SAHB幾乎具備一個泛BH3類似物的全部特點。

盡管BH3類似物在實驗室研究中取得了很大的進(jìn)展，在臨床試驗方面還有很長的路要走。一個突出的問題是無論是單獨給藥還是聯(lián)合給藥，BH3類似物（例如棉子酚和奧巴克拉）的治療效果都十分有限。最主要的原因是這些化合物的副作用，為了避免大劑量導(dǎo)致的嚴(yán)重不良反應(yīng)，臨床上不得不減少劑量，這使得治療效果不盡如人意。令人欣喜的是，近期發(fā)現(xiàn)ABT-199幾乎沒有副作用，這使得BH3類似物的臨床試驗研究有了進(jìn)一步的發(fā)展。

綜上所述，新型BH3類似物成為BH3類似物研究的主要方向，具有廣闊的研究前景及應(yīng)用價值。

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Mechanism of BH3 mimetics promoting cell apoptosis and its latest clinical research progress

ZHANG Yue＊,ZHANG Yi-jia＊,LI Xue-jun

(Pharmacology Department,School of Basic Medical Sciences,Peking University, Beijing 100191,China)

Targeting cell apoptosis is currently the most promising therapy for cancer treatment. The BH3-only protein,which is a member of Bcl-2 family,can bind to the pro-survival members of the family and neutralize their functional activities to induce apoptosis(ie,to isolate pro-apoptotic members of the Bcl-2 family).BH3 mimetics,a kind of small molecule compounds,has the ability to mimic the BH3-only protein to induce apoptosis.The prototype of BH3 mimetics is ABT-737,who can selectively targets on BCL-XL,BCL-2 and BCL-W(but not MCL-1 and A1).ABT-263,a derivative of ABT-737,has a better performance of inducing apoptosis and inhibiting the growth of tumor in clinical trials.At this stage,some presumably BH3 mimetics has entered the clinical stage,while a large part of them is still being characterized and tested.Basing on the mechanism of BH3-only protein,this review summarize a variety of BH3 mimetics which have been widely recognized,and show the latest developments of newly diagnosed BH3 mimetics in the field.

anti-cancer drugs;BH3 mimetics;BCL-2 protein;BH3-only protein

LI Xue-jun,E-mail:xjli@bjmu.edu.cn

R966，R979.1

A

1000-3002-（2017）01-0001-11

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.01.001

2016-09-28接受日期：2017-01-17）

（本文編輯：齊春會）

國家自然科學(xué)基金（81673453）；國家自然科學(xué)基金（81473235）；國家自然科學(xué)基金（91129727）；教育部111項目（B07001）

張岳，理學(xué)學(xué)士，主要從事分子藥理學(xué)研究；張伊佳，醫(yī)學(xué)學(xué)士，主要從事分子藥理學(xué)研究。

李學(xué)軍，E-mail：xjli@bjmu.edu.cn

＊共同第一作者

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(81673453;National Natural Science Foundation of China(81473235);National Natural Science Foundation of China(91129727);and"111 Program"of Ministry of Education(B07001)

＊Co-first author.