“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法對(duì)腦出血大鼠腦組織中PERK蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

鄒偉，牛明明，于學(xué)平，孫曉偉，滕偉，戴曉紅，袁夢(mèng)飛，陳秋欣，劉鵬，姚冬

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法對(duì)腦出血大鼠腦組織中PERK蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

鄒偉1，牛明明2，于學(xué)平1，孫曉偉1，滕偉1，戴曉紅1，袁夢(mèng)飛2，陳秋欣1，劉鵬2，姚冬2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的:探討“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法對(duì)腦出血大鼠腦組織細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路關(guān)鍵蛋白PERK表達(dá)的影響。方法:將Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為SHAM組、模型組、針刺組、3-MA組、3-MA+針刺組，再將各組隨機(jī)分為4個(gè)時(shí)間亞組，每亞組6只。采用自體血注射的方法建立腦出血大鼠模型，3-MA組于造模前15 min注射3-MA自噬抑制劑，針刺組和3-MA+針刺組于造模成功后以“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法進(jìn)行干預(yù)，于相應(yīng)時(shí)間節(jié)點(diǎn)取材。根據(jù)改良版神經(jīng)缺損評(píng)分系統(tǒng)(mNSS)對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，并用Western Blot法分析PERK蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化。結(jié)果:神經(jīng)功能評(píng)價(jià)方面，造模前大鼠無神經(jīng)功能缺損體征。造模后SHAM組大鼠各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分無顯著差異，其余各組神經(jīng)功能缺損體征于72 h時(shí)各項(xiàng)缺損體征達(dá)到最高峰，后有所緩解，7 d時(shí)針刺組神經(jīng)功能缺損體征明顯改善(P＜0.05)，3-MA組于各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損最重，3-MA+針刺組神經(jīng)缺損情況較3-MA組輕。Western Blot法檢測結(jié)果顯示，除SHAM組外，其余各組PERK蛋白相對(duì)表達(dá)量均有隨時(shí)間變化的趨勢，分別于6h最低，后逐漸升高，至7 d最高;相同時(shí)間點(diǎn)，針刺組相對(duì)表達(dá)量最高(P＜0.01)，3-MA組蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于其他各組(P＜0.05)，3-MA+針刺組表達(dá)量略高于3-MA組。結(jié)論:“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)具有促進(jìn)作用，可能促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路的激活。

自噬;針刺;腦出血;PERK通路

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)出血，出血后的神經(jīng)細(xì)胞死亡的過程是影響患者預(yù)后和神經(jīng)功能缺失情況的關(guān)鍵步驟。細(xì)胞損傷及營養(yǎng)匱乏將導(dǎo)致細(xì)胞自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum Stress，ER stress)的發(fā)生，并使細(xì)胞自發(fā)性啟動(dòng)一系列應(yīng)激反應(yīng)來緩解損傷，以保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞正常生理功能的發(fā)揮，PERK通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded Protein Response，UPR)的主要通路之一，該通路的激活與自噬體的形成有著密切的聯(lián)系［1］，是研究自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制的重要切入點(diǎn)。頭針針刺對(duì)急性腦出血后腦損傷和腦水腫具有拮抗作用［2］，還可以抑制TNF-α介導(dǎo)的免疫炎性反應(yīng)［3］，并促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF)表達(dá)［4］，從而發(fā)揮其腦出血后的腦保護(hù)和治療作用。本研究以腦出血大鼠為模型，研究“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法對(duì)腦出血后大鼠神經(jīng)功能及PERK通路相關(guān)蛋白PERK表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

臺(tái)式牙鉆機(jī)(中國上海齒科醫(yī)械廠，307-6型);立體定位儀(中國成都儀器廠，STW-1型);組織勻漿器(瑞士Fluka公司);低溫冷凍離心機(jī)(德國Thermo公司，002421);電泳儀(美國 BIO-RAD公司，1645070);Mini P-4電泳槽(北京凱元信瑞儀器有限公司，MP-3030);濕轉(zhuǎn)電泳槽(北京凱元信瑞儀器有限公司，MP-3035);MultiSkan3酶標(biāo)儀(德國Thermo公司，51119000);3-Methyladenine(3-甲基腺嘌呤，3-MA，美國CALBIOCHEM公司，189490);蛋白抽提試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0033);BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0010);BSA(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0007);蛋白上樣緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0015);電泳緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0014A);TBST(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0023C3);中分子量蛋白Marker(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0061);濕轉(zhuǎn)緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0021A);NC膜(0.45um，美國Millipore公司，HATF00010);PERK(C33E10，Cell Signaling Techology，3192);#-actin(天德悅(北京)生物科技公司，TDY041);山羊抗兔IgG HRP(天德悅生物科技公司，S004)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

符合國家二級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)的健康Wistar雄性大鼠120只，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物室，室溫控制在18℃ ～22℃，濕度45% ～55%，日光周期 12 h(08:00 am～08:00 pm)，自由覓食飲水。實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)(8±2)d，體質(zhì)量符合(330±30)g的標(biāo)準(zhǔn)后入組，造模前12 h開始禁食，6 h前開始禁水。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的大鼠隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組(SHAM組)、模型對(duì)照組(模型組)、3-MA抑制劑組(3-MA組)、針刺組、3-MA抑制劑+針刺組(3-MA+針刺組)，每組24只，再將各組隨機(jī)分為4個(gè)時(shí)間亞組(造模后12 h、24 h、72 h、7 d)，每亞組6只。SHAM組按正常造模操作，但不注血，分別于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材;模型組造模后于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材;針刺組于造模后6 h開始以28號(hào)1寸毫針由患側(cè)百會(huì)穴透刺曲鬢穴，每24 h針刺1次(參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》取穴，進(jìn)針0.8寸，留針30 min，每5 min捻轉(zhuǎn)1次，每次5 min，針刺過程中共捻針3次);3-MA組在造模前15 min于前囟點(diǎn)右1.5 mm，后0.8 mm定位鉆孔注射3-MA抑制劑(400 nM);3-MA+針刺組于注射抑制劑和自體血后，給予與針刺組相同的針刺方法進(jìn)行干預(yù)。

1.4 動(dòng)物模型制備

依據(jù)大鼠立體定位圖譜［5］和自體血注射的方法［6］制備腦出血大鼠模型。大鼠以腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)的方法進(jìn)行麻醉，并以俯臥位固定于立體定位上，取兩耳尖連線中點(diǎn)備皮、切口，充分暴露前囟點(diǎn)及冠狀縫，以立體定位儀定位注血點(diǎn)(前囟點(diǎn)為中心，右側(cè)3.5 mm，后側(cè)0.2 mm)，用1.0 mm直徑牙鉆頭鉆孔至硬腦膜表面。鼠尾消毒后于尾端3 cm處剪斷，以微量注射器取血50 μl，并沿鉆孔垂直進(jìn)針6 mm，以25 μl/min的注血速度，將自體血注入尾狀核，留針5 min后緩慢出針。術(shù)后局部噴灑慶大霉素并用牙科水泥密封顱骨鉆孔，縫合頭皮并消毒創(chuàng)口皮膚，斷尾處消毒包扎，以防感染。

1.5 動(dòng)物模型成功標(biāo)準(zhǔn)

參考Bederson神經(jīng)功能缺損體征評(píng)分法(Postural Reflex Test)［7］，對(duì)造模前后大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分＞1者判定為出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損體征，且處死后取腦證實(shí)顱內(nèi)血腫者視為造模成功，否則棄之不用，在同批大鼠中隨機(jī)抽樣重新入組。

1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物干預(yù)方法

SHAM組以造模方法操作，但不注血、不做干預(yù)，分別于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材;模型對(duì)照組造模后于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材;抑制劑組在造模前15 min于前囟點(diǎn)右1.5 mm，后 0.8 mm定位鉆孔注射 3-MA抑制劑(0.2 mg/kg);針刺組于造模后6 h開始以28號(hào)1寸毫針由患側(cè)百會(huì)穴透刺曲鬢穴，每24 h針刺1次(參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》取穴，進(jìn)針0.8寸，留針30 min，每5 min捻轉(zhuǎn)1次，每次5 min，共計(jì)3次)，3-MA+針刺組于注射抑制劑和自體血后，以于針刺同樣的針刺方法進(jìn)行干預(yù)。

1.7 神經(jīng)功能缺損評(píng)價(jià)

參考大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)價(jià)系統(tǒng)(Neurological Severity Score，NSS)［8］、Bederson神經(jīng)功能缺損體征評(píng)分法(Postural Reflex Test)［7］、網(wǎng)屏測驗(yàn)(Screen Test)［9-10］和平衡木測驗(yàn)評(píng)分法 (Balance Beam Test)［11］，建立改良版大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)價(jià)系統(tǒng)(modified Neurological Severity Score，mNSS)，分別于造模前和造模后6 h處及死前對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分(評(píng)分精確至0.1)，最后計(jì)算總分，最高分為11分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如前所述［12］。

1.8 Western Blot法分析蛋白相對(duì)表達(dá)量

大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)過量麻醉后，直接斷頭取腦，將腦組織樣本迅速放入液氮中速凍，通過RIPA蛋白抽提試劑盒提取腦組織蛋白，以BCA蛋白濃度測定法對(duì)腦組織蛋白進(jìn)行定量，上樣后經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后，以一抗PERK(1∶1 000)4℃孵育過夜，二抗(1∶10 000)孵育1 h，以ECL試劑進(jìn)行顯影成像，光片于凝膠成像系統(tǒng)下白光掃描，進(jìn)行吸光度分析，用同一標(biāo)本內(nèi)參β-actin(1∶10 000)進(jìn)行校正，以蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的條帶表達(dá)強(qiáng)度/β-actin表達(dá)強(qiáng)度為公式計(jì)算出蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間比較用ANOVA方差分析，兩兩比較采用 SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為0.05，即P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)功能評(píng)價(jià)結(jié)果

模前大鼠mNSS評(píng)分為0分，即無神經(jīng)功能缺損體征。造模后SHAM組大鼠各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分無顯著差異，仍為0分，其余各組出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損體征，于72 h時(shí)各項(xiàng)體征達(dá)到最高峰，而后有所緩解，至7 d時(shí)，針刺組神經(jīng)功能缺損體征明顯改善，與其他各實(shí)驗(yàn)組兩兩比較，差異顯著(P＜0.05)，模型組7 d時(shí)神經(jīng)功能恢復(fù)情況略好于3-MA組和3-MA+針刺組; 3-MA組于各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損最為嚴(yán)重(P＜0.05)，3-MA+針刺組神經(jīng)缺損情況較3-MA組輕。結(jié)果比較和分析如表1、圖1所示。

表1 各組造模后神經(jīng)功能缺損綜合評(píng)分mNSS比較(±s，n=6)

表1 各組造模后神經(jīng)功能缺損綜合評(píng)分mNSS比較(±s，n=6)

注:針刺組與其他各組兩兩比較，★P＜0.05;3-MA組與其他各組兩兩比較，▲P＜0.05。

組別n 6 h 24 h 72 h 7 d SHAM組6 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 6 6.97±3.31 8.20±0.26 10.56±0.15 4.85±0.14針刺組 6 6.30±0.24 7.45±0.18 7.83±0.22▲2.14±0.17▲3-MA組 6 7.63±0.29★9.16±0.20★10.85±0.17★6.41±0.21★3-MA+針刺組6 7.21±0.25 8.68±0.23 9.95±0.29 5.60±0.19

圖1 各組神經(jīng)功能缺損綜合評(píng)分(mNSS)比較

2.2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織中PERK的Western Blot法檢測結(jié)果

如表2、圖2所示，各實(shí)驗(yàn)組組PERK蛋白相對(duì)表達(dá)量呈時(shí)間相關(guān)性，6 h時(shí)最低，7 d時(shí)表達(dá)量最高，SHAM組PERK蛋白相對(duì)表達(dá)量于個(gè)時(shí)間點(diǎn)未見明顯差異(P＞0.05);相同時(shí)間點(diǎn)的組間比較，針刺組相對(duì)表達(dá)量均高于其他各組(P＜0.05);3-MA組PERK蛋白相對(duì)表達(dá)量最低(P＜0.05)，3-MA+針刺組相對(duì)表達(dá)量略高于3-MA組但低于模型組。

表2 各組造模后PERK蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果比較(±s，n=6)

表2 各組造模后PERK蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果比較(±s，n=6)

注:針刺組與其他各組兩兩比較，★P＜0.05;3-MA組與其他各組兩兩比較，▲P＜0.05。

組別n 6 h 24 h 72 h 7 d SHAM組6 0.30±0.03 0.31±0.04 0.31±0.03 0.32±0.04模型組 6 0.43±0.05 0.65±0.08 1.17±0.12 2.36±0.15針刺組 6 0.78±0.12 0.93±0.14 1.92±0.16 3.13±0.08 3-MA組 6 0.26±0.09 0.29±0.03 0.53±0.03 2.05±0.10 3-MA+針刺組6 0.36±0.04 0.46±0.07 0.68±0.05 2.21±0.07

圖2 各實(shí)驗(yàn)組PERK蛋白免疫印跡分析結(jié)果比較

3 討論

3.1 PERK通路在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬中的作用

細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重構(gòu)對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER Stress，ERS)和未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)對(duì)細(xì)胞在應(yīng)激條件下的存活密切相關(guān)［13-15］，ERS和UPR對(duì)疾病的影響也被越來越多實(shí)驗(yàn)研究所證實(shí)［16-19］。當(dāng)細(xì)胞各項(xiàng)生理機(jī)能處于正常水平時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)也呈動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的常駐分子伴侶GRP78與UPR三個(gè)效應(yīng)元件即PERK、IRE1和ATF6穩(wěn)定結(jié)合，使三者處于失活狀態(tài)。一旦細(xì)胞遭受損傷，內(nèi)穩(wěn)態(tài)被破壞，蛋白質(zhì)合成的合成受到干擾，致使大量錯(cuò)誤折疊蛋白或未折疊蛋白的堆積，GRP78就會(huì)與三者解離，轉(zhuǎn)而結(jié)合錯(cuò)誤折疊蛋白或未折疊蛋白，隨著GRP78的解離，PERK、IRE1和ATF6也隨之被激活，通過調(diào)控其下游基因的表達(dá)來降低蛋白質(zhì)的合成或促進(jìn)蛋白和細(xì)胞碎片的降解，使細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)得以恢復(fù)、使細(xì)胞的正常生理功能得以保護(hù)。

PERK(protein kinase R -like endoplasmic reticulum kinase)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)常駐跨膜酶蛋白，在人體內(nèi)由EIF2AK3(Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3)基因編碼，GPR78的解離導(dǎo)致PERK的自磷酸化形成二聚體，并磷酸化真核翻譯起始因子EIF2α，從而降低了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的翻譯效率，致使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的減少，緩解了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)因蛋白質(zhì)過載引發(fā)的應(yīng)激狀態(tài)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重構(gòu)具有促進(jìn)作用。盡管未折疊蛋白反應(yīng)的三條通路均參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞自噬或凋亡的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)重構(gòu)過程，越來越的研究表明PERK及其通路的特定下游因子在細(xì)胞存活或死亡的發(fā)展趨勢上發(fā)揮著不可替代的作用。有研究［20］發(fā)現(xiàn)，維系細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的自噬流的形成需要PERK通路的參與，而EIF2α的磷酸化也是自噬誘導(dǎo)的必要條件，在自噬的初始誘導(dǎo)階段，一系列EIF2α磷酸化依賴型選擇性翻譯介導(dǎo)了ATG12的表達(dá)，從而促進(jìn)了ATG5-ATG12-ATG15泛素連接系統(tǒng)的形成，推進(jìn)自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)的延展和成熟。由此可見，PERK通路對(duì)細(xì)胞自噬及細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持和恢復(fù)具有重要意義。

3.2“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法對(duì)PERK通路的影響

本實(shí)驗(yàn)研究分別對(duì)各組大鼠腦組織中PERK通路關(guān)鍵蛋白PERK進(jìn)行Western Blot法檢測，結(jié)果顯示，SHAM組于各時(shí)間點(diǎn)PERK通路相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量較低，且并無顯著變化;而其余各組的蛋白表達(dá)量呈時(shí)間相關(guān)性，6 h時(shí)最低，至7 d時(shí)最高，而相同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)組間比較，針刺組的表達(dá)量明顯高于其他各組(P＜0.05)，模型組次之，3-MA組的相對(duì)表達(dá)量為最低，3-MA+針刺組的表達(dá)量略高于3-MA組但低于模型組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠腦出血模型建立后，隨著大鼠腦組織損傷的加重，PERK通路被激活，導(dǎo)致PERK蛋白表達(dá)水平升高，而“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法的干預(yù)則使PERK通路的活躍程度明顯提高，且此影響有隨腦出血時(shí)間的進(jìn)展和針刺干預(yù)次數(shù)的累加而愈加明顯的趨勢，同時(shí)，3-MA抑制劑對(duì)自噬的抑制作用同時(shí)也抑制了PERK通路的活躍程度，而針刺刺激的干預(yù)(3-MA+針刺組)，則在一定程度上緩解了這種抑制作用，使PERK通路仍可持續(xù)激活，由此可見，“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法可以促進(jìn)PERK通路的激活，且可緩解由3-MA抑制劑對(duì)自噬的抑制作用和PERK通路活躍度減低情況。

頭針針刺對(duì)腦出血治療作用已經(jīng)被大量的臨床實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，而隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)針灸治療疾病的機(jī)理研究也愈加深入。有研究證實(shí)，針刺百會(huì)穴在改善大鼠腦出血后的局部腦血流量的同時(shí)，對(duì)神經(jīng)功能癥狀的恢復(fù)也發(fā)揮著積極作用［21-22］。劉氏［23］研究證明，針刺能提高急性腦出血家兔腦組織SOD活性，具有抗脂質(zhì)過氧化的作用。同時(shí)，針刺還可能通過改變血清中抑制因子的表達(dá)來促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化，從而促進(jìn)腦出血后腦損傷的修復(fù)［24］。鄒偉教授科研團(tuán)隊(duì)的前期實(shí)驗(yàn)研究從組織形態(tài)學(xué)、神經(jīng)營養(yǎng)因子、炎性反應(yīng)研究、神經(jīng)重塑和細(xì)胞凋亡機(jī)制等［25-27］角度驗(yàn)證了“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法對(duì)腦出血大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的積極意義，本研究在此基礎(chǔ)之上，以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路為切入點(diǎn)，進(jìn)一步探討了“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法對(duì)腦出血大鼠腦組織PERK通路的的激活作用，證實(shí)了“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法可以改善腦出血大鼠的神經(jīng)功能缺損狀況，揭示了“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的潛在機(jī)制，為針刺機(jī)理研究和腦出血治療方案的探索提供了新的思路。

［1］Adolph TE，Tomczak MF，Niederreiter L，et al.Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation［J］.Nature，2013，503(7475): 272-276.

［2］張國威，鄒偉，劉芳，等.針刺對(duì)腦出血急性期大鼠腦損傷及腦水腫拮抗作用的機(jī)理研究［J］.針灸臨床雜志，2010，26(7):46-51.

［3］于曉剛，東貴榮，周景華.針刺對(duì)急性腦出血大鼠TNF-α的影響［J］.中國針灸，2004，24(5):35-39.

［4］劉芳，鄒偉，張國威，等.針刺對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)生長因子基因表達(dá)的影響［J］.針灸臨床雜志，2007，23(6):46-51.

［5］包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991.

［6］Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Wesley M，et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats［J］.Stroke;a journal of cerebral circulation，1990，21(5):801-807.

［7］Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke;a journal of cerebral circulation，1986，17 (3):472-476.

［8］Chen J，Sanberg PR，Li Y，et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats［J］.Stroke;a journal of cerebral circulation，2001，32(11):2682-2688.

［9］Chesney JA，Kondoh T，Conrad JA，et al.Collagenase-induced intrastriatal hemorrhage in rats results in long-term locomotor deficits［J］.Stroke;a journal of cerebral circulation，1995，26(2):312-317.

［10］徐莉，李玲，陳景藻，等.康復(fù)訓(xùn)練對(duì)大鼠腦梗塞神經(jīng)功能恢復(fù)的影響［J］.中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2000，22(2):86-88.

［11］Altumbabic M，Peeling J，Del Bigio MR.Intracerebral hemorrhage in the rat:effects of hematoma aspiration［J］.Stroke;a journal of cerebral circulation，1998，29(9):1917-1922.

［12］鄒偉，于婷婷，王冬，等.頭針透穴法對(duì)腦出血大鼠腦組織中βcatenin表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中醫(yī)藥信息，2014，31(1): 76-79.

［13］Kozutsumi Y，Segal M，Normington K，et al.The presence of malfolded proteins in the endoplasmic reticulum signals the induction of glucose-regulated proteins［J］.Nature，1988，332(6163):462-464.

［14］Cox JS，Walter P.A novel mechanism for regulating activity of a transcription factor that controls the unfolded protein response［J］.Cell，1996，87(3):391-404.

［15］Rosbash M.Mixed mechanismsin yeast pre-mRNA splicing?［J］.Cell，1996，87(3):357-359.

［16］Wang P，Xu T-Y，Wei K，et al.ARRB1/β-arrestin-1 mediates neuroprotection through coordination of BECN1-dependent autophagy in cerebral ischemia［J］.Autophagy，2014，10(9):1535-1548.

［17］Zhang X，Yuan Y，Jiang L，et al.Endoplasmic reticulum stress induced by tunicamycin and thapsigargin protects against transient ischemic brain injury:Involvement of PARK2-dependent mitophagy［J］.Autophagy，2014，10(10):1801-1813.

［18］Sheng R，Liu XQ，Zhang LS，et al.Autophagy regulates endoplasmic reticulum stress in ischemic preconditioning［J］.Autophagy，2012，8(3):310-325.

［19］Ginet V，Puyal J，Clarke PG，et al.Enhancement of autophagic flux after neonatal cerebral hypoxia-ischemia and its region-specific relationship to apoptotic mechanisms［J］.The American journal of pathology，2009，175(5):1962-1974.

［20］Kouroku Y，F(xiàn)ujita E，Tanida I，et al.ER stress(PERK/eIF2alpha phosphorylation)mediates the polyglutamine-induced LC3 conversion，an essential step for autophagy formation［J］.Cell death and differentiation，2007，14(2):230-239.

［21］鄒偉，劉芳，張國威.針灸治療腦出血的研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥信息，2007，24(2):31-33.

［22］丁為國，李麗欣，許紅.針刺百會(huì)穴對(duì)急性腦血腫大鼠局部腦血流量的影響［J］.上海針灸雜志，2003，22(5):7-8.

［23］劉漢平.針刺對(duì)家兔腦出血急性期血漿NO腦組織SOD、LPO的影響［J］.陜西中醫(yī)，2003，24(6):567-571.

［24］王素娥，彭爭榮，鐘廣偉.針刺對(duì)腦源性神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響［J］.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2007，22(5):459-461.

［25］鄒偉，張國威，劉芳.針刺百會(huì)透曲鬢對(duì)腦出血大鼠腦組織形態(tài)學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.針灸臨床雜志，2008，24(11):41-45.

［26］陳秋欣，鄒偉，牛明明，等.針刺對(duì)腦出血大鼠血清TNF-α、IL-6含量的影響［J］.上海針灸雜志，2015，10(10):1006-1008.

［27］于學(xué)平，孫曉偉，鄒偉.百會(huì)透曲鬢對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦微血管纖維連接蛋白表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2016，44(5): 71-73.

Effect of Baihui-Qubin Acupuncture Therapy on PERK Protein Expression in Intracerebral Hemorrhage Rat Models

ZOU Wei1，NIU Ming-ming2，YU Xue-ping1，SUN Xiao-wei1，TENG Wei1，DAI Xiao-hong1，YUAN Meng-Fei2，CHEN Qiu-xin1，LIU Peng2，YAO Dong2
(1.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)

Objective:To investigate the effect of Baihui-Qubin acupuncture on PERK expression of PERK pathway key proteins in intracerebral hemorrhage(ICH)rat models.Methods:Wistar rats were randomly divided into five groups:sham group，ICH model group，inhibitor group，acupuncture group and inhibitor+acupuncture group(24 rats in each group);4 sub-groups were divided based on different time points(12hrs，24hrs，72hrs，7days)，with 6 rats in each subgroup.Establish intracerebral hemorrhage rat models by autologous blood injection.Brain tissues were harvested at altered time points in sham group and ICH model group.3-MA inhibitor was injected before 15 minutes of autologous blood injection.Baihui-Qubin acupuncture was implemented in acupuncture group and inhibitor+acupuncture group from 6hrs after ICH(once per 24hrs).Brain tissues were also harvested at altered time points.Evaluate the neurological deficit at 6hrs after ICH and before tissues being harvested.Western Blot studies were performed to analyze the expression of PERK in brain tissues.Results:Neurological deficit evaluation:the neurological behave in acupuncture group was improved，which was associated with the acupuncture involvement.Western Blot results showed that the expression of PERK was increased in acupuncture group and reduced in inhibitor group as well as the inhibitor+acupuncture group which was slightly higher than that in the inhibitor group.Conclusion:Baihui-Qubin acupuncture therapy can alleviate the neurological deficits and also has an effect on PERK pathway activation.

Autophagy;Acupuncture;ICH;PERK pathway

R246

A

1002-2406(2017)02-0075-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81473764);國家留學(xué)基金項(xiàng)目(No.201408230060)

鄒偉(1965-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療腦血管病的研究工作。

2016-05-12

修回日期:2016-06-07