超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜快速篩查與確證豬尿中74種抗生素及其他化合物

張 婧，貢松松，吳劍平，潘 娟，王 博，嚴(yán) 鳳

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

現(xiàn)代畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展離不開抗生素。獸用抗生素的合理使用可以預(yù)防、治療動物疾病，促進(jìn)和維持動物的健康生長[1]。但一些不法商販?zhǔn)芙?jīng)濟(jì)利益驅(qū)使，在飼料中蓄意添加禁用抗生素等風(fēng)險物質(zhì)，不僅影響畜禽的正常生長，而且給畜禽產(chǎn)品質(zhì)量帶來了安全隱患[2]。多年來，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部一直強調(diào)建立以質(zhì)量安全為核心的飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)體系，強化飼料獸藥等投入品的風(fēng)險管控，提升畜產(chǎn)品質(zhì)量安全的保障能力。自2002年起陸續(xù)頒布了農(nóng)業(yè)部第176號公告《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》，第193號公告《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》以及第1519號公告《禁止在飼料和動物飲水中使用的物質(zhì)》等[3-5]。因此，各類公告中禁止或限量使用的各種抗生素及其他化合物的檢測一直是畜產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要保障。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

乙腈、甲醇(色譜純，美國Merck 公司)；甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；實驗用水為超純水(Milli-Q超純水系統(tǒng)自制)。

74種抗生素及其他化合物的標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司、德國Witega公司、美國Sigma公司、中國藥品生物制品檢定所、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和天津阿爾塔有限公司。標(biāo)準(zhǔn)品純度為88.6%～99.8%，相關(guān)信息如表1所示。

Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜配H-ESI Ⅱ 源、Ultimate 3000液相色譜系統(tǒng)及Trace Finder數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品(根據(jù)純度折算質(zhì)量)，用甲醇或50%乙腈等合適的溶劑溶解并定容至10 mL，制成1 mg/mL的單標(biāo)儲備液。對于每類化合物，將單標(biāo)溶液混合配制成50 μg/mL或100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時再根據(jù)需要混合或稀釋。所有標(biāo)準(zhǔn)儲備液均置于4 ℃下避光保存。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件色譜柱:Agilent SB C18柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm),流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～15.0 min，5%～95%B；15.0～17.0 min，95%B；17.0～17.5 min，95%～5%B；17.5～21.0 min，5%B；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件可加熱的電噴霧離子源(HESI-Ⅱ)，離子傳輸管溫度：325 ℃，毛細(xì)管電壓：3 200 V(正、負(fù)離子切換模式)，氣化溫度：350 ℃，鞘氣(N2)：40 L/min，輔助氣(N2)：10 L/min，一級質(zhì)譜駐留時間：100 ms，二級質(zhì)譜駐留時間：50 ms，一級全掃描范圍：m/z100～1 200，分辨率(R)：70 000，掃描模式：Full scan+dd MS2，碰撞裂解氣：高純氮氣，碰撞能量：20、40、60 eV。母離子及子離子的精確分子量見表1。

1.4 樣品前處理

豬尿樣品經(jīng)9 000 r/min離心3 min后，精密移取200 μL，用0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液(95∶5，體積比)稀釋至1 mL，待測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的優(yōu)化

待測藥物種類多，且各藥物的理化特性各異。因此，樣品前處理方法需具有普適性，且盡量簡化前處理步驟，以減少目標(biāo)化合物的損失。PRiME HLB和EMR-Lipid固相萃取法均為通過式固相萃取法，萃取柱無需活化和平衡，樣品凈化過程簡單、快速、有效，近幾年被逐漸應(yīng)用于獸藥殘留檢測領(lǐng)域[21-22]。由于尿樣基質(zhì)相對簡單，實驗對比了直接稀釋法、乙腈提取后經(jīng)PRiME HLB固相萃取和EMR-Lipid固相萃取3種前處理方法。其中，直接稀釋法是將樣品經(jīng)高速離心后直接用初始流動相稀釋5倍進(jìn)樣分析。后兩種固相萃取法是取2 mL尿樣加入18 mL乙腈提取，過PRiME HLB(3 mL)或EMR-Lipid(3 mL)固相萃取柱后，取1 mL以氮氣吹干，用0.5 mL初始流動相復(fù)溶后上機測定。結(jié)果表明，直接稀釋法對74種藥物的提取效果最好，尤其是對四環(huán)素類及喹諾酮類藥物提取時損失很小。因此，選用直接稀釋法對豬尿樣品進(jìn)行前處理。同時，為減少藥物過濾膜時的損失，樣品經(jīng)高速離心并稀釋后直接進(jìn)樣。

2.2 篩查與確證方法研究

根據(jù)歐盟法規(guī)2002/657/EC[23]，以識別分(IPs)為指標(biāo)對化合物進(jìn)行定性分析，對于不同法規(guī)要求的殘留物，確證所需的IPs各不相同。確證指令96/23/EC[24]附錄I-A組所列的物質(zhì)(即違禁化合物)，最少需要4個識別點；確證附錄I-B組所列的物質(zhì)(即限用化合物)，最少需要3個識別點。不同質(zhì)譜技術(shù)的IPs亦各不相同，針對高分辨質(zhì)譜(分辨率大于10 000)，需要1個母離子與1個子離子即可滿足4個識別點，其中1個母離子為2.0 IPs，對應(yīng)的1個子離子為2.5 IPs。此外，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)陸續(xù)發(fā)布了關(guān)于獸藥殘留檢測的指導(dǎo)準(zhǔn)則FDA-CVM GFI #118號法規(guī)[25]，針對獸藥殘留的篩查確證指南[26]，以及關(guān)于食品和飼料中農(nóng)藥殘留分析的質(zhì)量控制和方法驗證程序?qū)tFDA-SANTE/11813/2017[27]。其中對精確質(zhì)量數(shù)偏差作出了規(guī)定，確證條件為至少需要1對合適的母離子與子離子，母離子的精確質(zhì)量數(shù)偏差≤5 ppm，子離子的精確質(zhì)量數(shù)偏差≤10 ppm。

按照上述原則和儀器方法，對目標(biāo)藥物單標(biāo)溶液進(jìn)樣測定并建庫分析，獲得母離子的精確質(zhì)量數(shù)、保留時間及其二級碎片離子的全掃描圖譜，找出豐度最高的子離子和母離子作為確證所需的定性離子對。以74種藥物的保留時間、母離子及子離子的精確質(zhì)量數(shù)作為定性依據(jù)，具體見表1。

表1 74種目標(biāo)藥物的保留時間(RT)、母離子及子離子的精確質(zhì)量數(shù)Table 1 Retention times(RT),parent ions and fragment informations of 74 targeted compounds

(續(xù)表1)

No.CategoryChinesenameEnglishnameRT(min)Parention(m/z)Fragment1(m/z)Fragment2(m/z)Fragment3(m/z)18磺胺硝苯Sulfanitran9.33336.06487294.05430198.02194156.0113719磺胺苯吡唑Sulfaphenazole8.42315.09102222.03317158.07127108.0443920磺胺吡啶Sulfapyridine5.24250.06447184.08692156.01138108.0443921磺胺喹啉Sulfaquinoxaline8.22301.07537156.01138108.0443992.0494822磺胺噻唑Sulfathiazole5.11256.02089156.01138108.0443992.0494823磺胺二甲基異嘧啶Sulfisomidine4.25279.09102156.01138124.08692108.0443924磺胺異唑Sulfisoxazole7.61268.07504156.01138113.07094108.0443925甲氧芐啶Trimethoprim4.98291.14517275.11387261.09822245.1033026Tetracyclines4-差向脫水四環(huán)素4-Epianhydrotetracycline7.10427.1499898.06004239.07030321.0757027(四環(huán)素類,8種)4-差向四環(huán)素鹽酸鹽4-Epitetracyclinehydrochloride5.10445.16054410.12343201.0910198.0600428金霉素Chlortetracycline6.60479.12157462.09502444.08446154.0498729去甲基金霉素Demeclocyclin5.59465.10592448.07937430.06881154.0498730多西環(huán)素Doxycycline6.32445.16054428.13399321.07575267.0651831土霉素Oxytetracycline5.15461.15546426.11834337.07066283.0601032四環(huán)素Tetracycline5.50445.16054410.12343154.0498798.0600433美他環(huán)素Methacycline6.56443.14489426.11834201.05462-34Quinolones西諾沙星Cinoxacin7.27263.06625235.07133217.06077207.0400335(喹諾酮類,15種)環(huán)丙沙星Ciprofloxacin5.17332.14050288.15067245.10847231.0928236達(dá)氟沙星Danofloxacin5.00358.15615314.16632283.12412257.1075037雙氟沙星Difloxacin5.70400.14672356.15689299.09905-38依諾沙星Enoxacin4.60321.13575277.14592257.13969234.1037239恩諾沙星Enrofloxacin5.66360.17180316.18197245.10847203.0615040氟羅沙星Fleroxacin4.80370.13730326.14747269.08962-41氟甲喹Flumequine9.40262.08740244.07683220.04045-42洛美沙星Lomefloxacin5.00352.14672308.15690265.11470251.0990543麻保沙星Marbofloxacin4.60363.14631320.1041172.08078-44萘啶酸Nalidixicacid9.22233.09207205.06077187.05020-45諾氟沙星Norfloxacin4.70320.14050276.15067233.10847256.1444446氧氟沙星Ofloxacin4.80362.15106318.16123261.10338-47培氟沙星Pefloxacin4.80334.15615290.16632233.10847-48沙拉沙星Sarafloxacin6.20386.13107342.14030299.09810322.1333049Macrolide交沙霉素Josamycin8.92828.47400174.11247109.06479600.3378450(大環(huán)內(nèi)酯類,6種)吉他霉素Kitasamycin8.60786.46343558.32727174.11247109.0647951替米考星Tilmicosin6.20869.57332174.1124788.07569126.1274052羅紅霉素Roxithromycin9.10837.53185679.43755158.11756116.1069953泰妙菌素Tiamulin9.00494.32986192.10528119.01613-54泰樂菌素Tylosin7.50916.52643772.44778174.1124788.0756955Lincosamides林可霉素Lincomycin4.00407.22103126.12773359.21766-56(林可胺類,2種)克林霉素Clindamycin6.00425.18715126.12772377.18378-57Chloramphenicols氟苯尼考Florfenicol7.40355.99319335.98696185.02779119.0502458(氯霉素類,3種)甲砜霉素Thiamphenicol5.70353.99752290.02593185.02779119.0502459氯霉素Chloramphenicol7.60321.00505257.03346194.04588176.0353260β-Lactam阿莫西林Amoxicillin3.58366.11182208.04267134.06004114.0008161(β-內(nèi)酰胺類,2種)苯唑西林Oxacillin9.76402.11182243.07642160.04268144.0443962Nitroimidazoles甲硝唑Metronidazole4.24172.07167128.0454582.02874-63(硝基咪唑類,2種)羥基甲硝唑Metronidazole-hydroxy3.70188.06658144.04037126.02980123.0552964Benzimidazoles阿苯達(dá)唑Albendazole7.90266.09577234.06956191.01478159.0427165(苯并咪唑類,7種)阿苯達(dá)唑亞砜Albendazolesulfoxide5.82282.09069240.04374208.01752191.0147866奧吩達(dá)唑Oxfendazole6.80316.07504284.04882223.05760191.0325467氟苯達(dá)唑Flubendazole8.70314.09355282.06733123.02470-682-氨基氟苯咪唑2-Amino-flubendazole6.60256.08807123.02407113.03972133.0634569甲苯達(dá)唑Mebendazole8.30296.10297264.07675105.0334995.0491470噻苯達(dá)唑Thiabendazole4.40202.04334175.03244131.06037-71Quinoxalines(喹啉類,4種)3-甲基喹啉-2-羥酸3-Methyl-quinoxaline-2-carboxylicacid6.63189.06585145.07602118.0651392.0494872乙酰甲喹Mequindox6.00219.07642143.06037185.07094160.0631173喹乙醇Olaquindox3.82264.09788246.08732202.06110177.0658574喹烯酮Quinocetone9.77307.10772103.05423131.04941143.06037

*no data

2.3 方法的線性關(guān)系

高分辨質(zhì)譜可以提供待測組分可能的元素組成，僅需采用全掃描并提取精確質(zhì)量數(shù)色譜圖即可完成定性定量，利用自動觸發(fā)的二級質(zhì)譜采集完成準(zhǔn)確定性[28]。因此，在檢出限濃度下，只要保證多種藥物能夠全部檢出并能準(zhǔn)確定性即可，樣品基質(zhì)效應(yīng)基本可以忽略。本實驗采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線法或單點法進(jìn)行定性定量。

將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液用初始流動相稀釋成質(zhì)量濃度為2、5、10、20、50、100、500、1 000、2 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，按照本方法進(jìn)行檢測，以待測物的分子離子峰面積對其質(zhì)量濃度(ng/mL)進(jìn)行線性回歸，獲得各目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,74種化合物在各自區(qū)間內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)r2>0.99(見表2)。

表2 74種目標(biāo)藥物的相關(guān)系數(shù)、線性范圍及在檢出限加標(biāo)濃度下的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)Table 2 Correlation coefficients,linear ranges,recoveries and relative standard deviations(RSD) at LOD spiked level of 74 targeted compounds

(續(xù)表2)

Compoundr2Linearrange(ng/mL)Recovery(%)RSD(%)Sarafloxacin0.99812～50066.68.0Sulfabenzamide0.99672～100084.96.9Sulfacetamide0.99682～50098.115Sulfachloropyridazine0.99922～100074.411Sulfadiazine0.99762～10001029.0Sulfadimethoxine0.99822～100099.65.1Sulfadoxine0.99942～100090.011Sulfaguanidine0.99902～50039.811Sulfalen0.99942～100086.020Sulfamerazine0.99872～10001459.4Sulfameter0.99652～100064.720Sulfamethazine0.99922～100011210Sulfamethizole0.99912～100065.812Sulfamethoxazole0.99932～100065.36.4Sulfamethoxypyridazine0.99532～100084.02.6Sulfamonomethoxine0.99902～10001157.9Sulfamoxol0.99752～10001193.7Sulfanitran0.99782～100076.15.9Sulfaphenazole0.99852～10001084.9Sulfapyridine0.99762～100095.84.4Sulfaquinoxaline0.99862～100087.84.9Sulfathiazole0.99602～10001234.9Sulfisomidine0.99512～2001205.0Sulfisoxazole0.99912～100075.45.4Tetracycline0.99142～5001068.3Thiabendazole0.99622～20075.29.2Thiamphenicol0.99052～5069.413Tiamulin0.99752～100071.19.2Tilmicosin0.99065～50066.021Trimethoprim0.99232～10063.79.4Tylosin0.99342～100091.59.0

2.4 假陰性率與檢出限

根據(jù)FDA-SANTE/11813/2017,定性篩選法的檢出限是在至少95%的樣品中檢測到分析物的最低含量水平[27]。基于檢出限的篩查方法驗證應(yīng)分析至少20個檢出限加標(biāo)量的樣品。經(jīng)實驗考察，在10 ng/mL加標(biāo)量下，20個平行樣品中74種藥物均能檢出，滿足假陰性率<5%的要求，因此確定檢出限為10 ng/mL?？瞻讟悠吩跈z出限加標(biāo)量下的回收率見表2，74種藥物的回收率集中在55.8%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～21%。由于本方法僅用于定性分析，因此對分析物的回收率無要求[27]。

2.5 實際樣品的檢測

圖1 實際樣品中檢出藥物的提取離子色譜圖Fig.1 Extract ion chromatograms of the detected compounds in real samplesA:oxytetracycline,B:3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid,C:olaquindox,D:chlortetracycline,E:amoxicillin,F:trimethoprim,G:albendazole sulfoxide

3 結(jié) 論

本文利用四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜可在單次分析中迅速篩選數(shù)百種不同化合物的高分辨率優(yōu)勢，建立了豬尿中10類74種抗生素及其他化合物的UPLC-Q-Exactive Orbitrap快速篩查和確證方法。該方法快速簡便、準(zhǔn)確度高，有效提高了檢測效率，適用于豬尿中多種抗生素及其他化合物的快速定性確證，為養(yǎng)殖業(yè)藥物使用情況的監(jiān)管提供了有力的技術(shù)支持。