閔行地區(qū)PRRSV的分離鑒定及N基因序列分析

邢濤　郁星星　張峻　周光勝　張紅飛　朱愛軍

摘要：采集閔行地區(qū)規(guī)模豬場(chǎng)疑似PRRS陽(yáng)性病料，在Marc-145細(xì)胞上進(jìn)行病毒分離，采用RT-PCR擴(kuò)增PRRSV高度保守的N基因并測(cè)序。結(jié)果表明，成功分離到6株P(guān)RRSV，為研究閔行地區(qū)PRRSV流行株分子變異和致病機(jī)理提供了良好的生物素材。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；N基因；分離與鑒定；序列分析

中圖分類號(hào)：S828 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）04-0704-03

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）又稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的豬的烈性傳染病，是全球養(yǎng)豬行業(yè)最重要的疾病[1，2]。研究表明，ORF7編碼的核衣殼N蛋白在同型的不同毒株中最為保守，是PRRSV免疫原性最強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白[3，4]，Lee等[5]研究表明N蛋白的核定位與病毒的持續(xù)感染或選擇變異具有一定相關(guān)性，在病毒的免疫逃避中扮演著重要角色，因此，N蛋白以其高度的保守性和強(qiáng)大的免疫原性成為診斷PRRS的首選蛋白。本研究克隆并測(cè)序其相對(duì)保守的N基因，通過(guò)序列分析軟件與國(guó)內(nèi)外參考毒株進(jìn)行推導(dǎo)氨基酸序列比較以及同源比對(duì)分析，探討閔行地區(qū)PRRSV優(yōu)勢(shì)流行毒株的類型，以期為科學(xué)預(yù)防PRRS提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 試驗(yàn)樣品為2015年采集閔行地區(qū)正義牧場(chǎng)（疫苗株Ingelvac PRRS MLV）、中南牧場(chǎng)（疫苗株TJM-F92）兩個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)發(fā)生高熱、咳喘、繁殖障礙等豬繁殖與呼吸綜合征疑似病豬的肺臟、脾、扁桃體。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基為Gibeo公司產(chǎn)品；Trizol、dNTPs、pMD18-T、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒為Fermentas公司產(chǎn)品；M-MLV Reverse Transcriptase為Promega公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物 根據(jù)李鵬等[6]的研究設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成，引物序列為：上游引物P1：5-GCGGATCCCCAAATAACAAC GGCAAGC-3，下游引物P2：5-GCAAGCTTCACCA TGCTGAGGGTGATG-3，預(yù)期擴(kuò)增基因片段為372 bp。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 按照Trizol reagent試劑盒說(shuō)明書提取病毒RNA，加入20 μL DEPC水溶解RNA，同時(shí)設(shè)未接種病毒的細(xì)胞作陰性對(duì)照。

1.2.2 N基因的RT-PCR擴(kuò)增 按照One Step RT-PCR Kit說(shuō)明進(jìn)行cDNA合成，以合成的cDNA為模板擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)體系為cDNA 0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，rTaq酶0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，ddH2O 18.5 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3 目的基因克隆、鑒定與測(cè)序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按Fermentas膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行回收純化，與pMD18-T載體連接，堿裂解法提取質(zhì)粒，BamH Ⅰ+Hind Ⅲ酶切鑒定后由寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.4 序列分析 對(duì)測(cè)序得到的基因序列利用MegAlign軟件進(jìn)行分析[7]，與國(guó)內(nèi)第一分離株CH-1a、河北分離株HB-2、美洲型參考毒株JXA1、美洲型經(jīng)典株VR-2332及歐洲經(jīng)典株LV進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，并與參考毒株進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴(kuò)增與重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)與預(yù)期片段大小相符的條帶，約372 bp（圖1）， 陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定后，得到預(yù)期大小372和2 690 bp的條帶（圖2）。

2.2 基因序列測(cè)定

將含有N基因的陽(yáng)性質(zhì)粒送至寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明，測(cè)序序列確為PRRSV核蛋白N基因序列，該基因全長(zhǎng)372 bp，不存在缺失現(xiàn)象，編碼123位氨基酸，將其命名為MH1、MH2、MH3、MH4、MH5和MH6株。

2.3 氨基酸序列分析

ORF7編碼的N蛋白基因是PRRSV所有基因中最高度保守的[8]，但通過(guò)對(duì)N基因推導(dǎo)氨基酸序列分析表明，MH1-6株與JXA1株N基因氨基酸序列完全一致，與VR-2332株相比發(fā)生的氨基酸位點(diǎn)突變?yōu)椋?1R→K、15D→N、46K→R、91T→A、109H→Q、117V→A與CH-1a株相比發(fā)生了6個(gè)氨基酸位點(diǎn)的點(diǎn)突變：9R→Q、46K→R、49S→N、91T→A、109H→Q、117V→A與HB-2株相比發(fā)生了10個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變：11R→Q、15D→N、46N→R、48R→K、49S→N、61E→D、91S→A、101A→T、109H→Q、117V→A（圖3）。

2.4 同源比對(duì)分析

運(yùn)用DNAMAN軟件對(duì)已獲得的6個(gè)N基因序列與其他參考毒株進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明，MH1、MH2、MH3、MH4、MH5和MH6株之間同源性高達(dá)100%，說(shuō)明各分離株之間N基因高度同源。MH1-6株與VR2332、CH-1a、HB-2株的同源性為91.9%～95.1%，與JXA1株的同源性高達(dá)100%，而與歐洲型代表株LV株的同源性為43.7%，表明閔行地區(qū)分離到的6株P(guān)RRSV毒株與JXA1變異株高度同源。

3 小結(jié)與討論

序列分析表明，閔行地區(qū)PRRSV毒株N基因編碼的氨基酸序列與國(guó)內(nèi)分離的PRRSV非變異株（CH-1a和HB-2）氨基酸序列相比存在著一定的共同點(diǎn)突變，這種一致性的共同點(diǎn)突變?yōu)?6K（N）→R、91T（S）→A、109H→Q、117V→A，然而這種一致性的點(diǎn)突變差異是否與閔行地區(qū)PRRSV毒株的毒力有關(guān)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

同源分析表明，6株閔行分離株N基因序列之間同源性高達(dá)100%，提示閔行地區(qū)分離到的PRRSV毒株遺傳關(guān)系很近，很可能處于同一遺傳進(jìn)化分支。MH1-6株與美洲型參考毒株JXA1變異株同源性高達(dá)100%，而與歐洲型經(jīng)典株LV株的同源性僅為43.7%，提示閔行分離株可能為美洲型HP-PRRSV變異毒株，因此，對(duì)閔行地區(qū)進(jìn)行PRRSV分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)對(duì)PRRS防控具有重要意義[9]。

從閔行地區(qū)分離到的MH1、MH2、MH3、MH4、MH5和MH6毒株在豬繁殖與呼吸綜合征研究中具有一定的代表作用，本研究得到了6株毒株N基因序列，不僅進(jìn)一步豐富中國(guó)PRRSV序列數(shù)據(jù)庫(kù)，而且可以通過(guò)與其他分離株進(jìn)行比較來(lái)發(fā)現(xiàn)病毒的變異機(jī)制，找出與毒力相關(guān)的基因特征，從而為閔行地區(qū)PRRS的診斷和防制提供理論依據(jù)[10，11]。

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