一貫煎“異病同治”的網(wǎng)絡藥理學分析＊

楊夢蝶，蔡菲菲，武 容，陳曉樂，潘秋莎，胡元佳，蘇式兵＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學中醫(yī)復雜系統(tǒng)研究中心 上海 201203；2.澳門大學中藥質量研究國家重點實驗室 澳門 999078）

一貫煎（散劑）出自《柳洲醫(yī)話》，是清代魏之秀之方，由北沙參（三錢）、麥冬（三錢）、當歸（三錢）、生地黃（十錢）、川楝子（一錢半）、枸杞子（四錢）六味中藥組成。本方重用生地黃，重滋補，輕柔肝理氣，主治肝腎陰虛，肝氣不舒之證。證見胸脘脅痛，吞酸吐苦，咽干口燥，舌紅少津，脈細弱或虛弦。近年來，研究者們開展了一貫煎對多種疾病的臨床和實驗研究[1,2]，但其“異病同治”的療效機制尚未解明。中藥復方不同于天然藥物或西藥，是多成分、多靶點、多途徑和多效應[3]的復雜系統(tǒng)。因此，需要適合的技術和方法來探討中藥復方的復雜作用機制。

網(wǎng)絡藥理學作為新興的學科，是從系統(tǒng)生物學和生物網(wǎng)絡平衡的角度闡釋疾病的發(fā)生發(fā)展過程、從改善或恢復生物網(wǎng)絡平衡的整體觀角度認識藥物與機體的相互作用并指導新藥發(fā)現(xiàn)的[4]。其通過公共數(shù)據(jù)庫和公開發(fā)表的數(shù)據(jù)，建立特定藥物作用機制網(wǎng)絡預測模型，或進行大通量檢測獲取相關信息，并采用生物信息學的手段分析和構建藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡等，解析藥物的網(wǎng)絡藥理學機制，預測潛在治療疾病及相關作用靶點和通路等，在探索中藥復方治療疾病的作用機制和新藥的發(fā)現(xiàn)有廣闊的前景。本研究旨在通過網(wǎng)絡藥理學技術構建一貫煎成分-靶點-疾病網(wǎng)絡，分析一貫煎的作用靶點、生物過程和通路，預測其治療不同疾病肝腎陰虛證“異病同治”的機制及新的臨床適應病癥，并為發(fā)現(xiàn)新的藥物提供線索。

1 方法

1.1 一貫煎成分、靶點及疾病查詢與篩選

運用中藥綜合數(shù)據(jù)庫TCMSP[5]（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）、TCM database@Taiwan[6]（http://tcm.cmu.edu.tw）、TCMID[7]（http://www.megabionet.org/tcmid）、HIT[8]（http://lifecenter.sgst.cn/hit）以及化學數(shù)據(jù)庫TTD（http://bidd.nus.edu.sg/group/TTD/ttd.asp）查找一貫煎中北沙參、麥冬、當歸、生地黃、枸杞子、川楝子的所有化學成分。然后，在TCMSP和Drugbank[9]（http://www.drugbank.ca）中查找化學成分對應的靶點和疾病，去除無靶點對應的化學成分，刪除重復的靶點和疾病。而且，運用PubChem[10]（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）尋找化學成分的別名。

1.2 口服生物利用度和類藥性指數(shù)篩選

口服生物利用度[11,12]（Oral bioavailability，OB）是指經(jīng)口服途徑給藥后藥物吸收進入全身血液循環(huán)的相對量。它是藥物特性中最重要的藥代動力學參數(shù)之一。類藥性指數(shù)[13]（Drug-likeness，DL）是化合物與Drug?bank數(shù)據(jù)庫里已知藥物的相似性。具有類藥性的化合物并不是藥物，但是具有成為藥物的可能，這一類化合物稱為類藥性分子或藥物類似物分子。本研究中，我們在TCMSP中找到各個化學成分的口服生物利用度（OB）和類藥性指數(shù)（DL），并篩選出其中OB≥30%并且DL≥0.18的成分作為活性成分。

1.3 網(wǎng)絡構建與數(shù)據(jù)分析

通過Uniprot[14]數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）查找靶點的基因名稱和編號，再運用Cytoscape[15]3.4.0軟件構建：①一貫煎中藥成分-靶點的網(wǎng)絡：每個化學成分和其作用靶點通過直線連接起來；②一貫煎中藥成分-靶點-疾病的網(wǎng)絡：靶點與其對應的疾病通過直線連接起來，通過靶點，中藥成分與疾病連接起來。網(wǎng)絡圖中代表化學成分、靶點、疾病的點稱為節(jié)點。并運用Cytoscape3.4.0中的插件Network Analyzer分析兩個重要拓撲參數(shù)：節(jié)點度（Degree）和中介中心度（Between?nessCentrality）。

1.4 通路分析

運用David[16]在線軟件（https://david.ncifcrf.gov/）對一貫煎靶點的GO生物學過程（Gene Ontology Biologi?cal Process，GO-BP）和KEGG通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway，KEGG Pathway）進行富集分析。

2 結果

2.1 一貫煎化學成分篩選

經(jīng)過五個數(shù)據(jù)庫的查詢，我們查找出各個中藥含有化學成分分別為北沙參122個、麥冬95個、當歸288個、生地黃71個、枸杞子212個、川楝子61個，其中有靶點對應并且有OB和DL值記錄的北沙參化學成分有54個，麥冬11個，當歸220個，生地黃37個，枸杞子199個，川楝子43個。經(jīng)OB（≥30%）、DL（≥0.18）篩選后，一貫煎一共有活性成分49個（表1），其中北沙參7個，當歸3個，生地黃1個，川楝子2個，枸杞子29個，另外異珊瑚菜素（Cnidilin）是北沙參、當歸的共同化學成分，β共谷甾醇（beta-sitosterol）是北沙參、麥冬、生地黃、當歸、枸杞子的共同化學成分，豆甾醇（Stigmaster?ol）是北沙參、麥冬、當歸、川楝子、枸杞子的共同化學成分，槲皮素（quercetin）是北沙參、川楝子、枸杞子的共同化學成分，菜油甾醇（campesterol）是生地黃、枸杞子的共同化學成分，十八碳-6,9-二烯酸乙酯（Mande?nol）和亞麻酸乙酯（Ethyl linolenate）是川楝子、枸杞子的共同化學成分。

2.2 中藥成分-靶點的網(wǎng)絡構建與分析

在Drugbank和TCMSP數(shù)據(jù)庫中查詢篩選出的49個一貫煎活性成分，找到200個對應的靶點。運用Cy?toscape軟件，構建一貫煎成分-靶點網(wǎng)絡（圖1A）。該網(wǎng)絡中有417條邊，代表成分和靶點的相互作用關系。網(wǎng)絡中的249個節(jié)點里有49個代表成分，成分節(jié)點平均度為8.51，大于平均節(jié)點度的成分有9個成分；代表靶蛋白的節(jié)點為200個，其節(jié)點平均度為2.09，大于平均節(jié)點度的靶蛋白有30個。根據(jù)這9個成分和30個靶蛋白的相互關系，構建一貫煎成分-靶點核心網(wǎng)絡（圖1B）。

圖1中淺藍色三角代表北沙參獨有成分；深藍色三角代表當歸獨有成分；紫色三角代表生地黃獨有成分；紅色三角代表川楝子獨有成分；黃色三角代表枸杞子獨有成分；綠色橢圓代表北沙參、當歸共有成分；淺藍色橢圓代表北沙參、麥冬、生地黃、當歸、枸杞子共有成分；深藍色橢圓代表北沙參、麥冬、當歸、川楝子、枸杞子共有成分；紫色橢圓代表北沙參、川楝子、枸杞子共有成分；紅色橢圓代表生地黃、枸杞子共有成分；黃色橢圓代表川楝子、枸杞子共有成分；深藍色方塊代表靶點。

2.3 中藥成分-靶點-疾病網(wǎng)絡構建與分析

為了闡明一貫煎多成分、靶標以及疾病之間的相互關系，我們在TCMSP數(shù)據(jù)庫中查找出靶點相關疾病264個，用Cytoscape軟件，構建一貫煎成分-靶點-疾病網(wǎng)絡（圖2A），網(wǎng)絡中有915條邊，代表中藥成分、靶點

個節(jié)點代表疾病，平均節(jié)點度為3.47，大于平均節(jié)點度的有28個疾病。我們分別篩選同時大于中介中心性（BetweennessCentrality）、接近中心性（ClosenessCen?trality）平均值和平均節(jié)點度的節(jié)點，并將兩者一起與上述大于平均節(jié)點度的節(jié)點做交集，得到6個活性成分，包括松柏苷（coniferin）、阿托品（Atropine）、黃豆黃素（glycitein）、β胡蘿卜素（beta-carotene）、β谷甾醇（be?ta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol），42個靶點，28個疾病。構建中藥成分-靶點-疾病核心網(wǎng)絡（圖2B）。圖中圖標越大表示節(jié)點度越大，邊線越粗表示邊介數(shù)越大。

表1 一貫煎的活性成分

圖1 一貫煎成分-靶點網(wǎng)絡

圖2 一貫煎中藥成分-靶點-疾病網(wǎng)絡

2.4 基于中藥作用靶點的疾病預測

運用Cytoscape軟件的NetworkAnalyzer工具分析一貫煎中藥成分-靶點-疾病網(wǎng)絡中疾病節(jié)點的網(wǎng)絡拓撲參數(shù)，根據(jù)中介中心度和節(jié)點度篩選出前十五位疾?。ū?），其中癌癥是一貫煎顯著相關的疾病，有13個靶點，包括前列腺素G/H合成酶2、細胞分裂蛋白激酶2、尿激酶型纖溶酶原激活劑、表皮生長因子受體、轉錄因子AP-1、間質膠原酶等。檢索文獻可以找到關于一貫煎用于治療原發(fā)性肝癌[17]、肺癌[18,19]、乳腺癌[20,21]、炎癥[22-24]、焦慮癥[25]、抑郁癥[25-27]、帕金森病[28,29]以及非胰島素依賴型糖尿病[25]的報道，但尚未發(fā)現(xiàn)有關阿爾茲海默病、精神分裂癥、心血管疾病、哮喘、骨關節(jié)炎、心肌梗死、類風濕性關節(jié)炎、疼痛以及慢性阻塞性肺疾病等的報道。此外，我們的預測還發(fā)現(xiàn)一貫煎可用于治療可卡因等藥物依賴性癥狀，這將對藥物及毒品成癮的戒斷治療提供思路。

表2 一貫煎中藥成分-靶點-疾病網(wǎng)絡的拓撲參數(shù)和文獻來源

2.5 生物學過程及通路

通過DAVID在線軟件對一貫煎的生物學過程和通路進行富集分析，得到533個GO生物學過程，KEGG通路有120條，表3分別列舉了顯著富集的前15個生物學過程：藥物應答、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、積極調節(jié)轉錄，DNA模板、缺氧的細胞應答、缺氧應答、老化、雌二醇應答、血管收縮的正調節(jié)、細胞增殖的正調控、基因表達的正調控、凋亡過程的負調控、脂多糖、對有毒物質的反應、炎性反應以及腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路，和前15條KEGG通路：癌癥通路、乙型肝炎、前列腺癌、膀胱癌、TNF信號通路、胰腺癌、非小細胞肺癌、蛋白多糖與癌癥、恰加斯?。乐掊F蟲病）、結直腸癌、小細胞肺癌、HIF-1信號通路、利什曼病、子宮內(nèi)膜癌以及甲狀腺激素信號通路。

3 討論

中藥復方以“多成分、多靶點、多途徑和多效應”為特征，被廣泛用于治療慢性復雜疾病，但在機理解釋，特別是在分子水平上系統(tǒng)地評價療效方面都具有挑戰(zhàn)性[30]。近年來，隨著網(wǎng)絡藥理學的發(fā)展，應用大量已經(jīng)證實報道的數(shù)據(jù)及大通量檢測的信息，將已知中藥成分與疾病藥物靶點聯(lián)系起來，從而揭示中藥復方治療疾病的復雜關系[31]，對預測中藥復方治療的潛在疾病、闡述療效機制具有重要意義。

古方一貫煎主要用于治療各種疾病出現(xiàn)胸脘脅痛，吞酸吐苦，咽干口燥，舌紅少津等癥狀的肝腎陰虛之證，這是中醫(yī)臨床“異病同治”的依據(jù)。我們通過構建中藥成分-靶點-疾病網(wǎng)絡，進行了一貫煎“異病同治”網(wǎng)絡藥理學的分析，預測出一貫煎可能治療的疾病有癌癥、精神分裂癥、心血管疾病、焦慮癥、炎癥、抑郁癥、肝纖維化、肝硬化、卵巢早衰等。其中，一貫煎與癌癥、精神系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病以及各種炎癥相關性較大。在癌癥中，乳腺癌、胰腺癌、肺癌節(jié)點度較高。這些大多被現(xiàn)代臨床和實驗研究所證實，能夠治療或緩解很多疾病或癥狀。其中，一貫煎治療乳腺癌更年期患者三個月后，潮熱盜汗、煩躁、抑郁等癥狀較治療前顯著減輕[19]。張等[24]發(fā)現(xiàn)一貫煎能明顯改善非小細胞肺癌NP方案化療后的肝腎功能和生活質量。治療伴焦慮抑郁癥狀的2型糖尿病兩個療程后，能顯著改善血糖水平和抑郁焦慮自評分[25]。治療帕金森綜合征三個月后治療組的Webster和UPDERS評分較對照組低，且有統(tǒng)計學差異[27]。

表3 顯著富集的15條GO生物學過程和KEGG通路

在實驗研究方面，通過對大鼠肝臟組織的膠原面積評比判定肝纖維化程度，發(fā)現(xiàn)與模型組相比一貫煎能夠顯著改善大鼠肝纖維化程度（P＜0.05）[32]。謝等[33]發(fā)現(xiàn)一貫煎能夠顯著提高H22荷瘤小鼠肝癌的抑瘤率并明顯減少血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）蛋白表達（P＜0.05）。研究還顯示一貫煎能明顯改善肝腎陰虛絕經(jīng)前后的焦慮癥狀[34]。而且，通過測定大鼠血清III型前膠原（PCIII）、透明質酸酶（HA）、層粘連蛋白（LN）、IV型膠原（CIV）等肝纖維化指標發(fā)現(xiàn)一貫煎具有減輕肝組織病理損害、延緩肝纖維化進展[35]，并通過提高肝臟生物轉化功能、抑制肝臟炎癥反應、抑制肝細胞凋亡和肝星狀細胞活化、抑制肝竇內(nèi)皮損傷、改善肝臟糖代謝及水鈉潴留等多種途徑，抑制CCl4誘導大鼠肝硬化形成[36]，還能夠提高2型糖尿病患者自我效能并降低胰島素抵抗[37]。另外，一貫煎可以顯著提高卵巢早衰大鼠血清中E2、ββ中衰水平，降低卵泡刺激素（FSH）水平（P均＜0.05），從而治療卵巢早衰[38]。

本研究通過對一貫煎的網(wǎng)絡藥理學預測，獲得了6個活性成分（松柏苷、阿托品、黃豆黃素、β胡蘿卜素、谷甾醇以及豆甾醇），為進一步探討這些天然化合物“異病同治”的效應提供了線索。而且，通過預測的活性成分和藥物靶點，從GO生物學過程和KEGG通路兩方面，進一步分析了一貫煎“異病同治”的機制。富集的生物學過程有藥物應答、RNA聚合酶II啟動子、轉錄的正調控、DNA模板、缺氧的細胞應答等。富集的通路有癌癥通路、乙型肝炎通路、腫瘤壞死因子信號通路等，提示了一貫煎“異病同治”的機制可能通過調控癌癥通路、乙型肝炎通路、腫瘤壞死因子信號通路以及缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路等影響肝腎陰虛證型的癌癥、精神疾病、心血管疾病和炎癥性疾病等的生物學過程。而且，前期研究報道一貫煎抑制CCl4誘導大鼠肝細胞凋亡[36,39]，也證實了一貫煎能夠負調控凋亡過程的預測。

另外，還有關于一貫煎可以用于治療干燥綜合征皮膚病[40]、高血壓[41]、高脂血癥[42]以及婦科疾病[26,34,42,43]等的研究報道，但這些研究結果未在本次預測研究中體現(xiàn)出來，提示使用現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進行網(wǎng)絡藥理學預測的局限性。

4 結論

對一貫煎“異病同治”的網(wǎng)絡藥理學分析有助于識別其有效活性成分及作用靶點，解釋作用機制，為發(fā)現(xiàn)新的臨床適應病癥提供可能。但是，由于藥物成分、靶點、疾病數(shù)據(jù)庫的不完善，以及方藥劑量研究缺乏導致的以生物利用度和類藥性指數(shù)篩選活性成分的方法無法將化學成分在藥材中的含量考慮在內(nèi)，中藥網(wǎng)絡藥理學的應用仍有不少缺陷，這些都需要我們不斷完善，并進行后續(xù)臨床試驗及實驗驗證。

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