甘草斷面顏色與其有效成分的相關(guān)性分析＊

米文娟，林相龍，李 陽，陳慧榮，閆永紅＊＊，鄒慧琴＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102488；2.北京寶德潤生醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司 北京 100088）

歷代本草對甘草的性狀鑒別以“皮細(xì)緊，色紅棕，質(zhì)堅實，斷面顏色黃色，粉性足、橫紋等”為佳[1]。從顏色角度講，甘草“斷面顏色黃色”為甘草質(zhì)優(yōu)的性狀評價指標(biāo)之一，但是顏色究竟黃到什么程度才算佳品？藥材個體差異和鑒別人員對色澤細(xì)微差別的不敏感性等，都會導(dǎo)致感官評價的不確定性和模糊性，因此，本研究以甘草為模型藥物，運用色度計將甘草斷面顏色進行量化。而藥材的顏色往往與內(nèi)在成分的含量有著密切聯(lián)系，甘草主要化學(xué)成分黃酮、三萜皂苷和多糖類化合物具有清熱解毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等作用[2-5]，故采用高效液相色譜法（HPLC）、紫外分光光度法（UV）等對甘草中的甘草苷、甘草酸、總黃酮、總皂苷和多糖相應(yīng)進行含量測定，研究甘草斷面顏色與有效成分之間的變化規(guī)律，以探討顏色數(shù)字化測定的可行性和顏色特性與中藥質(zhì)量評價的相關(guān)性，揭示傳統(tǒng)中藥材性狀鑒別的科學(xué)性。色度現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中藥領(lǐng)域的顏色測定[6-12]，常用評價系統(tǒng)為CIE1976 L*a*b*標(biāo)準(zhǔn)色度系統(tǒng)，其中L*表示明度，a*和b*表示不同的色調(diào)方向。

L*：值越大明度越大，感覺越白；反之越暗。a*：表示紅綠方向，+a*表示紅方向，-a*表示綠方向。b*：表示黃藍(lán)方向，+b*表示黃方向，-b*表示藍(lán)方向。ΔE*ab={(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2}1/2:ΔE*ab為色差，通常認(rèn)為其小于或等于1時，人眼將無法分辨兩種顏色的差異。

1 材料

收集來自甘肅西部地區(qū)、內(nèi)蒙古杭錦旗地區(qū)、內(nèi)蒙古通遼、赤峰地區(qū)野生及栽培甘草樣品共34批，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系閆永紅教授鑒定為豆科植物甘草G.uralensis Fisch.的干燥根及根莖。甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，生產(chǎn)批號110731-200615，供含量測定用，含量按93.1%計，甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207），甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，生產(chǎn)批號111610-201005，含量＞98.0%，供含量測定用），D-葡萄糖（北京拜爾迪生物公司，分析純，含量＞=99.5%），氫氧化鉀（上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站，批號63-07-28，含量＞=82.0%），香草醛（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號20110907，含量＞=99.0%），乙腈（賽默飛世爾科技（中國）有限公司，色譜純），甲醇、乙醇、磷酸、硫酸、冰醋酸（北京化工廠，分析純），苯酚（北京博奧拓達(dá)科技有限公司，分析純），水為屈臣氏純凈水。

表1 梯度洗脫中流動相的比例

圖1 甘草藥材中甘草酸、甘草苷HPLC色譜圖

Agilent 1100型高效液相色譜儀，DAD檢測器，Ag?ilent 1100色譜工作站；0.45 μm針筒式微孔濾膜過濾器；DIKMA Platisil ODS色譜柱（5 μm，250×4.6 mm）；BP211D型萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)。日立U-3010型紫外-可見分光光度計；DZKW-C電子恒溫水浴（北京光明醫(yī)療儀器廠）。

2 方法

2.1 斷面顏色測定方法[12]

2.1.1 樣品制備

將甘草切成長約2 cm的小段，對甘草段施以壓力令表皮脫落，將去皮的甘草段打粉，過3號篩，粉末置于自制玻璃測色皿中，蓋上石英鏡片，以測色皿中粉末不隨意晃動為準(zhǔn)。

2.1.2 顏色測定條件

采用日立3010紫外可見分光光度計進行測量，測量起止波長：380-780 nm；狹縫寬度：1 nm；照明光源：D65；視場選擇：10度視角；掃描速度：600 nm·min-1。

2.1.3 色度計測定穩(wěn)定性考察

隨機取杭錦旗野生樣品5份，按上述方法制備測量，結(jié)果顯示RSD均小于3%，結(jié)果間ΔE*ab均小于1，ΔE*ab平均值=0.52，色差低于人眼可變辨范圍。表明結(jié)果穩(wěn)定。

2.2 HPLC測定甘草苷、甘草酸[13]

2.2.1 甘草酸及甘草苷含量測定方法

采用2015《藥典》甘草含量測定項下規(guī)定的甘草酸及甘草苷的含量測定方法，進行高效液相色譜測定。

2.2.2 色譜條件

流動相A為乙腈，B為0.05%磷酸水；梯度洗脫，比例見表1；檢測波長為237 nm，進樣量10 uL，分離結(jié)果見圖1。

2.2.3 供試品溶液制備

精密稱定甘草粉末（過三號篩）0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，密塞，稱重，超聲（功率250 W，頻率49 kHz）30 min，放冷后再次稱定重量并補足失重，搖勻濾過，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

精密稱定甘草苷、甘草酸銨對照品適量，加70%乙醇并稀釋至刻度，即得標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。該儲備液每1 mL含甘草苷0.0242 mg、甘草酸銨0.2012 mg（折合甘草酸為0.1971 mg）。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系考察

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品儲備液 2、5、7、10、12、15、17、20 μL，注入液相色譜儀，測定色譜峰峰面積。以對照品的量（μg）為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，甘草酸為：Y=491.1X+4.238（R2=0.999），線性范圍0.3942-3.942 μg；甘草苷為：Y=2 320X+83.34（R2=0.997），線性范圍0.048 4-0.484 μg。

2.2.6 精密度考察

將采集的甘草樣品進行編號，精密稱取16號甘草樣品0.2 g，按2.2.3方法制備測量，連續(xù)進樣5次。甘草苷、甘草酸峰面積RSD分別為0.585%、0.687%，表明該法精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性考察

精密稱取16號甘草樣品0.2 g，共5份。按2.2.3方法制備測定。甘草苷、甘草酸峰面積RSD分別為1.148%、1.692%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性考察

精密稱取16號甘草樣品0.2 g，按2.2.3方法制備測定，分別于0、4、8、12、24、48 h測定峰面積。甘草苷、甘草酸峰面積RSD分別為0.705%、1.164%，表明供試液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率考察

取已知含量的16號甘草樣品0.15 g，共5份，精密稱定。分別置具塞錐形瓶中，各加入甘草苷、甘草酸單銨鹽混合溶液2 mL（甘草酸濃度為1.704 1 mg?mL-1；甘草苷濃度為0.630 4 mg?mL-1），按2.2.3方法制備，并進行色譜條件測定。甘草酸，計算得率為99.25%，RSD為1.467%，符合要求；甘草苷，計算得率為99.81%，RSD為1.757%，符合要求。

2.3 比色法測定總皂苷

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

精密稱定甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品適量，甲醇溶解定容到25 mL容量瓶中，制得0.1016 mg?mL-1的對照品溶液，折合甘草酸為0.0995 mg?mL-1（甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207）

2.3.2 供試液的制備及測定

取干燥的甘草粉末約0.5 g，精密稱定，加70%乙醇50 mL，水浴回流2 h，回流液過濾，取濾液，并用70%醇反復(fù)沖洗濾渣至洗滌液無色透明，合并濾液減壓回旋至干，用0.5%氨水10 mL溶解過濾，精密移取濾液2 mL至10 mL離心管，用3.5 mol?L-1硫酸調(diào)節(jié)PH值至2-3，低溫離心，去除上清液，將沉淀用稀氨水溶解，如此“酸沉堿溶”操作重復(fù)4次后，將稀氨水溶解液定容至100 mL，即為供試液。供試液取0.5 mL于具塞比色管中，加80%乙醇0.5 mL、4.5%香草醛0.5 mL，冰水浴，再加78%硫酸5 mL，渦旋混勻，水浴加熱20 min，冷卻至室溫，在533 nm處測量吸光度。

2.3.3 線性關(guān)系的考察

精確吸取上述甘草酸對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，顯色后在533 nm處測量吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，對照品的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.010X－0.012（R2=0.999），線性范圍9.95-49.75 μg。

2.3.4 方法學(xué)考察

分別進行精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和加樣回收率考察，經(jīng)計算RSD值分別為0.784%、1.241%、0.752%、1.324%，平均回收率為98.384%。均符合條件。

2.4 紫外分光光度法測定總黃酮

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

取甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，用80%乙醇溶解定容至20 mL容量瓶中，得0.9832 mg?mL-1的對照品儲備液。

2.4.2 供試品溶液制備及測定

精密稱取甘草粉末250 mg，加25 mL 80%乙醇，稱重，超聲提取40 min，稱重，補足失重，過濾，取續(xù)濾液，即為供試液。精密吸取上述供試液0.5 mL，加入0.5 mL 80%乙醇、0.5 mL 10%KOH溶液，搖勻，室溫靜置5 min，用80%乙醇定容至10 mL。另取上述樣品溶液0.5 mL，直接用80%乙醇定容至10 mL，作為空白對照，于400 nm處測定吸光度。

2.4.3 線性關(guān)系考察

精確吸取上述甘草苷對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別加入80%乙醇1 mL、10%KOH溶液0.5 mL，混勻，室溫靜置5 min，用80%乙醇定容至10 mL，于400 nm處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，甘草苷的量(μg?mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y=0.021X－0.095(R2=0.998)，線性范圍為9.83-49.16 μg?mL-1。

2.4.4 方法學(xué)考察

分別進行精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和加樣回收率考察，經(jīng)計算RSD值分別為0.551%、0.734%、0.853%、1.655%，平均回收率為99.496%。均符合條件。

2.5 硫酸-苯酚比色法測定多糖

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

葡萄糖對照品適量，105℃干燥至恒重，精密稱量25.4 mg，置于250 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，混勻，得濃度為0.1016 mg?mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

2.5.2 甘草多糖提取與精制

稱取甘草粉末120 g，600 mL石油醚（60-90℃）回流提取2次，每次1 h，殘渣揮干溶劑，用600 mL 80%乙醇回流提取2次，每次2 h，殘渣揮干溶劑，再用700 mL水回流提取3次，每次2 h。合并提取液，減壓濃縮至300 mL，濃縮液用sevag法除蛋白，即氯仿：正丁醇（4∶1）多次萃取，萃取液加入95%乙醇約5倍量，使含醇量達(dá)80%，靜置。抽濾析出多糖，沉淀先后用無水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌，60℃真空干燥，得甘草多糖純品。

表2 甘草樣品斷面顏色測量指標(biāo)值

2.5.3 換算因子的測定

將2.5.2法精制得到的甘草多糖干燥至恒重，精密稱定10 mg，共3份，分別置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻備用。取此備用液1 mL依次加入1 mL蒸餾水、1 mL 50 g·L-1苯酚溶液，5 mL濃硫酸，混勻后水浴15 min，室溫冷卻25 min，測定吸收值，從回歸方程中求出供試液中葡萄糖濃度（C），按下式計算換算因子f=W/CD，W為多糖重量（μg），C為多糖液中葡萄糖濃度（μg?mL-1），D為多糖溶液稀釋因素，得f=2.120。

2.5.4 供試品溶液的制備及測定

精密稱取干燥至恒重的甘草樣品粉末約0.1 g，置于圓底燒瓶中，加入80 mL 80%乙醇，浸泡過夜，超聲30 min，過濾后藥渣繼續(xù)超聲30 min，過濾，藥渣揮干溶劑，用蒸餾水100 mL回流提取2 h，將回流液轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶，定容至刻度。取供試液1 mL依次加入1 mL蒸餾水、1 mL 50 g?L-1苯酚溶液，5 mL濃硫酸，混勻后水浴15 min，室溫冷卻25 min，在490 nm處測定吸光度。

2.5.5 線性關(guān)系的考察

精確量取葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于試管中，分別用蒸餾水補足至1 mL，加入1 mL苯酚溶液，搖勻，再加5 mL濃硫酸，使其充分混勻，室溫放置25 min。另取葡萄糖溶液1 mL于試管中，作為空白對照。于490 nm處測定吸收值，以吸收值（A）為橫坐標(biāo)，葡萄糖濃度（C）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.083X－0.033（R2=0.998）。線性范圍1.27-10.16 μg?mL-1。

2.5.6 方法學(xué)考察

分別進行精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和加樣回收率考察，經(jīng)計算RSD值分別為0.426%、0.454%、1.350%、0.67%，平均回收率為99.1%。均符合條件。

3 結(jié)果

3.1 甘草樣品顏色值的測量結(jié)果

按照2.1項方法，對34批甘草樣品分別進行顏色值的測量，每個樣品重復(fù)測定三遍，記錄顏色指標(biāo)的平均值，結(jié)果見表2。

3.2 甘草五種有效成分含量的測定結(jié)果

對甘草的甘草酸、甘草苷、總皂苷、多糖、總黃酮含量測定結(jié)果見下表3：

3.3 甘草有效成分含量與顏色指標(biāo)值相關(guān)性結(jié)果

將甘草有效成分含量分別與顏色指標(biāo)值L*、a*、b*相關(guān)聯(lián)，使用SPSS軟件做相關(guān)分析，相關(guān)結(jié)果見下表4、5、6、7、8：

表3 甘草五種有效成分含量

4 討論

結(jié)合表2、表3，發(fā)現(xiàn)甘草酸、甘草苷、總黃酮、總皂苷含量符合以下規(guī)律：質(zhì)量較優(yōu)＞質(zhì)量一般＞質(zhì)量較差樣品。多糖含量規(guī)律不明顯。單從斷面顏色來看，斷面顏色為黃色的樣品甘草酸等四種有效成分含量高于黃色偏白的樣品，這同傳統(tǒng)性狀鑒別中甘草斷面顏色越黃質(zhì)量越好的結(jié)論相符合。以上結(jié)論一定程度證明了傳統(tǒng)性狀顏色分類的可行性。

表4 甘草酸與L*、a*、b*相關(guān)系數(shù)表

表5 甘草苷與L*、a*、b*值相關(guān)系數(shù)表

表6 總黃酮與L*、a*、b*值相關(guān)系數(shù)表

表7 多糖與L*、a*、b*值相關(guān)系數(shù)表

表8 總皂苷與L*、a*、b*值相關(guān)系數(shù)表

含量測量值同顏色測量值相關(guān)性分析結(jié)果顯示，甘草斷面顏色L*值同甘草酸、甘草苷、總黃酮、總皂苷在指定水平內(nèi)均呈顯著負(fù)相關(guān)，即L*值越大，甘草斷面顏色越淡，甘草酸等四種有效成分含量就越低；b*值同五種有效成分都存在顯著相關(guān)，同甘草酸、甘草苷、總黃酮、總皂苷均呈正相關(guān)，在一定程度上表示b*值越大，甘草顏色越黃，則甘草中的甘草酸等四種有效成分含量就越高，同多糖含量呈負(fù)相關(guān)，在一定程度上b*值增大，多糖含量下降。a*值表示紅綠方向，對甘草而言，a*值不作討論。

綜上結(jié)果，首先，本研究初步揭示甘草斷面顏色與有效成分之間的變化規(guī)律，通過顏色的數(shù)字化測定可以快速客觀地初步判斷或預(yù)測甘草的中化學(xué)成分的含量。第一，甘草中的甘草酸、甘草苷、總黃酮、總皂苷與色度計中顏色明度值L*呈顯著負(fù)相關(guān)，即L*越高，甘草酸等四種有效成分越高；第二，甘草中的甘草酸、甘草苷、總黃酮、總皂苷與色度計中b*值呈顯著正相關(guān)，即b*越高，甘草酸等四種有效成分越高；多糖與b*呈顯著負(fù)相關(guān)，即b*越高，多糖含量越低。其次，目前“辨狀論質(zhì)”仍是中藥質(zhì)量評價中不可或缺的評價方法之一，但這種評價方法缺乏一套科學(xué)客觀且符合中醫(yī)藥理論思想的藥材質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)。本實驗在繼承中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論思想的指導(dǎo)下，引入色度計對顏色進行量化，證明使用色度計評價甘草質(zhì)量的可行性、有效性。最后，建議在今后的研究中，盡可能繼續(xù)擴大樣本量進行實驗，使獲得的實驗數(shù)據(jù)更具有代表性和廣泛性，同時保證此方法的準(zhǔn)確性；并進一步推廣此方法，建立一種快速有效、客觀可控的中藥質(zhì)量評價新方法。

1 解軍波.不同道地性狀甘草的化學(xué)成分比較研究.中華中醫(yī)藥學(xué)會中藥鑒定分會.中華中醫(yī)藥學(xué)會第九屆中藥鑒定學(xué)術(shù)會議論文集——祝賀中華中醫(yī)藥學(xué)會中藥鑒定分會成立二十周年.中華中醫(yī)藥學(xué)會中藥鑒定分會,2008:4.

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