幾種天然產物與CASP3靶點的相互作用機制探索＊

張靜曉，劉曉潔，楊 春，陳盼盼，張麗雷

（湖北民族學院化學與環(huán)境工程學院 恩施 445000）

細胞凋亡存在于多細胞生物的整個生命過程中,此過程可及時清除機體內多余和受損傷的細胞，維持組織器官的穩(wěn)定性，對機體自身的穩(wěn)定具有關鍵的作用[1]。細胞的凋亡受到生物體自身代謝的嚴格調控，當細胞的正常凋亡過程受到干擾，細胞便會產生異常，從而出現特殊表型，細胞分化停滯甚至產生腫瘤[2]。參與細胞凋亡過程的主要包括凋亡蛋白酶(caspases)、銜接蛋白(adapter proteins)、Bcl-2和凋亡抑制蛋白(IAPs)等4類蛋白。其中Caspase半胱氨酸蛋白酶家族包含高度同源的半胱氨酸蛋白酶,分為兩個主要的亞科，一個亞科家族參與炎癥過程，包括CASP1,4和5等，另一個亞科家族在細胞凋亡過程中起重要作用，包含CASP3,8和9等[3]。CASP3的作用方式是，當細胞受到損傷時，其主要表現為線粒體膜損傷，線粒體內的細胞色素釋放到細胞外，激活CASP3從而誘導細胞凋亡[4]。CASP3作為治療某些癌癥的靶點受到越來越多的關注，研究CASP3抑制劑是抗癌藥物開發(fā)的有效方法之一。

基于生物信息學方法，從天然產物中篩選有效成分，研究其與靶點的作用機制，是新藥開發(fā)和研究中藥作用機理的重要方法[5-8]。本課題組利用多種生物信息學方法建立了一個中藥有效成分篩選的模擬體系，通過類藥性篩選、靶點預測等方法，從中草藥中篩選出與CASP3靶點有相互作用的7種有效成分[9]，如表1所示。本文在前期研究的基礎上，采用Autodock Vina程序[10]對篩選后的有效成分與CASP3進行分子對接，之后進行分子動力學（MD）模擬，通過分析分子模擬的軌跡以及得到的相互作用能，預測它們與CASP3的結合位點以及作用方式。

1 材料和方法

1.1 材料的準備

從蛋白晶體數據庫（RCSB PDB數據庫）中得到CASP3靶點的晶體結構（PDB ID：5I9T），除去晶體水，并對其加氫，作為分子模擬時受體的初始模型，記為CASP3。天然產物中的藥物分子從化學結構數據庫（Chemspider）中獲取，采用GAMESS量子化學軟件包[11]，在B3LYP方法，6-31（d，p）基組水平上優(yōu)化得到藥物分子的結構，通過頻率分析保證其處于穩(wěn)定結構，作為分子對接時配體的初始構象。

1.2 分子對接

藥物分子與CASP3的對接在AutoDock Vina程序中進行，使用半柔性對接方法，CASP3被視為一個剛體和藥物分子所有的可旋轉鍵進行對接。最有可能的結合位點采用搜索全局優(yōu)化法（Iterated Local Search Globle Optimizer）搜索。最佳的結合位點設定為涵蓋CASP3整個活性口袋大小為30×30×30 ?3的盒子內，盒子的網格間距為1.0 ?，以藥物分子的幾何中心為中心，在每個對接過程中，根據在AutoDock Vina的評分函數計算出的結合親和能，篩選出了10個打分最高的構象模型。

1.3 分子動力學模擬

分子動力學（MD）模擬在NAMD（版本2.11）程序[12]中進行，將分子對接得到的復合物結構用作MD模擬的初始構象，采用CHARMM 27全原子力場。藥物配體分子力場參數采用SwissParam程序生成。在復合物的周圍建立可將復合體完全包圍且延伸8 ?的立方體水模型的周期性結構，原子的總數目大約為12 400個。在進行分子動力學模擬之前，進行兩步優(yōu)化，使整個體系松弛：第一步，用最陡下降法和共軛梯度法優(yōu)化水分子；第二步，將整個體系優(yōu)化至收斂。優(yōu)化結束后，為了避免快速升溫對溶質分子帶來的影響，采取了緩慢升溫的方法，體系溫度在220 ps內由0 K緩慢加熱至310 K，之后進行10 ns的NPT模擬，時間步長為2 fs。在動力學模擬過程中，應用Langevin動力學控制溫度，碰撞頻率為1.0 ps-1。將所有和氫原子相連的鍵設置為不振動，使用PME（Particle Mesh Ewald）方法計算長程靜電相互作用，范德華相互作用的截斷值為12 ?。

2 結果與討論

2.1 分子對接

將本課題組篩選得到的7個與CASP3靶點有相互作用的化合物為研究對象[7]，分別與CASP3進行對接，通過AutoDock Vina程序對對接結果進行打分，所得分值如表1所示。由表可見，丹參酮IIA和野黃芩苷與CASP3具有較好的空間匹配度，所需結合能量最低。

表1 分子對接的最優(yōu)化模型結果

圖1 丹參酮IIA（A）、野黃芩苷（B）與CASP3模型對接后的結果

圖2 CASP3復合物模型MD模擬期間骨架原子的均方根偏差

丹參酮IIA（A）、野黃芩苷（B）與CASP3對接結果如圖1所示。從圖中可以看出丹參酮IIA、野黃芩苷均對接在CASP3的活性口袋中，參考X射線衍射法獲得的5I9T模型，對接的位置是合理的。

2.2 分子動力學

將丹參酮IIA、野黃芩苷的對接結構作為初始構象，進行了10 ns的分子動力學模擬，對其進行RMSD計算，結果如圖2所示。從圖中可見，這兩個體系骨架原子的RMSD逐漸趨于穩(wěn)定，其中丹參酮IIA與CASP3結合的構象很快達到穩(wěn)定，最后上下波動幅度穩(wěn)定在0.5 ?左右，野黃芩苷與CASP3結合的構象在5 ns左右經歷一個上升后達到穩(wěn)定，上下波動幅度穩(wěn)定在0.7 ?左右。

圖3 丹參酮IIA（A）和野黃芩苷（B）與CASP3模型的相互作用網絡

圖4 丹參酮IIA（A）和野黃芩苷（B）與CASP3的相互作用力（VDW：范德華力，Elec：靜電力）

在最后的1 000 ps的運動軌跡中，取最低能量結構進行了相互作用分析。使用軟件Ligplot+[13]計算得到丹參酮IIA和野黃芩苷與CASP3模型的相互作用網絡，如圖3所示。從圖中可見，丹參酮IIA和野黃芩苷均與CASP3形成疏水相互作用，其中丹參酮IIA與4個殘基（Phe256、Ser205、Trp206、Arg207）具有疏水作用，并且與Ser251形成一個鍵長為2.76 ?的氫鍵；野黃芩苷與9個殘基（Ser249、Trp214、Trp206、Arg207、Ser205、Ala162、Tyr204、Cys163、Hsd121）有 疏 水 作 用 ，與Ser251和Phe250等6個殘基形成7個氫鍵。其中，與殘基Ser251的O原子形成的氫鍵鍵長為2.88 ?，與殘基Phe250的N原子形成的氫鍵鍵長為3.03 ?，與殘基Asn208的N原子形成的氫鍵鍵長為3.09 ?，與殘基Ser120的O原子形成的氫鍵鍵長為2.78 ?，與殘基Gln161的N原子和O原子分別形成2個氫鍵，鍵長分別為3.21 ?和3.02 ?，與殘基Thr62的O原子形成的氫鍵鍵長為2.66 ?。由于蛋白質和藥物分子之間形成的氫鍵有利于它們的結合，說明野黃芩苷與CASP3的結合能力優(yōu)于丹參酮IIA與蛋白質的結合能力。

對丹參酮IIA和野黃芩苷分別與CASP3形成的靜電力和范德華力進行了分析，結果如圖4所示。從圖中可見，配體分子與CASP3之間的作用力在不同模擬時間較為穩(wěn)定。丹參酮IIA與CASP3之間的范德華力平均值為-21.97 kcal·mol-1，靜電力平均值為-5.31 kcal·mol-1，故主要作用力為范德華力；野黃芩苷與CASP3之間的范德華力平均值為-41.39 kcal·mol-1，靜電力平均值-26.51 kcal·mol-1，故其主要作用力也為范德華力。野黃芩苷與CASP3之間的結合強度大于丹參酮IIA，這是由于它與CASP3之間不僅具有較大的范德華力，而且具有較強的靜電力，與前述野黃芩苷與CASP3形成了較多的氫鍵的結論一致。

2.3 氫鍵分析

氫鍵是維系蛋白質與配體分子穩(wěn)定性的重要作用力[14]，分別對丹參酮IIA和野黃芩苷與CASP3形成的幾條氫鍵進行分析，判斷氫鍵采用的幾何依據為氫鍵鍵長不大于3.5 ?，鍵角不大于30°，以5 000 ps到10 000 ps的運動軌跡為研究對象，計算了平均鍵長，平均鍵角，以及鍵長存活概率（氫鍵長度小于3.5 ?，同時鍵角小于30°的概率），結果如表2所示，表中氫鍵編號如圖3所示。

由表2和圖3可見，丹參酮IIA與CASP3形成的一個氫鍵不太穩(wěn)定，存活率為48.03%。野黃芩苷與CASP3形成的七個氫鍵中，與殘基Ser251的O原子形成的氫鍵（編號2），與殘基Asn208的N原子形成的氫鍵（編號4），與殘基Gln161的N原子形成的氫鍵（編號6），與殘基Thr62的O原子形成的氫鍵（編號8）均不穩(wěn)定，存活率分別為2.35%、10.04%、3.10%和7.35%。然而，與殘基Phe250的N原子形成的氫鍵（編號3），與殘基Ser120的O原子形成的氫鍵（編號5），與殘基Gln161的O原子形成的氫鍵（編號7）的存活率分別為90.15%、85.16%和82.31%，表明這些氫鍵較為穩(wěn)定，是野黃芩苷與CASP3形成較強相互作用的主要原因。

表2 氫鍵情況統(tǒng)計表

3 結論

本文以從幾種天然產物的化學成分中篩選出的小分子為研究對象，以分子對接和分子動力學方法，研究了其與CASP3之間的相互作用。結果發(fā)現，丹參酮IIA和野黃芩苷具有較好的對接結果，并通過分子動力學方法獲取了這兩種藥物與CASP3結合的穩(wěn)定結構，它們之間的范德華力均強于靜電力。另外，丹參酮IIA與CASP3中的Phe256、Ser205、Trp206等4個氨基酸殘基具有疏水作用，形成1個氫鍵。野黃芩苷與CASP3靶點中的Ser249、Trp214、Trp206等9個氨基酸殘基具有疏水作用，形成了7個穩(wěn)定性不同的氫鍵，其中與殘基Phe250的N原子，與殘基Ser120的O原子，與殘基Gln161的O原子形成的3個氫鍵最為穩(wěn)定，是形成穩(wěn)定構象的主要原因。研究與其相似的結構，有望獲得CASP3靶點的有效抑制劑。目前，相關研究正在繼續(xù)展開。

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