清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方對自發(fā)性高血壓大鼠血壓及胸腺的干預(yù)作用研究＊

丁李立強(qiáng)，賈成林，陳 瑜,2＊＊，張 騰,2＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 上海 200437；2.上海市中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合臨床研究所 上海 200437）

本課題組依據(jù)高血壓病因病機(jī)，結(jié)合古代經(jīng)典復(fù)方和臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)自擬清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方用以治療高血壓，獲得較好的治療效果。本實(shí)驗(yàn)將通過使用清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneously hypertensive rat，SHR）模型，觀察其對SHR的血壓及胸腺的治療干預(yù)作用，初步探討清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方治療高血壓的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級WKY和SHR雄性大鼠，4周齡，體重80-100 g，購自北京維通利華有限公司，動(dòng)物許可證號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 藥物與試劑

清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方（QYQ）所含中藥材均購自上海康橋藥業(yè)有限公司：制黃精（批號151021），夏枯草（批號1608111），炒黃芩（批號151106），益母草（批號160818），石決明（批號160326），柴胡（批號160921），桑寄生（批號160813），川牛膝（批號160701），川芎（批號160824），防風(fēng)（批號160718），羌活（批號160129），黃連（批號160913）；坎地沙坦酯片（Candesartan Cilexetil Tablets，Can，日本武田藥品工業(yè)株式會社，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字J20150085）。

1.3 儀器設(shè)備

大、小鼠無創(chuàng)血壓計(jì)（型號：BP-98A Series，北京軟隆Softron生物技術(shù)有限公司）；電子天平（型號：FA1004B，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；石蠟切片機(jī)（型號：RM2235，Leica）；正置顯微鏡（型號：DM2000，Leica）。

1.4 動(dòng)物分組與處理

將WKY大鼠作為空白組（WKY組），SHR大鼠隨機(jī)分為模型對照組（SHR組），清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方治療組（QYQ組），坎地沙坦治療組（Can組）。清肝益腎祛風(fēng)中藥組方（川芎15 g、柴胡15 g、黃連6 g、羌活15 g、防風(fēng)15 g、夏枯草30 g、川牛膝15 g、黃精15 g、石決明20 g、炒黃芩15 g、桑寄生15 g、益母草30 g）各藥材采用中藥常規(guī)煎煮法，按照人體劑量6.3倍換算后濃縮灌胃，給藥體積2 mL，每日1次；坎地沙坦酯片用pH值為6.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解，按照人體劑量換算以1 mg·kg-1的劑量灌胃，給藥體積2 mL，每日1次；模型對照組和空白組給予等體積的飲用水灌胃，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水、進(jìn)食。

各組大鼠在6周齡時(shí)開始灌胃，持續(xù)至20周齡，所有大鼠在灌胃前禁食12 h，并統(tǒng)一在灌胃后1 h使用大鼠無創(chuàng)血壓計(jì)測量血壓情況，每2周測量1次。分別在大鼠第4、8、12、20周齡時(shí)，處死各組部分大鼠，剝離胸腺并稱重，石蠟包埋后切片，進(jìn)行HE染色，使用Image Pro Plus 6.0圖像分析處理軟件進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，使用單因素方差（oneway ANOVA）分析各組血壓差異，組間比較采用LSD方法。取P＜0.05為顯著性水平，P＜0.01作為有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠收縮壓水平變化情況

如圖1所示，對比于WKY大鼠，SHR大鼠的血壓在6周齡開始逐步上升，在8周齡時(shí)收縮壓已達(dá)到170 mmHg左右，從10周齡開始直至20周齡收縮壓維持在200 mmHg左右，6周齡開始SHR組收縮壓均顯著高于WKY組（p＜0.01）；使用清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方（QYQ）在6周齡始開始干預(yù)，可見QYQ組在8周齡血壓較SHR模型組顯著降低（p＜0.01），從8周齡開始至20周齡，QYQ組的收縮壓均顯著低于SHR組（p＜0.01）；雖然QYQ組血壓仍高于WKY組與Can組，但QYQ對SHR大鼠血壓的降低仍是十分顯著的，在20周齡時(shí)，與QYQ組與SHR模型組對比能降低50 mmHg左右的血壓。

圖1 各組大鼠從6至20周齡的收縮壓變化情況

圖2 各組大鼠在4-20周齡時(shí)胸腺指數(shù)變化情況

2.2 不同周齡的各組大鼠胸腺指數(shù)的差異情況

胸腺指數(shù)（Thymus index）=胸腺質(zhì)量（mg）÷大鼠體質(zhì)量（g）×10，如圖2所示，在4周齡及8周齡時(shí)，SHR大鼠胸腺指數(shù)均大于WKY大鼠（p＜0.05）；在6周齡開始藥物灌胃干預(yù)后，8周齡的QYQ組大鼠胸腺指數(shù)顯著高于SHR組（p＜0.01），而8周齡時(shí)Can組的大鼠胸腺指數(shù)也高于SHR但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）；在12周齡和20周齡時(shí)各組之間的胸腺指數(shù)均無顯著差異（p＞0.05）。

圖3 4周齡時(shí)WKY與SHR大鼠胸腺組織形態(tài)學(xué)比較

表1 4周齡時(shí)WKY組與SHR組胸腺病理切片面積比較(±s)

表1 4周齡時(shí)WKY組與SHR組胸腺病理切片面積比較(±s)

2.3 不同周齡各組大鼠胸腺病理形態(tài)學(xué)的改變

如圖3與表1所示，4周齡時(shí)兩組大鼠的胸腺被膜完整，皮質(zhì)較厚，髓質(zhì)邊界清晰，WKY大鼠髓質(zhì)多相互連接成片狀，而SHR大鼠胸腺多為散在同心圓形狀分布；SHR大鼠胸腺的髓質(zhì)、皮質(zhì)及總面積均略少于WKY大鼠，但差異無顯著性（p＞0.05）。

如圖4與表2所示，8周齡時(shí)WKY大鼠及SHR大鼠胸腺開始萎縮，皮質(zhì)和髓質(zhì)面積減少，WKY大鼠髓質(zhì)邊界清楚，SHR髓質(zhì)邊界較模糊，而QYQ組和Can組髓質(zhì)邊界都較清晰；SHR大鼠胸腺的髓質(zhì)、皮質(zhì)及總面積均稍大于WKY大鼠，但差異無顯著性（p＞0.05）；而QYQ組大鼠髓質(zhì)、皮質(zhì)及總面積有明顯增多，其中髓質(zhì)面積大于WKY組與SHR組但差異無顯著性（p＞0.05），皮質(zhì)面積顯著大于WKY組（p＜0.01）和SHR組（p＜0.01），胸腺總面積也大于WKY組（p＜0.01）和SHR組（p＜0.05）；同時(shí)Can組大鼠髓質(zhì)、皮質(zhì)及總面積也均大于WKY組（p＜0.05），而其大于SHR組但差異無顯著性（p＞0.05）；QYQ組與Can組大鼠之間的髓質(zhì)、皮質(zhì)及總面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），Can組大鼠髓質(zhì)面積占總面積比率高于QYQ組（p＜0.05）。

圖4 8周齡各組大鼠胸腺組織形態(tài)學(xué)改變

表2 8周齡時(shí)各組胸腺病理切片面積比較(±s)

表2 8周齡時(shí)各組胸腺病理切片面積比較(±s)

注：與WKY組比較#P＜0.05，##P＜0.01；與SHR模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與QYQ組比較△P＜0.05

圖5 12周齡各組大鼠胸腺組織形態(tài)學(xué)改變

表3 12周齡時(shí)各組胸腺病理切片面積比較(±s)

表3 12周齡時(shí)各組胸腺病理切片面積比較(±s)

注：與WKY組比較##P＜0.01；與SHR模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

如圖5與表3所示，12周齡時(shí)各組大鼠胸腺萎縮明顯，皮質(zhì)萎縮、變薄，髓質(zhì)面積減少，而WKY大鼠髓質(zhì)邊界較清楚，而SHR髓質(zhì)邊界模糊，其髓質(zhì)面積占總面積比率顯著低于WKY組大鼠（p＜0.01），SHR組的髓質(zhì)、皮質(zhì)及總面積均小于WKY組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）；QYQ組大鼠髓質(zhì)、皮質(zhì)及總面積減少，髓質(zhì)面積小于WKY組（p＜0.01）與SHR組（p＜0.01），皮質(zhì)面積小于WKY組（p＜0.01）和SHR組（p＜0.01），其胸腺總面積小于WKY組（p＜0.01）和SHR組（p＜0.05）；Can組大鼠大鼠髓質(zhì)、皮質(zhì)及總面積也減少，髓質(zhì)面積小于WKY組（p＜0.01），皮質(zhì)面積小于WKY組（p＜0.01）和SHR組（p＜0.01），其胸腺總面積小于WKY組（p＜0.01）和SHR組（p＜0.01）；QYQ組與Can組大鼠之間的髓質(zhì)、皮質(zhì)、總面積及髓質(zhì)占總面積比率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。

圖6 20周齡各組大鼠胸腺組織形態(tài)學(xué)改變

表4 20周齡時(shí)各組胸腺病理切片面積比較(±s)

表4 20周齡時(shí)各組胸腺病理切片面積比較(±s)

注：與WKY組比較#P＜0.05。

如圖6與表4所示，20周齡時(shí)各組大鼠胸腺顯著萎縮，皮質(zhì)明顯萎縮、變薄，SHR大鼠胸腺萎縮情況較WKY大鼠明顯，髓質(zhì)邊界模糊，其髓質(zhì)、皮質(zhì)及總面積均低于WKY組大鼠，而差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）；SHR大鼠模型組與各治療組之間髓質(zhì)、皮質(zhì)及總面積均無明顯差異；QYQ組的髓質(zhì)面積略大于SHR組，但差異無顯著性（p＞0.05），皮質(zhì)面積小于WKY組（p＜0.05）；Can組胸腺總面積小于WKY組（p＜0.05）；另外，QYQ組和Can組髓質(zhì)面積占總面積比率要高于SHR組，但差異無顯著性（p＞0.05）；QYQ組與Can組大鼠之間的髓質(zhì)、皮質(zhì)、總面積及髓質(zhì)占總面積比率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。

3 討論

胸腺是中樞淋巴器官，是T細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟的場所，是機(jī)體重要的免疫器官。作為T細(xì)胞的訓(xùn)練場所和幼稚T細(xì)胞庫，胸腺執(zhí)行著重要的T細(xì)胞中樞耐受，T細(xì)胞在胸腺內(nèi)經(jīng)歷陰性選擇和陽性選擇，陽性選擇保持抗原特異性T細(xì)胞輸出，而陰性選擇負(fù)責(zé)盡量降低外周發(fā)生自身免疫反應(yīng)的可能性[1]，使得能夠識別異體抗原，且對自身抗原無應(yīng)答能力的胸腺細(xì)胞存活并發(fā)育成熟，從而使機(jī)體對自身抗原產(chǎn)生免疫耐受，并能夠輸出成熟胸腺細(xì)胞發(fā)揮免疫功能[2]。

免疫衰老是免疫系統(tǒng)全方位多系統(tǒng)的受基因嚴(yán)格控制的循環(huán)遞減的自然過程[3]。免疫衰老是人體衰老的主要原因之一，免疫衰老包括造血干細(xì)胞增殖和分化不足、B細(xì)胞發(fā)育受阻、中樞T細(xì)胞輸出不足、外周細(xì)胞介導(dǎo)的免疫降低、固有免疫應(yīng)答減弱等幾個(gè)重要方面，而胸腺的衰老是免疫衰老最重要的標(biāo)志[4]。隨著年齡的增加，胸腺組織脂肪浸潤，胸腺細(xì)胞大量減少，皮髓質(zhì)比例下降，小淋巴細(xì)胞凋亡。免疫衰老是以胸腺衰老為先導(dǎo)的從中樞到外周逐步衰老的進(jìn)程，從而引起免疫力降低和老年自身免疫疾病的發(fā)生。

SHR大鼠是一種在實(shí)驗(yàn)中廣泛運(yùn)用的高血壓動(dòng)物模型，有研究發(fā)現(xiàn)該系大鼠的免疫功能低下[5]，這種免疫缺陷似乎與其高血壓的發(fā)生密切相關(guān)，但其具體機(jī)制并不清楚。巴德年等通過移植正常大鼠胸腺或者胸腺提取物，能夠恢復(fù)SHR的免疫功能及降低其血壓[6]。此外，有報(bào)道[7]顯示SHR易發(fā)生類似于人結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周圍炎的血管病變，而當(dāng)新生兒期SHR大鼠接受Wistar大鼠胸腺移植后，能夠預(yù)防該血管病變的發(fā)生[8]。Purcell等研究發(fā)現(xiàn)在幼年時(shí)期SHR大鼠胸腺的髓質(zhì)和皮質(zhì)容量比值與WKY大鼠相似，而在12周時(shí)SHR大鼠胸腺髓質(zhì)明顯少于WKY大鼠[9]。同時(shí)SHR大鼠胸腺淋巴細(xì)胞對絲裂原誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)性較低，并在12周齡時(shí)與WKY大鼠對比最為顯著[10]，說明隨著年齡的增加，SHR大鼠胸腺功能相較于WKY大鼠顯著地降低。

對于SHR大鼠胸腺萎縮及免疫功能低下的原因，有研究發(fā)現(xiàn)在SHR大鼠血清中含有一種能夠?qū)ψ陨硇叵偌?xì)胞發(fā)生補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用的自身抗體，這種抗體的強(qiáng)度和出現(xiàn)頻率隨年齡增長而增加，能夠加快SHR大鼠胸腺萎縮和T細(xì)胞功能不全[11]。另外，糖皮質(zhì)激素能夠通過直接或間接的途徑增強(qiáng)胸腺細(xì)胞的凋亡而誘導(dǎo)胸腺的萎縮[12]，研究顯示SHR大鼠腎上腺糖皮質(zhì)激素水平較高[13]，Suzuki等[14]通過切除腎上腺能夠減少SHR和WKY大鼠胸腺的凋亡，并且使用地塞米松能夠增加胸腺細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)WKY大鼠胸腺的萎縮，因此認(rèn)為SHR大鼠胸腺萎縮亢進(jìn)是由其較高的腎上腺糖皮質(zhì)激素水平導(dǎo)致的。此外，也有研究[15]認(rèn)為因神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的存在，交感神經(jīng)系統(tǒng)影響著胸腺的成熟和萎縮，而SHR大鼠的明顯亢進(jìn)的交感神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致了胸腺萎縮的亢進(jìn)。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著周齡的增加SHR大鼠和WKY大鼠的胸腺逐漸萎縮，并且SHR胸腺萎縮程度大于WKY，SHR在12周齡時(shí)髓質(zhì)和皮質(zhì)面積明顯減少，髓質(zhì)占胸腺總面積比值顯著小于WKY。這些結(jié)果與之前文獻(xiàn)所描述的相符，可以認(rèn)為SHR大鼠胸腺衰老的過程要明顯快于WKY。我們的研究結(jié)果表明在6周齡時(shí)SHR血壓開始升高，顯著高于WKY大鼠，在8周齡時(shí)經(jīng)過QYQ與Can干預(yù)2周后顯著降低了SHR大鼠的血壓，而且QYQ還在8周齡時(shí)增加了SHR大鼠的胸腺指數(shù)。在8周齡時(shí)WKY和SHR大鼠胸腺開始出現(xiàn)萎縮，皮質(zhì)和髓質(zhì)面積減少，而SHR的髓質(zhì)邊界更加模糊，在QYQ和Can干預(yù)下大鼠胸腺皮質(zhì)顯著增加并高于SHR模型組和WKY組，且髓質(zhì)邊界比模型組清晰。這種現(xiàn)象可能反映了SHR大鼠血壓與胸腺衰老之間的某種聯(lián)系，我們推測在藥物干預(yù)2周后降低了SHR大鼠的血壓，改變了大鼠內(nèi)環(huán)境，從而影響了大鼠胸腺的衰老過程。但是也有可能這種對于胸腺的保護(hù)效應(yīng)是獨(dú)立于降壓效應(yīng)之外的，因?yàn)殡m然QYQ組降壓效果不及Can組，但其胸腺指數(shù)和胸腺皮質(zhì)髓質(zhì)的面積均高于Can組。同時(shí)這些結(jié)果提示QYQ雖在降壓方面不及Can效果明顯，但QYQ在早期減緩胸腺衰老方面具有更顯著的效果。而在12周齡和20周齡時(shí)，雖然QYQ和Can都表現(xiàn)出顯著的降壓效應(yīng)，但對于胸腺保護(hù)方面并沒有更明顯的效果，提示QYQ或者Can對胸腺的保護(hù)作用可能主要集中在高血壓升高的一定程度或時(shí)間范圍內(nèi)。鑒于SHR大鼠血壓快速持續(xù)升高，與同周齡WKY大鼠相比，8周齡SHR收縮壓已升高約50 mmHg，藥物的胸腺保護(hù)效應(yīng)應(yīng)該更具有病理生理意義。

清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方是本課題組導(dǎo)師根據(jù)高血壓的中醫(yī)病因病機(jī)，結(jié)合古代經(jīng)典方劑以及臨床體會制定的治療高血壓的中藥復(fù)方，在臨床上能夠顯著降低高血壓患者的血壓，并能明顯改善頭暈，頭脹等臨床癥狀[15]。本研究通過觀察SHR大鼠與WKY大鼠血壓與胸腺的差異與變化情況，使用清肝益腎祛風(fēng)的中藥復(fù)方和坎地沙坦酯片進(jìn)行干預(yù)，在早期均能夠降低SHR大鼠血壓以及延緩胸腺萎縮，提示其降壓效應(yīng)與保護(hù)胸腺之間可能存在著某種聯(lián)系，而且清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方在降壓之外具有更為顯著的胸腺保護(hù)作用，反應(yīng)出中醫(yī)藥的多途徑多靶點(diǎn)的治療優(yōu)勢，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究闡明。

1 Quaglino D,Ronchetti I P.Cell death in the rat thymus:a minireview.Apoptosis,2001,6（5）:389-401.

2 宋芳,王建軍,李俊平.T細(xì)胞在胸腺內(nèi)的分化發(fā)育.包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,17(1):75-77.

3 龔張斌,金國琴.胸腺衰老與免疫衰老.國外醫(yī)學(xué)(老年醫(yī)學(xué)分冊),2009,30(4):145-149.

4 王通,曾耀英.胸腺保護(hù)與抗衰老.中國臨床康復(fù),2005,9(23):164-166.

5 Takeichi N,Suzuki K,Okayasu T,et al.Immunological depression in spontaneously hypertensive rats.Clin Exp Immunol,1980,21(1):120-6.

6 Ba D,Takeichi N,Kodama T,et al.Restoration of T cell depression and suppression of blood pressure in spontaneously hypertensive rats(SHR)by thymus grafts or thymus extracts.J Immunol,1982,128(3):1211-6.

7 Suzuki T,Oboshi S,Sato R.Periarteritis nodosa in spontaneously hypertensive rats--incidence and distribution.Acta Pathol Japon,1979,29(5):697-703.

8 巴德年.高血壓大鼠(SHR)免疫缺陷機(jī)理分析.中國免疫學(xué)雜志,1985,1:3-8.

9 Purcell E S,Wood G W,Gattone V H.Immune system of the spontaneously hypertensive rat:II.Morphology and function.Anat Rec,1993,237(2):236-42.

10 Pascual V H,Oparil S,Eldridge J H,et al.Spontaneously hypertensive rat:lymphoid depression is age dependent and mediated via a mononuclear cell subpopulation.Am J Physiol,1992,262(2):R1-7.

11 Takeichi N,Ba D,Kobayashi H.Natural cytotoxic autoantibody against thymocytes in spontaneously hypertensive rats.Cell Immunol,1981,60(1):181-90.

12 Compton M M,Caron L A,Cidlowski J A.Glucocorticoid action on the immune system.J Steroid Biochem,1987,27(1-3):201-8.

13 Hashimoto K,Makino S,Hirasawa R,et al.Abnormalities in the hypothalamo-pituitary-adrenal axis in spontaneously hypertensive rats during development of hypertension.Endocrinology,1989,125(3):1161-7.

14 Suzuki H,Delano F A,Jamshidi N,et al.Enhanced DNA fragmentation in the thymus of spontaneously hypertensive rats.Am J Physiol,1999,276(2):H2135-40.