越鞠保和丸聯(lián)合辛伐他汀對動脈粥樣硬化小鼠心肌纖維化的作用＊

李玉波，郝改梅，梁 媛，王國為，賈海驊，李志更

（中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所 北京 100700）

許多中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為早期高脂飲食可導(dǎo)致高脂血癥，病位在肝膽脾，日久而見濕、痰、瘀、熱、食郁從而形成動脈粥樣硬化[1,4]?，F(xiàn)在醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[5,6]，在動脈粥樣硬化的過程中，存在心肌纖維化等心肌病變。越鞠丸是治療六郁的代表方，保和丸能和胃消食，他汀類藥物能一定程度逆轉(zhuǎn)心肌纖維化[7,8]，因此本文旨在探討越鞠保和丸能否增強(qiáng)他汀類藥物對動脈粥樣硬化引起的心肌纖維化的逆轉(zhuǎn)作用。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

6周齡SPF級APOE-/-小鼠60只，雄性，體重15-20 g，由北京維通利華生物技術(shù)有限公司提供，普通飼料和高脂飼料也由此公司提供。小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成5組，即正常對照組（N組）、模型對照組（M組）、越鞠保和丸組（YB組）、越鞠保和丸聯(lián)合辛伐他汀組（YBS組）、辛伐他汀組（S組），每組15只。本試驗經(jīng)過中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所倫理審查委員會的許可。

1.2 藥物劑量及給藥方法

越鞠保和丸（中成藥，國藥準(zhǔn)字Z11020510，產(chǎn)品批號16081241）購自中國北京同仁堂（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，組成：梔子（姜制）、六神曲（麥麩）、醋香附、川芎、蒼術(shù)、木香、檳榔；規(guī)格：水丸每袋丸重6 g，6 g×10袋；成人（60 kg）用法用量：口服，一次6 g，一日2次。人（60 kg）與小鼠（0.02 kg）間用藥劑量折算系數(shù)為9.01，按照成人60 kg一次的用藥劑量6 g轉(zhuǎn)化為0.02 kg小鼠一次的劑量為0.018 g，用0.2 mL無菌純凈水溶解。

辛伐他?。ㄊ娼抵┯珊贾菽硸|制藥有限公司提供，按照成人60 kg一天的用藥劑量20 mg轉(zhuǎn)化為0.02 kg小鼠一天的原始劑量為0.06 mg，將20 mg辛伐他汀片劑研磨成粉后用66.66 mL無菌純凈水制成懸濁液。

N組小鼠普通飼料飼養(yǎng)，M組小鼠高脂飼料飼養(yǎng)，兩組每日每只灌胃0.4 mL生理鹽水；YB組小鼠高脂飼料飼養(yǎng)，每日每只灌胃0.2 mL越鞠保和丸懸濁液和0.2 mL生理鹽水混合液；S組小鼠高脂飼料飼養(yǎng)，每日每只灌胃0.2 mL辛伐他汀懸濁液和0.2 mL生理鹽水混合液；YBS小鼠高脂飼料飼養(yǎng)，每日每只灌胃0.2 mL越鞠保和丸懸濁液和0.2 mL辛伐他汀懸濁液混合液。

1.3 動脈粥樣硬化引起的心肌纖維化模型的確立

高脂飼料飼養(yǎng)M組、YB組、S組和YBS組小鼠20周后，從每組中隨機(jī)抽取5只小鼠取材，觀察其主動脈竇部和頭臂干動脈是否有粥樣硬化斑塊，如果全部都有則認(rèn)為動脈粥樣硬化斑塊模型確立，再對心肌組織進(jìn)行masson染色觀察心肌是否有纖維化，如果全部都有則認(rèn)為心肌纖維化模型確立，根據(jù)課題組前期預(yù)實(shí)驗的結(jié)果，高脂飼料喂養(yǎng)20周后模型可確立。

1.4 收集血清和心肌組織樣本

五組小鼠飼養(yǎng)20周后取材，小鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，腹主動脈取血1 mL，然后取左心室；血液離心后取血清放入凍存管中置于-80℃冰箱保存，左心室放入4%多聚甲醛中固定保存，血清和心肌組織各40個樣本。

1.5 Elisa法檢測小鼠血清血脂、AngⅡ、MMP-1含量

血清膽固醇的檢測方法主要為化學(xué)抽提法—ALBK法和酶法；血清甘油三酯的檢測方法主要為酶法，也有二氯甲烷-硅酸-變色酸法和高效液相色譜法；血清低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的檢測方法主要為超速離心結(jié)合ALBK法，也有酶法。為了使檢測結(jié)果具有一致性，小鼠血脂四項（血清膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白）及AngⅡ、MMP-1均采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（Elisa法），Elisa試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。實(shí)驗加入100 ul終止液，輕輕混勻30 s后30 min內(nèi)在450 nm處讀OD值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)血清樣品的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

1.6 心肌組織masson染色及心肌膠原染色及定量分析膠原容積分?jǐn)?shù)

心肌膠原染色及定量分析膠原容積分?jǐn)?shù)：取左心室心肌組織行Masson及染色，光鏡100倍下觀察心肌膠原變化，以圖像分析系統(tǒng)定量分析膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF），其中CVF=膠原面積/全視野面積×100%，每張心肌切片標(biāo)本均隨機(jī)取6個視野測量，取平均值。

1.7 高通量轉(zhuǎn)錄組測序分析各組心肌組織差異表達(dá)基因

由Trizol法提取各組心肌組織RNA，RNA質(zhì)檢、轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析由北京奧維森基因科技有限公司完成。

1.8 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計軟件：SPSS17.0；計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示；統(tǒng)計方法：隨機(jī)區(qū)組設(shè)計方差分析（ANOVA）和最小顯著性差異法（LSD），P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組小鼠飼養(yǎng)20周后血清血脂、AngⅡ、MMP-1含量

M組小鼠血清TC、TG、LDL-C、AngⅡ含量明顯高于N組，HDL-C、MMP-1含量明顯低于N組。S組和YBS組小鼠血清TC、TG、LDL-C、AngⅡ含量較M組有明顯降低但仍高于N組，HDL-C、MMP-1含量明顯高于M組但仍低于N組。YB組小鼠血清TC、LDL-C、AngⅡ含量較M組有明顯降低但仍高于N組，MMP-1含量明顯高于M組但仍低于N組，TG與HDL-C含量與M組相比其差異無統(tǒng)計學(xué)意義。（見表1）

2.2 心肌膠原染色及定量分析CVF

Masson染色下，心肌細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)綠色。光鏡100倍下觀察發(fā)現(xiàn)：N組心肌細(xì)胞之間、血管周圍膠原沉積較少；M組、S組、YB組、YBS組心肌間質(zhì)膠原纖維不同程度的明顯增多，排列紊亂，呈粗細(xì)不等的條狀或網(wǎng)狀，與肌束走向平行，部分圍繞心肌細(xì)胞的膠原纖維網(wǎng)斷裂；M組、S組、YB組、YBS組CVF明顯高于N組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；YBS組CVF明顯低于M組、S組、YB組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。（見表2、圖1）

表1 五組小鼠飼養(yǎng)20周后血清血脂、AngⅡ、MMP-1含量（單位：mmol/L，n=10）

表2 五組小鼠飼養(yǎng)20周后心肌組織Masson染色定量分析CVF

圖1 五組小鼠飼養(yǎng)14周后心肌組織Masson染色（A-E分別為N組、M組、S組、YB組、YBS組）

2.3 高通量轉(zhuǎn)錄組測序差異基因分析

從2.1和2.2可以看出YBS組在降低血脂和保護(hù)心肌方面均優(yōu)于YB組和S組，因此我們將YBS組和N組、M組進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組測序。轉(zhuǎn)錄組測序差異基因數(shù)目顯示：YBS組較N組有103個基因上調(diào)（P＜0.05），37個基因下調(diào)（P＜0.05）；YBS組較M組有810個基因上調(diào)（P＜0.05），94個基因下調(diào)（P＜0.05）；M組較N組有36個基因上調(diào)（P＜0.05），490個基因下調(diào)（P＜0.05）。轉(zhuǎn)錄組測序KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析主要基于五個方面（見表3），結(jié)果以散點(diǎn)圖的形式顯示YBS組和N組、YBS組和M組20條富集最顯著的通路（見圖2、圖3、圖4），圖2 YBS組和N組差異基因KEGG富集散點(diǎn)圖（Rich factor、Qvalue和富集到此通路上的基因個數(shù)被用來衡量KEGG富集程度。其中Rich factor指pathway中富集到的差異表達(dá)基因數(shù)量與注釋基因數(shù)量的比值。Rich factor值越大，說明富集的程度越大。Qvalue(取值范圍0-1)是通過多重假設(shè)檢驗校正之后的Pvalue，Qvalue的值越接近于零，說明富集越顯著。）

表3 差異基因KEGG富集列表

圖2 YBS組和N組、M組轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果差異基因數(shù)目

3 討論

心肌纖維化與動脈硬化等多種疾病相關(guān)，是大多數(shù)心血管疾病病理學(xué)改變的重要部分?，F(xiàn)代研究表明，通過高脂飲食飼養(yǎng)成功建立兔動脈粥樣硬化模型，且該模型出現(xiàn)了明顯的心肌纖維化，同時心肌組織中AngⅡ表達(dá)升高、MMP-1表達(dá)降低，認(rèn)為該心肌纖維化可能與AngⅡ、MMP-1[9,11]有關(guān)。因此，本研究也用AngⅡ、MMP-1這兩個指標(biāo)來對比各組小鼠的心肌纖維化程度。

本研究結(jié)果表明，越鞠保和丸聯(lián)合辛伐他汀相比單用辛伐他汀可以有效的降低TC、TG、LDL-C、AngⅡ和升高HDL-C、MMP-1，并且masson染色CVF值也明顯降低，這表明越鞠保和丸聯(lián)合辛伐他汀比單用辛伐他汀可以更有效的逆轉(zhuǎn)動脈硬化導(dǎo)致的心肌纖維化。從高通量轉(zhuǎn)錄組測序差異基因分析結(jié)果來看，越鞠保和丸聯(lián)合辛伐他汀與正常對照組相比，差異基因表達(dá)主要集中在脂肪酸的代謝（fatty acid metabolism）、延長（fatty acid elongation）和降解（fatty acid degradation）上，而與模型對照組相比，差異基因表達(dá)主要集中在原發(fā)性免疫缺陷（primary immunodeficiency）和腸道免疫網(wǎng)絡(luò)的IgA的產(chǎn)生（Intestinal immune network for IgA production），這表明越鞠保和丸聯(lián)合辛伐他汀并不是通過逆轉(zhuǎn)脂肪酸的各種代謝途徑而是通過調(diào)控免疫炎性反應(yīng)來逆轉(zhuǎn)動脈粥樣硬化導(dǎo)致的心肌纖維化。

辛伐他汀為羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶抑制劑，抑制內(nèi)源性膽固醇的合成，為血脂調(diào)節(jié)劑，其作用的通路和靶點(diǎn)較為明確[12,13]。越鞠保和丸為理氣劑，具有疏肝解郁，開胃消食之功效，可用于治療六郁，六郁常因飲食不節(jié)，寒溫不適，喜怒無常，憂思無

度，氣機(jī)運(yùn)行失常而發(fā)病。肝喜條達(dá)，怒氣傷肝，氣郁則胸膈痞悶；肝藏血，氣郁者血瘀，出現(xiàn)胸脅痛，或月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)等；肝與膽互為表里，為相火寄居之所；氣郁化火，則口苦泛酸，此氣、血、火郁在肝膽，肝病及脾，使脾失運(yùn)化，導(dǎo)致濕郁、痰郁；不能運(yùn)化水谷則食郁；食、痰、濕三者壅滯中焦，則脹滿不食、吞酸嘔吐諸癥叢生；此證雖有氣、血、火、濕、痰、食六郁，而實(shí)際多為肝脾郁結(jié)為病。中醫(yī)學(xué)中的肝脾與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的消化系統(tǒng)內(nèi)涵相近。越鞠保和丸的作用通路和靶點(diǎn)雖然尚不明確，但是越鞠保和丸在臨床應(yīng)用上未見不良反應(yīng)報道，而2013年中國食品藥品監(jiān)督總局（CFDA）發(fā)布修訂他汀類藥品說明書通知，提醒中國醫(yī)生和患者關(guān)注他汀安全性[14]。目前辛伐他汀潛在的不良反應(yīng)主要有肌病[15][16]、轉(zhuǎn)氨酶升高[17,18]、增加新發(fā)糖尿病風(fēng)險[19,20]等。因此，越鞠保和丸聯(lián)用辛伐他汀可以在不增加他汀藥物用量的情況下提高逆轉(zhuǎn)動脈粥樣硬化導(dǎo)致的心肌纖維化的療效，間接的降低了他汀類化學(xué)藥物的風(fēng)險，這體現(xiàn)出了中醫(yī)藥的優(yōu)勢。

圖3 YBS組和M組差異基因KEGG富集散點(diǎn)圖（解釋同圖2）

圖4 M組和N組差異基因KEGG富集散點(diǎn)圖（解釋同圖2）

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