結(jié)核病療效監(jiān)測技術(shù)及指標研究進展*

陳云坤，王 勇 綜述，馮英凱△ 審校

(1.重慶市中醫(yī)院道門口院部呼吸內(nèi)科 400011；2.重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心普內(nèi)科，重慶 400036)

結(jié)核病療效監(jiān)測技術(shù)及指標研究進展*

陳云坤1，王 勇2綜述，馮英凱1△審校

(1.重慶市中醫(yī)院道門口院部呼吸內(nèi)科 400011；2.重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心普內(nèi)科，重慶 400036)

結(jié)核；療效監(jiān)測；抗結(jié)核治療

世界衛(wèi)生組織2016年全球結(jié)核病報告顯示,全球結(jié)核病死亡數(shù)量和發(fā)病率均繼續(xù)下降。2015年，據(jù)估計全世界新發(fā)結(jié)核病數(shù)量約為1 040萬例，其中590萬為男性(56%)，350萬為女性(占34%)，100萬為兒童(10%)[1]。120萬新發(fā)結(jié)核病例為艾滋病毒感染者(11%)。印度、印度尼西亞、中國、尼日利亞、巴基斯坦和南非這6個國家占新發(fā)病例數(shù)的60%，中國結(jié)核病患者人數(shù)居世界第3。2015年，據(jù)估計有140萬人死于結(jié)核病，還有40萬艾滋病毒感染者死于結(jié)核病。雖然從2000-2015年結(jié)核病死亡數(shù)量下降了22%，但結(jié)核病仍是2015年全世界十大死因之一。

早期確診和提高治愈率是控制結(jié)核病的現(xiàn)實目標。結(jié)核病的治療多采用聯(lián)合化療方案，遵循“早期、聯(lián)合、適量、規(guī)律、全程”的原則。由于結(jié)核化療藥物不良反應(yīng)嚴重，加之缺乏靈敏、有效的療效監(jiān)測指標，相當一部分患者服藥依從性較差，特別是西部欠發(fā)達地區(qū),經(jīng)濟及文化落后,患者往往一旦自覺癥狀改善即自行停藥，導(dǎo)致治療失敗或產(chǎn)生耐藥。采取正確合理的治療方案、提高患者服藥依從性是實施結(jié)核化療成功的關(guān)鍵?？s短和簡化療程是減少化療藥物不良反應(yīng)、提高服藥依從性的重要手段之一。而實施短程化療必須建立在實時掌握結(jié)核患者病情變化和療效的基礎(chǔ)之上，否則，治療的成功與否便無據(jù)可依。目前國內(nèi)外學(xué)者對其療效監(jiān)測技術(shù)和指標做了大量的研究，除了傳統(tǒng)手段以外，分子生物學(xué)、內(nèi)鏡、超聲等技術(shù)在結(jié)核病的診療和效果觀察中發(fā)揮越來越多的優(yōu)勢[2]?，F(xiàn)對其研究進展作一綜述。

1 目前常用的肺結(jié)核療效判定方法

目前臨床上觀察肺結(jié)核病情變化的常用方法有痰涂片鏡檢、傳統(tǒng)改良羅氏培養(yǎng)法、結(jié)核菌素試驗(TST)等，病情變化的標志為癥狀改善、痰菌陰轉(zhuǎn)、病灶吸收、空洞閉合等。

1.1結(jié)核桿菌檢查 最經(jīng)典的肺結(jié)核療效判定方法為：(1)痰或呼吸道分泌物(通過纖支鏡檢吸取分泌物、鏡下毛刷取材、活檢、支氣管肺泡灌液等直接涂片和應(yīng)用集菌法)涂片應(yīng)用萋尼抗酸染色法行抗酸桿菌檢查。(2)結(jié)核桿菌培養(yǎng)。選擇痰或呼吸道分泌物、胸腔積液、腹水、腦脊液等行結(jié)核桿菌培養(yǎng)。培養(yǎng)基從性狀上分主要有固體培養(yǎng)基(如羅氏培養(yǎng)基)、液體培養(yǎng)基(蘇通培養(yǎng)基)、半流體培養(yǎng)基(改良蘇通半流體瓊脂培養(yǎng)基)、固液雙相培養(yǎng)基(Septi-Check AFB雙相培養(yǎng)基)等類型。(3)病理學(xué)檢查。通過肺活檢、胸膜活檢、淋巴結(jié)活檢、手術(shù)切除等留取可疑結(jié)核組織，固定、切片，行病理學(xué)檢查。病理學(xué)檢查結(jié)果被視為結(jié)核診斷的金標準，不足之處是其敏感度差，陽性率較低。

1.2胸部X線片檢查 X線片是早期發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病的重要手段，且通過胸部X線片可以了解肺結(jié)核病灶吸收、空洞閉合情況。王國慶[3]通過對120例痰菌和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)陽性肺結(jié)核患者，選擇6個月短程方案，并在X線片下動態(tài)觀察病灶變化，發(fā)現(xiàn)原病灶吸收、縮小、纖維化、消散，鈣化及自覺癥狀消失，體質(zhì)恢復(fù)，得出X線片變化可作為化療效果的判斷指標。并且X線片檢測應(yīng)用普及，覆蓋面廣，一般醫(yī)院都能開展，使用方便，在結(jié)核病防治工作中仍是必不可缺少的檢查手段。不足之處是其特異度低、缺乏明確的評價標準；時效性差，不能實時反映抗結(jié)核療效，存在滯后性。

1.3紅細胞沉降率(ESR) ESR是一種經(jīng)典急性期反應(yīng)標志物，常用來監(jiān)測炎癥狀態(tài)的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸，還可作為疾病活動與否的監(jiān)測指標，以及監(jiān)測疾病嚴重程度。Mesquita等[4]通過研究發(fā)現(xiàn)，在抗結(jié)核病治療過程中ESR水平明顯下降，結(jié)果表明ESR可以作為結(jié)核病患者療效及預(yù)后的參考指標。不足之處是其特異度低，除結(jié)核以外，各種炎癥性疾病、急性全身性或局部性感染、自身免疫性疾病、嚴重貧血、血液病、慢性肝炎、肝硬化、多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺功能亢進、重金屬中毒、惡性淋巴瘤、巨球蛋白血癥、慢性腎炎等疾病時，ESR也可明顯加快。

1.4結(jié)核菌素皮膚試驗(TST) 該試驗具有操作簡單易行、成本低廉、可目視反應(yīng)結(jié)果等優(yōu)點。但TST所用的純化蛋白質(zhì)衍生物是從結(jié)核分枝桿菌中粗提的抗原混合物，與牛結(jié)核分枝桿菌減毒株(卡介苗)，以及非結(jié)核分枝桿菌的抗原，都存在交叉反應(yīng)，易出現(xiàn)較高的假陽性率，特異度低，且無法區(qū)別既往及現(xiàn)患結(jié)核。而對于營養(yǎng)不良、器官移植、免疫系統(tǒng)功能低下的結(jié)核病患者而言，該方法的靈敏度較低。

2 血清學(xué)檢查

2.1C反應(yīng)蛋白(CRP) CRP是一種非特異性的急性期蛋白，在組織損傷急性期，CRP會相應(yīng)增高。Mendy等[5]通過對肺結(jié)核患者抗結(jié)核病治療前后CRP的動態(tài)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)通過2個月的抗結(jié)核治療，其CRP水平顯著下降，通過6個月治療后其CRP水平進一步下降，結(jié)果表明CRP可以作為評估抗結(jié)核治療療效的一個指標。國外其他學(xué)者也通過研究發(fā)現(xiàn)，監(jiān)測CRP水平可以評估抗結(jié)核病治療效果[6-7]。

2.2降鈣素原(PCT) PCT是降鈣素的前體物質(zhì)，當PCT水平升高時，可以反映炎性反應(yīng)的活躍程度。徐立等[8]將抗結(jié)核治療的患者(觀察組)與未行抗結(jié)核治療的患者(對照組)相比較，結(jié)果顯示觀察組患者抗結(jié)核治療后1、3、6個月后，血清降鈣素原水平明顯降低，顯著低于對照組水平，提示血清降鈣素原可以作為抗結(jié)核治療療效評估的指標之一。

2.3其他 一些學(xué)者也發(fā)現(xiàn)β2微球蛋白[5]、血清球蛋白[9]、血清清蛋白(ALB)、補體成分3(C3)、和載脂蛋白(a)(LPA)[10]、血小板計數(shù)[11]可作為結(jié)核病診斷、療效、活動判斷的重要輔助指標之一。

3 免疫學(xué)

3.1γ-干擾素釋放試驗(IGRA) IGRA是一種體外免疫檢測方法，當結(jié)核特異性抗原[如早期分泌抗原靶分子6(ESAT-6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)]刺激結(jié)核菌抗原致敏的T淋巴細胞時，效應(yīng)記憶T淋巴細胞產(chǎn)生并分泌γ-干擾素(IFN-γ)，通過檢測IFN-γ水平，可以評估抗結(jié)核治療療效。目前，IGRA有結(jié)核分支桿菌γ-干擾素體外釋放定量試驗(TB-IGRA，濃度法)和結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB，斑點法)。

3.2TB-IGRA 有研究發(fā)現(xiàn)，效應(yīng)記憶T淋巴細胞只在人體內(nèi)存在結(jié)核分支桿菌(MTB)時產(chǎn)生，當結(jié)核病治愈后即消失，故抗原特異性IFN-γ體外釋放測定只與體內(nèi)MTB負荷量即結(jié)核活動性呈正相關(guān)，而不受既往結(jié)核感染的影響，從而成為評估抗結(jié)核治療療效的理想指標[12]。且多項研究發(fā)現(xiàn)，TB-IGRA的動態(tài)監(jiān)測可用于評估抗結(jié)核治療療效，當抗結(jié)核治療有效時，TB-IGRA結(jié)果會下降，甚至轉(zhuǎn)陰；若TB-IGRA結(jié)果長期無明顯改善，可能提示抗結(jié)核效果不滿意[13-15]。

3.3T-SPOT.TB T-SPOT.TB是運用酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)檢測結(jié)核分支桿菌感染后T淋巴細胞分泌的特異性細胞因子IFN-γ來判斷結(jié)核感染狀態(tài)，該方法能快速而敏感地診斷結(jié)核。一項研究發(fā)現(xiàn)，抗結(jié)核治療3個月后有62例患者復(fù)查T-SPOT.TB，6個月后有54例患者復(fù)查T-SPOT.TB，其抗原A(ESAT-6)與抗原B(CFP-10)的特異性斑點形成細胞中位數(shù)均顯著低于治療前，T-SPOT.TB可以作為抗結(jié)核治療的效果評價指標[16]。但是該方法也存在一定的不足之處，如無法區(qū)分活動性和潛伏性結(jié)核感染、操作復(fù)雜、試劑成本昂貴等。盡管有Meta分析指出，IGRA對于診斷兒童肺結(jié)核的敏感度具有一定參考價值，但IGRA單獨用于診斷活動性結(jié)核病尚缺乏充足的臨床證據(jù)支持。IGRA診斷活動性結(jié)核敏感度高于結(jié)核菌素(OT)、純蛋白衍生物皮試(PPD)，但特異度較低，會導(dǎo)致部分患者被誤診為活動性結(jié)核。

3.4流式細胞術(shù)(FCM) FCM是利用流式細胞儀對處于液流中的單個細胞或生物顆粒進行定性、定量分析和分選的技術(shù)。有學(xué)者通過流式細胞術(shù)分析研究發(fā)現(xiàn)，在抗結(jié)核病治療中患者CD4+T淋巴細胞、Th1細胞水平升高，Th2細胞水平降低，提示外周血CD4+T淋巴細胞及其亞型(Th1/Th2)細胞水平可以判斷病情變化及治療效果[17]。利用流式細胞術(shù)研究發(fā)現(xiàn)患者CD4+Tim1+細胞和CD3+CD19+CD5+Tim1+細胞在抗結(jié)核治療后明顯下降，提示CD4+Tim1+細胞和CD3+CD19+CD5+Tim1+細胞可以作為療效考核的參考指標[18]。利用流式細胞術(shù)研究發(fā)現(xiàn)雙陰性細胞(DNT)、雙陽性細胞(DPT)百分含量減少，提示DNT和DPT可作為判斷結(jié)核患者免疫狀態(tài)、指導(dǎo)用藥和療效觀察的指標[19]。

3.5酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) ELISA是將抗原與抗體的特異性反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)相結(jié)合，從而建立的一種特異而敏感的技術(shù)，可以進行定性或定量測定。一些學(xué)者通過運用ELISA對比研究發(fā)現(xiàn)，在抗結(jié)核治療過程中血清白細胞介素(IL)-6水平迅速下降，得出監(jiān)測血清IL-6水平可能對監(jiān)測抗結(jié)核治療的臨床效果是有用的[20-21]。還有些學(xué)者運用ELISA發(fā)現(xiàn)趨化因子IP-10可作為鑒別結(jié)核感染的階段之間和監(jiān)測治療效果的診斷標志物[22-23]。

3.5液相芯片技術(shù) 液相芯片技術(shù)是將DNA、抗體等附著于微球表面作為探針，在液相中與待測物結(jié)合，再加入熒光標記的報告分子，借助流式細胞儀檢測微球表面熒光標記物，該方法能檢測蛋白或核酸，特別適用于流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷及蛋白組學(xué)的研究。一項研究通過液相芯片技術(shù)監(jiān)測肺結(jié)核患者治療過程中血清IP-10、IL-17A水平的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)患者血清IP-10、IL-17A水平隨著治療時間延長而下降，提示液相芯片技術(shù)可能可以作為抗結(jié)核治療療效的監(jiān)測方法[24]。

4 分子生物學(xué)

4.1PCR PCR技術(shù)是以體外擴增技術(shù)檢測標本中結(jié)核菌特異性的DNA片段，該方法具有快速、特異、敏感等特點，但檢查技術(shù)質(zhì)量對結(jié)果影響較大[25]。有學(xué)者通過運用PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)髓源性抑制細胞(MDSCs)具有顯著的抑制T細胞反應(yīng)的能力，在調(diào)節(jié)結(jié)核病免疫反應(yīng)中起重要作用，在抗結(jié)核治療有效后該類細胞有減少趨勢，提示這些細胞可作為監(jiān)測抗結(jié)核治療療效的一個潛在的生物標志物[26]。

4.2實時熒光定量PCR(RT-PCR) RT-PCR是一種基于PCR技術(shù)的核酸定量技術(shù)?？娂椅牡萚27]建立檢測人顆粒溶素(GNLY)mRNA含量的實時熒光定量PCR的方法，并測定肺結(jié)核病患者外周血單個核細胞(PBMC)中顆粒溶素(GNLY)的基因表達水平，發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者PBMC GNLY基因表達水平顯著低于對照組，治療前菌陽組PBMC GNLY基因表達水平顯著低于菌陰組，治療后菌陽組PBMC GNLY基因表達水平較治療前顯著升高，提示CNLY基因表達水平可作為肺結(jié)核治療的療效觀察及預(yù)后判斷的一個新的實驗室指標。

4.3蛋白芯片技術(shù) 蛋白芯片技術(shù)具有簡便、快速、準確，敏感度較高、特異度強和檢測成本低等優(yōu)點，是臨床輔助診斷結(jié)核病的有效方法。結(jié)核分支桿菌蛋白芯片技術(shù)同時用結(jié)核菌脂阿拉伯甘露糖(LAM)、蛋白16×103和38×103等3種抗原進行檢測,提高了檢測的陽性率。有研究發(fā)現(xiàn),當治療有效或感染被控制時，抗體水平會隨之下降，反映出結(jié)核蛋白芯片能動態(tài)監(jiān)測這3種抗體水平，故結(jié)核蛋白芯片能動態(tài)監(jiān)測抗結(jié)核病治療療效[28-29]。Deng等[30]利用釀酒酵母系統(tǒng)可溶表達結(jié)核分支桿菌蛋白并點制成蛋白芯片，利用芯片尋找血清中的生物標記物以評估治療效果。不足之處是敏感度、特異度尚不夠高。目前對蛋白芯片技術(shù)對結(jié)核病療效的監(jiān)測尚缺乏系統(tǒng)研究。

5 展 望

當痰涂片檢測抗酸染色陰性時，臨床很難對肺結(jié)核進行快速的明確診斷。目前結(jié)核病的療效監(jiān)測技術(shù)方法和指標很多，除文中列舉以外，尚有其他許多新型手段在臨床和實驗中探討應(yīng)用。每種技術(shù)方法和指標均有其各自的優(yōu)缺點，但目前仍缺乏方便、快捷、有效、價廉的判斷方法和指標，主要依賴多指標檢測及臨床綜合評估。如何更好、更快地實時監(jiān)測結(jié)核病情變化與治療效果，為合理用藥和規(guī)范治療提供科學(xué)依據(jù)，及早發(fā)現(xiàn)耐藥、及時更換治療方案、減少經(jīng)濟浪費、減輕不必要用藥對患者的損害、提高服藥依從性、選擇最佳治療方案、改善結(jié)核預(yù)后、提高治愈率成為當前研究的方向。通過侵入性操作提高樣本的取樣有效率，應(yīng)用靈敏、特異、快速的免疫學(xué)及分子生物學(xué)檢測，可能具有良好的研究前景。

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R516

A

1671-8348(2017)31-4441-03

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.31.044

重慶市衛(wèi)生和計劃生育委員會醫(yī)學(xué)科研重點項目(2013-1-038)。

陳云坤(1992-)，在讀碩士，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病的診療工作?！?/p>

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2017-04-11

2017-07-13)