納豆芽孢桿菌優(yōu)良菌株的篩選及人工消化液耐受性研究

焦苗苗，李宏梁＊，曾橋，樊璐，趙欣

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，西安 710021；2.陜西宏梁食品科技有限公司，西安 710065）

納豆芽孢桿菌優(yōu)良菌株的篩選及人工消化液耐受性研究

焦苗苗1，李宏梁1＊，曾橋1，樊璐2，趙欣2

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，西安 710021；2.陜西宏梁食品科技有限公司，西安 710065）

從市售的燕京、順食真、御城3種品牌的納豆中利用脫脂牛奶平板分離初篩得到35株疑似納豆芽孢桿菌，經(jīng)瓊脂糖-纖維蛋白平板復(fù)篩得到1株纖溶酶活性相對(duì)較高的菌株CN11；進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化特性及16SrDNA分子生物學(xué)鑒定，確定CN11為納豆芽孢桿菌。對(duì)該菌進(jìn)行人工消化液耐受性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：CN11在pH 1.5，2.5，3.5的人工胃液中作用，活菌數(shù)隨pH的降低和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，但最終仍在107cfu/mL以上；在人工腸液中作用，活菌數(shù)隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢上升，最終為5.7×108cfu/mL；在含0.3%牛膽鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，活菌數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，但最終仍在108cfu/mL以上；可見(jiàn)CN11對(duì)人工消化液有很強(qiáng)的耐受性。因此，CN11是一株具有相對(duì)較高纖溶酶活性，并對(duì)人體消化道逆環(huán)境有較強(qiáng)耐受力的納豆芽孢桿菌。

納豆芽孢桿菌；篩選鑒定；人工消化液；耐受性

納豆芽孢桿菌是日本的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品——納豆的發(fā)酵菌種，屬細(xì)菌科芽孢桿菌屬，是美國(guó)FDA公布的40種益生菌之一［1］。納豆芽孢桿菌不僅能在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)，如納豆激酶、超氧化物歧化酶（SOD）、血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶（ACE）、Pyrazine、VK2等［2，3］，使納豆具有溶解血栓、降低血液粘稠度、抗氧化、抗腫瘤、降血壓、預(yù)防骨質(zhì)疏松等保健功能［4－6］；而且能在被食用后進(jìn)入腸道生活達(dá)幾周，促進(jìn)腸道益生菌的繁殖，抑制腸道致病菌的生長(zhǎng)，維持并調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫力［7］。所以，納豆芽孢桿菌是一種優(yōu)良的益生菌，但目前國(guó)內(nèi)外研究納豆芽孢桿菌主要集中在其產(chǎn)物納豆激酶，而對(duì)納豆芽孢桿菌作為益生菌的生物特性研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)以市售的3種品牌的納豆為原料，利用脫脂牛奶平板和瓊脂糖-纖維蛋白平板分離篩選纖溶酶活性相對(duì)較高的納豆芽孢桿菌，進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化特性和分子生物學(xué)鑒定，并研究其對(duì)人工消化液的耐受性，為該菌株作為益生菌的功能應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試樣品

燕京納豆 北京燕京中發(fā)生物技術(shù)有限公司；順食真納豆 北海道小樽市錢函株式會(huì)社；御城納豆大連美屋食品有限公司。

1.1.2 主要試劑

伊利高蛋白脫脂高鈣奶粉 內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；瓊脂糖 Biowest公司；纖維蛋白源（牛血）、凝血酶（牛血） 中國(guó)食品藥品檢定所；細(xì)菌DNA提取試劑盒TaqDNA聚合酶、DNA膠回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；DL 2000Marker 上海晨易生物科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶 Sigma公司；牛膽鹽 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為生物試劑或分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

脫脂牛奶培養(yǎng)基：脫脂奶粉2%，瓊脂粉2%，pH 7.0～7.2。斜面培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，瓊脂1.5%，pH 7.0～7.2。液體種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%，pH 7.0～7.2。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨0.2%，葡萄糖2%，NaCl 0.5%，KH2PO40.2%，K2HPO40.4%，pH 7.0～7.2。

1.1.4 儀器與設(shè)備

BSC-1300II超凈工作臺(tái)，SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX-40II型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；THZ-C-1全溫振蕩器 上海中庸檢驗(yàn)設(shè)備有限公司；TH-2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海博翎儀器設(shè)備有限公司；BK 5000生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；MyCycler PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司；WD-9413A型凝膠成像分析儀 北京市六一儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納豆芽孢桿菌的分離與初篩

稱取市售3種品牌的納豆各10g分別置于90mL滅菌生理鹽水中，120r/min振蕩30min，85℃水浴20min，迅速于冷水浴中冷卻至室溫，制得芽孢懸液；將上述芽孢懸液用滅菌生理鹽水梯度稀釋，分別取10－5～10－9各稀釋度的樣品勻液100μL涂布于脫脂牛奶培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)18～24h后，挑取符合納豆芽孢桿菌菌落形態(tài)且水解酪蛋白透明圈與菌落直徑比值較大的單菌落，在脫脂牛奶培養(yǎng)基上連續(xù)劃線分離至純，斜面保藏備用。

1.2.2 復(fù)篩

瓊脂糖-纖維蛋白平板按照文獻(xiàn)［8］方法制備。分別挑取初篩菌株各1環(huán)接種于液體種子培養(yǎng)基中（裝液量50mL/250mL），37℃，200r/min，恒溫培養(yǎng)20h，最終OD600＝7～8。按照2%的接種量將上述種子液接入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中（裝液量50mL/250mL），37℃，200r/min培養(yǎng)48h后，取發(fā)酵液于8000r/min冷凍離心15min，分別取上清液各10μL于瓊脂糖-纖維蛋白平板中點(diǎn)樣，在37℃恒溫反應(yīng)18h后測(cè)量溶纖圈直徑，挑選溶纖圈直徑較大（纖溶酶活性相對(duì)較高）的菌株斜面保藏。

1.2.3 形態(tài)特征及生理生化特性鑒定

依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）［9］和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［10］對(duì)復(fù)篩得到的酶活力較高的菌株進(jìn)行菌體、菌落形態(tài)和生理生化特性鑒定。

1.2.4 分子生物學(xué)（16SrDNA）鑒定

利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取復(fù)篩所得菌株的基因組DNA，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25μL）為：2×Ex Taq Premix buffer 12.5μL，通用引物（27F/1492R）各0.5μL，模板0.5μL，ddH2O 12.5μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃退火45s，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣至1%瓊脂糖凝膠中，150V恒定電壓下電泳約20min，并將產(chǎn)物純化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，所得序列與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的細(xì)菌16SrDNA序列做Blast相似性比對(duì)分析，運(yùn)用CLUSTAL X和MEGA 5.1軟件選取Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 人工胃液耐受性實(shí)驗(yàn)

無(wú)菌人工胃液按照文獻(xiàn)［11，12］方法配制。以10%的接種量將活化后的納豆芽孢桿菌的種子液分別接入到pH值為1.5，2.5，3.5的無(wú)菌人工胃液中，37℃，180r/min搖床培養(yǎng)，分別于0，0.5，1，2，3h各取樣1mL進(jìn)行梯度稀釋，平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)。

1.4 人工腸液耐受性實(shí)驗(yàn)

無(wú)菌人工腸液按照文獻(xiàn)［11］方法配制。以10%的接種量將活化后的納豆芽孢桿菌的種子液接入到無(wú)菌人工腸液中，37℃，180r/min搖床培養(yǎng)，分別于0，2，4，6，8h各取樣1mL進(jìn)行梯度稀釋，平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)。

1.5 牛膽鹽耐受性實(shí)驗(yàn)

以10%的接種量將活化后的納豆芽孢桿菌的種子液接入含有0.3%（W/V）牛膽鹽的無(wú)菌膽鹽培養(yǎng)基中，37℃，180r/min搖床培養(yǎng)，分別于0，2，4，6，8h各取樣1mL進(jìn)行梯度稀釋，平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 納豆芽孢桿菌的篩選與鑒定

2.1.1 納豆芽孢桿菌的分離與篩選結(jié)果

納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)過(guò)程中可以產(chǎn)生耐熱的芽孢，并分泌一種既具有水解酪蛋白活性又具有很強(qiáng)纖溶活性的堿性絲氨酸蛋白酶——納豆激酶［13］。依據(jù)這種特性，以水解酪蛋白透明圈和菌落直徑的比值為指標(biāo)，從燕京、順食真、御城3種品牌的納豆中共分離初篩出35株菌體和菌落形態(tài)與納豆芽孢桿菌相似的菌株，編號(hào)為JN1～JN7，SN1～SN15，CN1～CN13。再經(jīng)瓊脂糖-纖維蛋白平板對(duì)35株菌株多次復(fù)篩，比較溶纖圈大小，最終確定CN11為纖溶酶活性相對(duì)較高的菌株。

2.1.2 CN11的菌體與菌落形態(tài)

將CN11在脫脂牛奶培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后，革蘭氏染色并鏡檢，觀察菌體和菌落形態(tài)，見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 CN11的菌體和芽孢形態(tài)Fig.1Bacteria and spores form of CN11

圖2 CN11在脫脂牛奶培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.2Colony morphology of CN11on skim milk growth medium

由圖1可知，CN11的菌體為桿狀，長(zhǎng)度約為2～3μm，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，產(chǎn)芽孢且為橢圓或柱狀，中生或者近中生。由圖2可知，CN11在脫脂牛奶培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)形成透明圈，且菌落形狀為圓形，呈灰白色或乳白色，直徑約為2.0～6.2mm，邊緣不整齊，表面干燥粗糙、有褶皺、中間向上突起。

2.1.3 CN11的生理生化特性鑒定結(jié)果

CN11的生理生化特性鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）可知其符合枯草芽孢桿菌的生理生化特性，初步鑒定CN11為枯草芽孢桿菌屬。

表1 CN11的生理生化特性Table 1Physiological and biochemical characteristics of CN11

2.1.4 CN11的分子生物學(xué)（16SrDNA）鑒定結(jié)果

由PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)圖3）和測(cè)序結(jié)果可知，CN11的序列長(zhǎng)度為1463bp。將該序列與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的細(xì)菌16SrDNA序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析并運(yùn)用CLUSTAL X和MEGA 5.1軟件選取Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見(jiàn)圖4），結(jié)果表明：CN11序列與Bacillussubtilis（HQ605916.1）的16SrDNA序列同源性為100%，與Bacillussubtilissubsp.natto（EF660338.1）的16SrDNA序列同源性為99%，并且在進(jìn)化樹中處于同一分支。再結(jié)合CN11的形態(tài)特征、生理生化特性鑒定結(jié)果及可產(chǎn)生納豆激酶的特點(diǎn)，可確定該菌株是納豆芽孢桿菌。

圖3 CN11的16SrDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3Electrophoresis of PCR product of 16SrDNA from CN11

圖4 CN11的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4Phylogenetic tree of CN11

2.2 CN11對(duì)人工胃液的耐受性

納豆芽孢桿菌作為益生菌，必須經(jīng)過(guò)胃部的逆環(huán)境并保持較高活菌數(shù)進(jìn)入腸道才能發(fā)揮其益生作用，而胃液的pH值、胃蛋白酶以及菌株在胃液中停留的時(shí)間都會(huì)對(duì)其活菌數(shù)產(chǎn)生較大的影響［14］。一般食物（流體）經(jīng)胃消化的時(shí)間是1～2h，人體胃液的pH值隨著飲食的不同在1.5～5.0之間波動(dòng)，一般保持在3.0左右［15］。因此，CN11必須在經(jīng)過(guò)胃液的低pH和胃蛋白酶作用后仍保持較高的活菌數(shù)。

圖5 CN11與不同pH值的人工胃液作用不同時(shí)間的活菌數(shù)Fig.5Changes of viable CN11count during incubation in artificial gastric fluid at different pH values

由圖5可知，在pH 1.5，2.5，3.5的人工胃液中隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，CN11的活菌數(shù)均存在不同程度的下降。CN11在pH 1.5的人工胃液中作用至1～2h之間時(shí)，活菌數(shù)從1.2×108cfu/mL減少至9.6×107cfu/mL，下降了1個(gè)數(shù)量級(jí)，但3h后活菌數(shù)仍在107cfu/mL以上；在pH 2.5和pH 3.5的人工胃液中作用，活菌數(shù)雖緩慢下降但始終處于108cfu/mL以上。這表明CN11對(duì)較低的pH值和胃蛋白酶具有較強(qiáng)的耐受力，可以順利進(jìn)入腸道發(fā)揮益生作用。

2.3 CN11對(duì)人工腸液的耐受性

益生菌必須在腸道中保持106cfu/mL以上的活菌數(shù)才能發(fā)揮其益生作用，而腸道中腸液的作用是影響益生菌活菌數(shù)的主要因素之一［16］。因此，CN11作為益生菌對(duì)腸液的作用必須有一定的抗性。

圖6 CN11與人工腸液作用不同時(shí)間的活菌數(shù)Fig.6Changes of viable CN11counts during incubation in artificial intestinal fluid

由圖6可知，CN11的活菌數(shù)在人工腸液中隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢上升，消化8h后為5.7× 108cfu/mL，說(shuō)明CN11可以在人工腸液中存活并生長(zhǎng)，這與張媛媛［17］研究復(fù)合芽孢桿菌（BS，BC）及閔鐘熳等［18］研究芽孢桿菌在人工腸液中的耐受性時(shí)得出的結(jié)論是一致的，可見(jiàn)CN11對(duì)人工腸液的作用有很強(qiáng)的抗性。

2.4 CN11對(duì)牛膽鹽的耐受性

膽鹽對(duì)CN11活菌數(shù)的影響主要與膽鹽的濃度、菌株自身的特性及菌株與膽鹽的接觸時(shí)間等因素有關(guān)［19］。膽鹽可通過(guò)改變菌體外膜通透性影響菌株的生長(zhǎng)，其濃度越高作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)菌株生長(zhǎng)影響越大。因此，CN11必須耐受膽鹽的抑制作用并保持較高的活菌數(shù)才能在人體腸道中定植并發(fā)揮作用。正常人體腸道中的膽鹽濃度在0.03%～0.3%（W/V）之間波動(dòng)，食物通過(guò)腸道一般需要6～8h［20］，因此本實(shí)驗(yàn)采用腸道最大膽鹽濃度0.3%（W/V）作用0～8h研究CN11對(duì)膽鹽的耐受性，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 CN11對(duì)0.3%（W/V）牛膽鹽的耐受性Fig.7Tolerance of CN11to 0.3%（W/V）bile salt

由圖7可知，CN11的活菌數(shù)隨著在膽鹽培養(yǎng)基中作用時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，但在8h后仍處于108cfu/mL以上，可見(jiàn)CN11對(duì)膽鹽具有較強(qiáng)的耐受性。

3 結(jié)論

本研究利用納豆芽孢桿菌能產(chǎn)生水解酪蛋白和纖溶活性酶的特點(diǎn)，從市售3種品牌的納豆中經(jīng)分離、篩選得到1株纖溶酶活性相對(duì)較高的菌株CN11。該菌的形態(tài)特征和生理生化特性基本與枯草芽孢桿菌相同，分子生物學(xué)鑒定結(jié)果為納豆芽孢桿菌。CN11在不同pH值的人工胃液中作用，活菌數(shù)隨pH的降低和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，在pH 1.5的人工胃液中作用1～2h時(shí)活菌數(shù)下降1個(gè)數(shù)量級(jí)，但3h后仍在107cfu/mL以上，在pH 2.5，3.5的人工胃液中作用3h后活菌數(shù)均保持在108cfu/mL以上；在人工腸液中作用，活菌數(shù)隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢上升，8h后活菌數(shù)為5.7×108cfu/mL；在牛膽鹽含量為0.3%的膽鹽培養(yǎng)基中作用，活菌數(shù)隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而下降，但8h后活菌數(shù)仍處于108cfu/mL以上；可見(jiàn)CN11對(duì)人工消化液有很強(qiáng)的耐受性。因此，本實(shí)驗(yàn)中的CN11是一株纖溶酶活性相對(duì)較高且對(duì)人工消化液具有很強(qiáng)耐受性的納豆芽孢桿菌，在功能性納豆產(chǎn)品中具有一定應(yīng)用潛力。

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Study on Screening and Tolerance to Artificial Digestive Juice of EximiousBacillusnatto

JIAO Miao-miao1，LI Hong-liang1＊，ZENG Qiao1，F(xiàn)AN Lu2，ZHAO Xin2
（1.School of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi＇an 710021，China；2.Shaanxi Hongliang Food Science and Technology Co.，Ltd.，Xi＇an 710065，China）

35strains of suspectedBacillusnattoare isolated from three different brands of natto，such as Yanjing，Shunshizhen and Yucheng by using skim milk plate.CN11with high activity of fibrinolytic enzyme is obtained after second screening by agarose fibrin plate.It is proved to beBacillusnattothrough morphological，physiological and biochemical characteristics＇determination and molecular identification for 16SrDNA.The study on its tolerance to artificial digestive juice is conducted.The results show that the viable count of CN11falls gradually with the decrease of pH and the increase of incubation time when the pH of artificial gastric fluid equals to 1.5，2.5and 3.5，eventually remains more than 107cfu/mL.The viable count of CN11rises slightly with the increase of incubation time in artificial intestinal fluid，and eventually achieves5.7×108cfu/mL.The viable count of CN11falls gradually with the increase of culture time in culture medium containing 0.3%bovine bile salts，eventually remains more than 108cfu/mL，which indicates that CN11has strong tolerance to artificial digestive juice.Therefore，CN11is aBacillusnattowith relatively high fibrinolytic activity and strong tolerance to reverse environment of alimentary tract.

Bacillusnatto；screening and identification；artificial digestive juice；tolerance

TS261.13

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.001

1000-9973（2017）03-0001-05

2016－09－15 ＊通訊作者

焦苗苗（1991－），女，陜西臨潼人，碩士，研究方向：食品發(fā)酵；李宏梁（1967－），男，陜西高陵人，副教授，研究方向：食品微生物。