固相萃取-在線光化學(xué)衍生-熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定辣椒制品中4種蘇丹紅染料

王韋崗，唐雙雙，陸源，朱新生

（鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇鎮(zhèn)江 212132）

固相萃取-在線光化學(xué)衍生-熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定辣椒制品中4種蘇丹紅染料

王韋崗，唐雙雙，陸源，朱新生

（鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇鎮(zhèn)江 212132）

建立了固相萃取-在線光化學(xué)衍生-熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定辣椒制品中蘇丹紅 Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B的方法。用丙酮和乙腈的混合溶液（2∶8）提取樣品中4種蘇丹紅染料，提取液濃縮后經(jīng)C18固相萃取柱凈化，采用高效液相色譜進(jìn)行分離，在線光化學(xué)衍生后進(jìn)入熒光檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：4種蘇丹紅在0.10～1.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999；低、中、高3個(gè)不同加標(biāo)濃度下，4種蘇丹紅的回收率均大于85%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.58%～4.36%；方法的檢出限（LOD）為0.30～0.45μg/kg，定量限（LOQ）為1.00～1.50μg/kg。該方法具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適用于食品中蘇丹紅殘留的分析檢測(cè)。

固相萃?。还饣瘜W(xué)衍生；高效液相色譜；熒光檢測(cè)法；蘇丹紅

蘇丹紅（Sudan dyes）又名油性紅、溶劑紅，是一類以苯基偶氮萘酚為主要基團(tuán)的人工合成色素，主要用于石油、機(jī)油等工業(yè)溶劑中，起到增色作用［1］。由于用蘇丹紅染色后的食品顏色鮮艷且不易褪色，一些不法食品企業(yè)把蘇丹紅作為色素添加到食品中，然而這類化合物在降解過程中會(huì)產(chǎn)生苯胺和萘酚，具有致突變性和致癌性［2－4］，對(duì)人體的肝腎器官具有明顯的毒性作用，我國以及歐盟嚴(yán)令禁止其作為色素在食品中使用［5］。

國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19681－2005采用高效液相色譜-紫外法測(cè)定食品中的蘇丹紅［6］，該方法靈敏度較低，在測(cè)定時(shí)需要切換掃描波長，不利于操作。熒光檢測(cè)法具有選擇性好、靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，在分析科學(xué)及其他相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多［7－10］，而蘇丹紅的熒光響應(yīng)較低，以熒光檢測(cè)法測(cè)定時(shí)需要對(duì)其進(jìn)行衍生，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂休^強(qiáng)熒光響應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此開展研究蘇丹紅分子的熒光性質(zhì)，利用其熒光現(xiàn)象建立蘇丹紅的檢測(cè)新方法具有重要的實(shí)際意義。本文采用C18固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行濃縮、凈化，建立了高效液相色譜分離-在線光化學(xué)衍生-熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定辣椒制品中蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B的方法，該方法具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適用于食品中蘇丹紅殘留的分析檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器及設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀（主要包括2475熒光檢測(cè)器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器等）；光化學(xué)衍生器（由紫外燈、聚四氟乙烯反應(yīng)管組成） 北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；超生波清洗器；離心機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；氮?dú)獯蹈蓛x；Millpore超純水系統(tǒng)；CNWBOND HC-C18（500mg/6mL）固相萃取柱 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試劑

乙腈、甲醇和丙酮：色譜純，美國Tedia公司；無水硫酸鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水：Millpore超純水。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：蘇丹紅Ⅰ（純度≥99.0%），蘇丹紅Ⅱ（純度≥99.0%），蘇丹紅Ⅲ（純度≥96.0%），蘇丹紅B（純度≥90.0%） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.3 分析測(cè)定條件

色譜柱：CNW Athena C18－WP（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相A為乙腈，B為甲醇，梯度洗脫：0～11min，100%A；11～12min，100%A～0%A，0%B～100%B，12～25min，100%B；流速：0.8mL/min；進(jìn)樣體積：20μL；柱溫：30℃；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長310nm，發(fā)射波長348nm。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品的提取

稱取2.0g試樣于50.0mL離心管中，加入5.0g無水Na2SO4，20.0mL丙酮-乙腈（2∶8）溶液，超聲提取20min，以5000r/min離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至250mL雞心瓶中，殘留物用20.0mL丙酮-乙腈溶液重復(fù)提取1次，合并上清液，并在40℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1mL，待凈化。

1.4.2 固相萃取柱富集凈化

C18固相萃取柱依次用5mL乙腈、5mL水進(jìn)行活化和平衡，然后將上述待凈化液上樣過柱，用1mL丙酮-乙腈溶液潤洗雞心瓶，并將潤洗液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，用5mL水淋洗，再用5mL丙酮-乙腈溶液進(jìn)行洗脫，收集全部洗脫液，氮?dú)獯蹈桑帽?乙腈溶液重新定容至1mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進(jìn)樣分析。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B，加入少量丙酮超聲溶解后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用乙腈稀釋成濃度為0.10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放置于4℃冰箱中避光保存。臨用前，分別準(zhǔn)確吸取一定體積的0.10mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈逐級(jí)稀釋到相應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 掃描波長的選擇

采用Waters 2475熒光檢測(cè)器自帶的3D掃描功能分別在波長200～340nm，330～600nm范圍內(nèi)掃描4種蘇丹紅光化學(xué)衍生產(chǎn)物的激發(fā)波長和發(fā)射波長，掃描結(jié)果見圖1。

圖1 4種蘇丹紅光化學(xué)衍生產(chǎn)物的（a）激發(fā)光譜和（b）發(fā)射光譜圖Fig.1（a）Excitation and（b）emission spectra of Sudan dyes after irradiation

由圖1可知，蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B經(jīng)光化學(xué)衍生后其衍生產(chǎn)物的最佳激發(fā)波長分別為312，312，305，305nm；最佳發(fā)射波長均為348nm，因此本文選擇激發(fā)波長310nm、發(fā)射波長348nm作為掃描波長對(duì)4種蘇丹紅進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。

2.2 檢測(cè)方法的選擇

分別采用熒光檢測(cè)器和柱后光化學(xué)衍生-熒光檢測(cè)器對(duì)相同濃度的4種蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見圖2。

圖2 光化學(xué)衍生前（a）、后（b）4種蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2Chromatogram of the standard solution of Sudan dyes（a）before and（b）after irradiation

由圖2可知，采用熒光檢測(cè)器測(cè)定時(shí)，4種蘇丹紅僅表現(xiàn)出微弱的熒光響應(yīng)，不利于痕量組分含量的測(cè)定；經(jīng)光化學(xué)衍生后，4種蘇丹紅的熒光響應(yīng)大為增加，這是由于蘇丹紅是一類萘酚偶氮結(jié)構(gòu)型染料，其分子結(jié)構(gòu)中的偶氮基團(tuán)具有光化學(xué)活性，在光照作用下能夠發(fā)生順式和反式結(jié)構(gòu)的互變［11］，甚至能夠與溶劑發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，從而導(dǎo)致偶氮化合物的性質(zhì)發(fā)生顯著的變化，生成具有較強(qiáng)熒光響應(yīng)的物質(zhì)。

2.3 流動(dòng)相的選擇

分別以乙腈、甲醇、乙腈-水（98∶2）、甲醇-水（98∶2）、乙腈-甲醇（98∶2）為流動(dòng)相等度洗脫，光化學(xué)衍生后測(cè)定，考察4種蘇丹紅的出峰及分離情況，結(jié)果見圖3。以乙腈為流動(dòng)相時(shí)，4種蘇丹紅均能產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光響應(yīng)，且4種蘇丹紅具有很好的分離度；以甲醇為流動(dòng)相時(shí)，蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ僅有微弱的熒光響應(yīng)，響應(yīng)值較低，難以滿足蘇丹紅殘留的檢測(cè)要求，蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅B具有較強(qiáng)的熒光響應(yīng)，與乙腈為流動(dòng)相相比其響應(yīng)值更高；以乙腈-水（98∶2）、甲醇-水（98∶2）、乙腈-甲醇（98∶2）為流動(dòng)相時(shí)，蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ的熒光響應(yīng)均較弱，與未發(fā)生光化學(xué)衍生反應(yīng)測(cè)定的響應(yīng)值相近。上述實(shí)驗(yàn)表明：蘇丹紅的光化學(xué)衍生反應(yīng)及反應(yīng)產(chǎn)物的熒光性質(zhì)與參加反應(yīng)的溶劑相關(guān)，蘇丹紅Ⅰ和蘇丹紅Ⅱ在純乙腈條件下才能發(fā)生光化學(xué)衍生反應(yīng)，當(dāng)流動(dòng)相中含有微量的水和甲醇時(shí)都會(huì)影響其光化學(xué)反應(yīng)；蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅B與甲醇和乙腈均能發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，微量的水不影響這兩者的光化學(xué)反應(yīng)，而且在甲醇流動(dòng)相中兩者的光化學(xué)衍生產(chǎn)物的熒光響應(yīng)值更高，主要原因是隨著蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅B分子結(jié)構(gòu)中共軛體系的增大，分子極性減弱，從而在極性較弱的甲醇中表現(xiàn)出更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度［12］。因此，分別選擇乙腈和甲醇為光化學(xué)反應(yīng)的溶劑，采用梯度洗脫的方法對(duì)4種蘇丹紅進(jìn)行分離和測(cè)定。

圖3 流動(dòng)相對(duì)4種蘇丹紅光化學(xué)衍生及分離度的影響Fig.3Effects of mobile phase on photochemical derivatization and resolution

2.4 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

現(xiàn)有的國家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蘇丹紅時(shí)通常采用乙腈直接提取或者氧化鋁層析柱凈化的方法進(jìn)行樣品前處理［13，14］，而前者容易受到樣品基質(zhì)的影響，提取后存在大量的干擾物質(zhì)，影響目標(biāo)物質(zhì)的定性和定量；后者處理方法較為繁瑣，氧化鋁的活性對(duì)方法回收率的影響很大?？瞻讟悠泛图訕?biāo)樣品采用C18固相萃取柱凈化后測(cè)定的色譜圖見圖4。

圖4 （a）空白樣品（b）加標(biāo)樣品的色譜圖Fig.4Chromatogram of（a）blank sample and（b）condiment sample spiked with Sudan dyes

由圖4可知，C18固相萃取柱對(duì)4種蘇丹紅具有很好的保留作用，以水為淋洗液可以一次性去除樣品中大部分水溶性干擾物質(zhì)，減少雜質(zhì)對(duì)蘇丹紅檢測(cè)結(jié)果的影響，同時(shí)采用C18固相萃取柱進(jìn)行樣品前處理，對(duì)待測(cè)組分還具有濃縮和富集的作用，有利于降低待測(cè)組分的檢出限。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

分別準(zhǔn)確吸取適量體積的蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈逐級(jí)稀釋成一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（y，μV·s）對(duì)質(zhì)量濃度（x，μg/mL）作圖，所得線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)（R2）見表1。向陰性火鍋底料樣品中添加低濃度水平的蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法進(jìn)行樣品前處理后上機(jī)檢測(cè)，以S/N＝3為檢出限（LOD），S/N＝10為定量限（LOQ），結(jié)果見表1。

表1 方法的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）Table 1Linear ranges，regression equations，correlation coefficients，limits of detection and limits of quantitation of the method

由表1可知，采用外標(biāo)峰面積法定量，4種蘇丹紅在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.999。與國標(biāo)方法相比，可較好地減少樣品濃縮、凈化等樣品前處理過程帶來的誤差，該方法線性范圍寬，檢出限低，可滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)。

2.6 回收率和精密度

向陰性火鍋底料樣品中分別加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并以上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品處理和測(cè)定，考察實(shí)驗(yàn)方法的回收率，并對(duì)加標(biāo)樣品重復(fù)測(cè)定6次，考察實(shí)驗(yàn)方法的精密度?；厥章屎途芏冉Y(jié)果見表2。

表2 樣品中蘇丹紅加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Table 2Recoveries and relative standard deviations of Sudan dyes in condiment（n＝6）

由表2可知，蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B的回收率均在85%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.58%～4.36%。

3 結(jié)論

本文以C18固相萃取柱凈化樣品，富集蘇丹紅染料，并基于紫外光照射能夠增強(qiáng)蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B的熒光響應(yīng)，建立了固相萃取-在線光化學(xué)衍生-熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定辣椒制品中4種蘇丹紅染料的方法。該方法能夠有效去除樣品中雜質(zhì)干擾，具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適用于食品中蘇丹紅殘留的分析檢測(cè)。

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Determination of Four Sudan Dyes in Chili Products by HPLC with On-line Photochemical Derivatization and Fluorescence Detection

WANG Wei-gang，TANG Shuang-shuang，LU Yuan，ZHU Xin-sheng
（Zhenjiang Center for Products Quality Supervision and Inspection，Zhenjiang 212132，China）

A method for the measurement of Sudan I，SudanⅡ，SudanⅢand Sudan B in chili products using high performance chromatography（HPLC）with on-line photochemical derivatization and fluorescence detection has been developed.The four kinds of Sudan dyes in samples are extracted by acetone/acetonitrile（2∶8）.The extract is purified by C18solid-phase extraction column and separated by HPLC.Sudan dyes are detected by fluorescence detection after on-line photochemical derivatization，and quantified by external standard method.The results show that the calibration curves for four kinds of Sudan dyes are linear in the range of 0.10～1.05μg/mL，with correlation coefficient（R2）more than 0.999.The recoveries of the standards spiked in real chili products samples for four kinds of Sudan dyes are above 85%，the relative standard deviation RSD（%）is 1.58%～4.36%.The limits of detection（LODs）are in the range of 0.30～0.45μg/kg and the limits of quantification（LOQs）are 1.00～1.50μg/kg.The developed method is simple，sensitive，with good repeatability and can be applied for the routine analysis of Sudan dyes in food.

solid-phase extraction；photochemical derivatization；HPLC；fluorescence detection；Sudan dyes

TS201.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.032

1000-9973（2017）03-0133-05

2016－09－14

王韋崗（1984－），男，工程師，碩士，主要從事食品檢測(cè)工作。