II型先天性厚甲癥一家系KRT基因突變檢測

曹 靜孫樂樂付希安王真真于功奇劉 紅張福仁，

·論著·

II型先天性厚甲癥一家系KRT基因突變檢測

曹 靜1孫樂樂2付希安2王真真2于功奇2劉 紅2張福仁1，2

目的:檢測先天性厚甲癥一家系中KRT6b和KRT17基因突變位點(diǎn)。方法:提取先證者、其父母(母親為患者，父親正常人)及100名正常對照者外周靜脈血DNA，PCR技術(shù)擴(kuò)增KRT6b和KRT17基因編碼序列，Sanger測序法對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。結(jié)果:先癥者及其母親在KRT17基因1號外顯子上存在錯義突變(c．275A＞G)，KRT6b基因不存在任何突變。先證者父親及100名正常對照者中未檢測到任何突變。結(jié)論:此家系患者是由于KRT17基因突變(c．275A＞G，p．Asn92Ser)所致。

先天性厚甲癥;基因突變;KRT基因

先天性厚甲癥(pachyonychia congenital，PC)是一種罕見的常染色體顯性遺傳性皮膚病，1906年由Jadasshon和Lewandowsky首先報道。本病以厚甲、掌跖角化、多汗，毛囊角化為特征。根據(jù)臨床表現(xiàn)分為4型:PC－I型又稱Jadasshon－Lewandowsky綜合征(OMIM167200)，最為常見，除上述特征性表現(xiàn)外多有口腔黏膜白斑;PC－II型又稱Jackson－Lawell綜合征(OMIM167210))，多有胎生牙及多發(fā)性囊腫;PC－III型較罕見，有眼部受累;PC－IV型有咽喉損害、智力障礙及色素沉著等臨床表現(xiàn)。前期通過DNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)PC的發(fā)生與角蛋白(KRT)相關(guān)［1］，其中PC－I型為KRT6a和KRT16基因突變所致，PC－II型為KRT6b和KRT17突變所致［2－4］。近年來報道顯示KRT6c基因突變也與PC的發(fā)病有關(guān)，但病例報道較少［5，6］。本研究對一患有先天性厚甲II型的家系成員進(jìn)行了樣本和臨床資料收集，利用PCR和DNA測序法對KRT6b和KRT17基因進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示KRT17基因1號外顯子發(fā)生突變(A92S)，報道如下。

1 材料與方法

1．1 臨床資料患者家系來自山東濟(jì)寧(圖1)。先癥者:男，7歲。雙側(cè)手足部指(趾)甲共16甲(除雙手無名指和小拇指)增厚7年余?；純鹤阍?，順產(chǎn)，出生時下牙槽即有兩顆牙齒，出生1個月開始出現(xiàn)雙手足指(趾)甲增厚，隨著年齡增長，指甲(趾)肥厚變黃逐漸明顯。2歲時足底開始偶有水皰發(fā)生，能自行消退。體格檢查:患兒一般情況好，生長發(fā)育正常，毛發(fā)正常，無心、肺、肝、脾、腎疾病。皮膚科檢查:面部散在數(shù)個小米大淡黃色丘疹(圖2a)。未見毛囊角化、口腔黏膜白斑、聲音嘶啞和毛發(fā)異常等表現(xiàn)。雙側(cè)指(趾)甲呈黃褐色，由近端到遠(yuǎn)端呈楔形增厚，甲遠(yuǎn)端翹起，甲下充滿硬性角質(zhì)樣物質(zhì)(圖2b);家族史:母親患有相同甲損害，頸部、上胸部有多發(fā)性米粒至黃豆大黃白色皮下結(jié)節(jié)(圖2c)。

1．2 方法

1．2．1 外周血DNA提取患者簽訂遺傳學(xué)研究知情同意書后，對該家系2例患者和1例表型正常者進(jìn)行體格檢查并抽取外周靜脈血5 mL。隨機(jī)選取100名健康人靜脈血(本實(shí)驗(yàn)室保存)作為正常對照組。采用全血基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN，德國)提取基因組DNA，標(biāo)化濃度至35 ng/μL，以備下一步PCR擴(kuò)增和測序使用。

圖1 家系圖

圖2 先證者母親臨床表現(xiàn)2a中紅圈所示為先證者面部散在的淡黃色丘疹;2b先證者甲損害;2c先證者母親臨床表現(xiàn)

圖3 3a先證者KRT17外顯子第275位堿基A→G;3b先證者母親KRT17外顯子第275位堿基A→G;3c先證者父親KRT17外顯子正常;3d家系外正常對照KRT17外顯子正常

表1 KRT6b和KRT17基因的引物序列

1．2．2 PCR擴(kuò)增KRT6b和KRT17基因外顯子擴(kuò)增引物部分參考文獻(xiàn)［7］，部分通過NCBI和UCSC網(wǎng)站引物設(shè)計(jì)工具自行設(shè)計(jì)(表1)。引物合成由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。PCR體系為25μL:2× Taq Master Mix 12．5μL，上下游引物各1μL，DNA模板1μL，雙蒸水9．5μL。PCR條件:94℃預(yù)變性10 min，94℃變性30 s，59℃退火45 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)，72℃終末延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1．2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1．2．3 DNA測序與分析PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后送華大基因有限公司進(jìn)行DNA測序［AB3730XL測序儀(Applied Biosystems)］。測序峰圖采用Chromas軟件讀取，DNA序列采用NCBI網(wǎng)站“Standard Nucleotide BLAST”進(jìn)行序列比對分析。

2 結(jié)果

NCBI網(wǎng)站序列比對和DNA峰圖顯示，先證者及其患病母親KRT17基因1號外顯子存在錯義突變(c．275A＞G，p．Asn92Ser)，KRT6b基因未發(fā)現(xiàn)突變。而家系其他成員及正常對照人群未發(fā)現(xiàn)基因突變(圖3)。同時我們比對KRT17基因序列，找到該突變位置17－3780487－A－G(hg19)，查詢6萬人ExAC人類外顯子組整合數(shù)據(jù)庫(http://exac．broadinstitute．org/)，未發(fā)現(xiàn)該突變。

3 討論

臨床中多見的先天性厚甲主要有兩型:PC－I型和PC－II型。KRT6a和KRT16突變所致的PC－I型主要表現(xiàn)為指(趾)甲增厚，可伴有局限性的掌跖角化過度，手足部位多汗，毛周角化和空腔黏膜白斑等臨床表現(xiàn);KRT6b和KRT17突變所致的PC－II型除甲損害外還可伴有胎生牙、多發(fā)性脂囊瘤、毛發(fā)異常及聲音嘶啞等癥狀。本研究中先天性厚甲癥先證者在甲損害的同時伴胎生牙和多發(fā)性脂囊瘤，結(jié)合KRT17基因突變可明確診斷為PC－II型。

角蛋白是所有真核細(xì)胞維持細(xì)胞形態(tài)的重要結(jié)構(gòu)蛋白，可分為兩型:I型角蛋白(KRT9－20)為酸性，位于染色體17q12－q21;II型角蛋白(KRT1－8)為堿性，位于染色體12q11q－14［8，9］。1994年Munro將PC的致病基因定位于染色體17q12－q211，隨后研究逐漸發(fā)現(xiàn)PC的其他致病基因:KRT16、KRT17、KRT6a、KRT6b和KRT6c。角蛋白結(jié)構(gòu)中的螺旋區(qū)域分為1A、1B、2A和2B四個亞區(qū)，突變位點(diǎn)主要集中在高度保守的螺旋起始端1A區(qū)和螺旋末端2B區(qū)［10］，此區(qū)域發(fā)生突變會影響角蛋白絲的合成、穩(wěn)定及功能［11］。本研究發(fā)現(xiàn)的KRT17基因1號外顯子上突變位點(diǎn)(c．275A＞G)導(dǎo)致蛋白質(zhì)中第92位天冬氨酸變成絲氨酸，該位點(diǎn)正好位于角蛋白高度保守螺旋亞區(qū)1A的起始端。此突變位點(diǎn)在國內(nèi)外均有報道［12－18］，是PC－II型較常見的突變位點(diǎn)。

KRTl7是I型角蛋白，在甲床、毛囊、皮脂腺等皮膚附屬器中表達(dá)，正常表皮不表達(dá)［14］。研究發(fā)現(xiàn)N92S這一突變位點(diǎn)也是單純多發(fā)性脂囊瘤的致病突變，可見同一種突變可以引起兩種表型有重疊的不同疾?。?9，20］。有研究報道對攜帶此突變位點(diǎn)的PC－II型患者的脂囊瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)脂囊瘤囊壁上皮細(xì)胞異常表達(dá)KRT17［21］，證實(shí)了KRTl7基因突變在不同疾病的作用。另外，多發(fā)脂囊瘤通常發(fā)生于青春期之后，而PC－II型的脂囊瘤多發(fā)生于青春期之前［17］，提示我們除了基因突變之外還有其他因素影響疾病的臨床表型，如雄激素水平、生活環(huán)境等。對于先天性厚甲目前尚無有效的治療方法，針對此類疾病的基因治療還在研究階段，短期內(nèi)無法應(yīng)用于臨床。

總之，本研究在一個II型先天性厚甲家系患者中發(fā)現(xiàn)了KRT17基因第1號外顯子上存在錯義突變(c．275A＞G，p．Asn92Ser)，佐證了以往研究結(jié)果，為該病的產(chǎn)前咨詢、基因診斷以及未來的靶點(diǎn)基因藥物治療奠定了理論基礎(chǔ)。

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(收稿:2016－12－10修回:2016－12－27)

Detection of KTR gene mutations in a family with pachyonychia congenital type II

CAOJing1，SUNLele2，F(xiàn)UXi＇an2，WANGZhenzhen2，YUGongqi2，LIUHong2，ZHANGFuren1，2．
1．ShandongProvincialHospitalforSkinDiseases，ShandongUniversity，Jinan250022，China;2．Shandong ProvincialInstituteofDermatologyandVenereology，ShandongAcademyofMedicalSciences，Jinan250022，China
Correspondingauthors:ZHANGFuren，E－mail:zhangfuren@hotmail．com

Objective:To identify the mutations of KRT6b and KRT17 genes in a pedigree with pachyonychia congenita．Methods:Genomic DNA was extracted from peripheral blood of propositus，the parents and 100 healthy controls．The mother was a patient and his father was normal．All the exons of KRT6b and KRT17 genes were amplified by PCR，and the products were purified and directly sequenced to detect mutations．Results:A missense mutation of KRT17 gene(c．275A＞G)was identified in propositus and the mother，which was not found in the father and controls．No mutation of KRT6b was found in this family members and controls．Conclusion:A heterozygous missense mutation in KRT17(c．275A＞G，p．Asn92Ser)is the cause of the disease in the family．

pachyonychia congenita;gene mutation;KTR gene

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號:81601387)

1山東大學(xué)附屬省皮膚病醫(yī)院，山東大學(xué)，山東濟(jì)南，250022 2山東省皮膚病性病防治研究所，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東濟(jì)南，250022

張福仁，E－mail:zhangfuren@hotmail．com