針對糖尿病創(chuàng)口的抑菌敷料制備及促愈合性能評價

高層層， 王富平， 梁 敏， 孟 鑫， 陳忠敏

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

研究與技術(shù)

針對糖尿病創(chuàng)口的抑菌敷料制備及促愈合性能評價

高層層， 王富平， 梁 敏， 孟 鑫， 陳忠敏

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

針對糖尿病傷口難愈合的問題，以絲素蛋白、殼聚糖、生物活性玻璃及聚乙烯醇為原料，采用反復(fù)凍結(jié)-解凍法制備了抑菌促愈合傷口凝膠敷料，通過測定其吸水率、保水率、透水汽性能及抑菌性能，對其進行性能表征。并構(gòu)建了SD大鼠糖尿病皮膚創(chuàng)面模型，通過對創(chuàng)面愈合時間、創(chuàng)面愈合率進行研究，探討了該敷料對促進糖尿病皮膚創(chuàng)面愈合的效果。實驗結(jié)果表明，與市售的海藻酸鈉敷料、生物活性玻璃粉末和醫(yī)用紗布的促愈合性能相比，該敷料能加速創(chuàng)面的愈合，促進肉芽組織的生長。

糖尿?。粍?chuàng)口；抑菌敷料；絲素蛋白；創(chuàng)面愈合；性能評價

目前，糖尿病(diabete mellitus，DM)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，糖尿病病人傷口不易愈合，患者血液中高濃度的葡萄糖滲透到組織間，損傷機體組織和細胞的損傷修復(fù)系統(tǒng)[1]，并易引發(fā)傷口感染，包括革蘭氏陽性球菌、格蘭氏陰性桿菌在內(nèi)的多種需厭氧菌和真菌的混合感染[2]，使得糖尿病人傷口難以愈合。目前，臨床上使用的敷料主要有傳統(tǒng)敷料和新型濕性敷料。傳統(tǒng)敷料即紗布、碘仿紗條等，以傳統(tǒng)的保持創(chuàng)面干燥為指導(dǎo)原則進行換藥治療[3]，幾乎無促愈合功效。新型濕性敷料包括以透明薄膜式敷料為代表的覆蓋型外層敷料；以藻酸鹽敷料、傷口膠為代表的內(nèi)層填塞型敷料；以銀離子敷料為代表的抗菌性敷料等，以濕性愈合為原理，能創(chuàng)造利于細胞生長適宜的濕潤環(huán)境，敷料密閉或半密閉傷口能保持傷口恒溫，防止細菌及外界顆粒性異物侵入，減少傷口感染機會，促傷口愈合[4]。但其在濕潤環(huán)境下吸收滲液的特性及通透性差，最終出現(xiàn)感染情況多，成為醫(yī)學(xué)上難題。

絲素蛋白(silk fibroin, SF)是一種天然高分子蛋白質(zhì)，含有18種氨基酸，具有良好的生物相容性和可生物降解性[5]，對表皮細胞的生長有促進作用[6-7]，并有助于創(chuàng)面愈合[8]。殼聚糖(chitosan, CS)是一種天然多糖，廣泛存在于自然界，具有止痛、止血、促進傷口愈合，良好的生物相容性和抑菌性等優(yōu)異的性能，非常適于作為傷口敷料的原料[9]。生物活性玻璃(bioactive glass, BG)的主要成分為SiO2、CaO、P2O5，具有獨特的表面活性，鈣、磷等離子沉積生成支架狀羥基磷灰石層，使其具有巨大的比表面積，有利于細胞的黏附生長及血管和神經(jīng)長入[10-11]。另外，生物活性玻璃在被創(chuàng)面組織滲液溶解后，能在局部形成堿性環(huán)境，可發(fā)揮一定的抑菌作用，利于創(chuàng)面愈合[12]。聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)水凝膠具有親水性、柔軟性和良好的生物相容性，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域[13]。PVA水凝膠含有大量的水分，能夠使傷口處保持濕潤，同時可以吸收傷口滲液，保持傷口清潔。因此，天然高分子材料及生物活性玻璃的聯(lián)合使用，將會為難愈合傷口的治療帶來希望。

本研究以絲素蛋白、殼聚糖、生物活性玻璃、聚乙烯醇為原料，采用凍結(jié)-解凍法制備出水凝膠抑菌敷料，并利用鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)通過葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白進入細胞后，對胰腺胰島素誘發(fā)的抑制作用，構(gòu)建糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面模型，并研究敷料的相關(guān)性能及應(yīng)用于糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面的愈合效果。

1 實 驗

1.1 原料與試劑

家蠶繭殼(重慶市纖檢所)；透析袋(Solarbio，進口分裝，標(biāo)定截留相對分子質(zhì)量8 000～140 000)；無水乙醇、異丙醚、無水碳酸鈉、鹽酸、磷酸三乙酯、正硅酸乙酯、四水硝酸鈣、聚乙烯醇1799、檸檬酸、檸檬酸三鈉均為市售分析純；殼聚糖(<200 mPa·s，西亞試劑)；鏈脲佐菌素購于sigma；陸眠寧(吉林省華牧動物保健品有限公司)。

1.2 絲素蛋白的制備

將去除灰分和蠟質(zhì)物的繭殼放0.5% Na2CO3溶液中煮沸約3 h，去除絲膠。將除去絲膠的繭殼用去離子水洗凈后晾干，置于m(CaCl2)︰m(C2H5OH)︰m(H2O)=1︰2︰8的有機無機溶液中，水浴80 ℃下使絲素完全溶解，得到透明的絲素溶液，經(jīng)透析、抽濾、濃縮、冷凍干燥，得到純凈的絲素蛋白粉末。

1.3 生物活性玻璃粉末的制備

將各原料按照一定比例混合均勻，室溫下密閉攪拌1 h，在室溫下陳化3 d，得到均勻溶膠。將均勻溶膠放入75 ℃鼓風(fēng)干燥箱中1 d，得到均勻濕凝膠。將濕凝膠放150 ℃鼓風(fēng)干燥箱中，得到干凝膠粉末。再將干凝膠放入馬弗爐中，700 ℃維持2 h，待冷卻后取出，即得到生物活性玻璃粉末。將生物活性玻璃研磨后過篩，得到粒徑為75～100 μm的生物活性玻璃粉末。

1.4 抑菌促愈合敷料的制備

在室溫下，將絲素蛋白溶液和生物活性玻璃混合均勻后，再加入殼聚糖溶液和聚乙烯醇溶液攪拌成混合溶液，攪拌約30 min；將混合溶液倒入模具中，于-20 ℃冷凍8～10 h，再于室溫下解凍，如此反復(fù)3次，即可得到能夠促進難愈合傷口愈合的敷料材料(本文稱為抑菌促愈合敷料)。

1.5 動物模型構(gòu)建及分組

實驗選擇由重慶市大坪醫(yī)院動物中心提供的體重為200 g左右的雄性SD大鼠[14]，適應(yīng)環(huán)境3 d，實驗組喂食高糖高脂飼料，對照組喂食普通飼料，4周后腹腔注射STZ。實驗前禁食不禁水12 h[15-16]，按30 mg/kg腹腔注射STZ，隔日注射，注射在腹腔同側(cè)[17]，注射后單籠飼養(yǎng)。對照組按30 mg/kg腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射后3 d的空腹血糖≥11.1 mmol/l[18]即為成模標(biāo)準(zhǔn)。連續(xù)3周監(jiān)測大鼠血糖值，實驗組繼續(xù)喂食高糖高脂飼料以維持高血糖。3周后，以0.6 mL/kg肌肉注射陸眠寧麻醉大鼠，將大鼠背部除毛，生理鹽水擦洗干凈，碘伏擦拭消毒。剪刀、鑷子等浸入醫(yī)用酒精中消毒。以大鼠脊柱為中線，制作三個邊長約為1 cm的背部全層皮膚切除創(chuàng)面。按照雙盲隨機法，使用抑菌促愈合敷料、市售海藻酸鈉敷料、生物活性玻璃粉末及醫(yī)用紗布外敷創(chuàng)面，四者均用紗布固定，隔日換藥。

1.6 創(chuàng)面用敷料的性能評價

為使病人在傷口愈合期間能保持傷口舒適，敷料的主要功能體現(xiàn)在以下幾方面：①吸收傷口滲液；②提供濕潤環(huán)境；③抑制細菌滋生；④促進傷口愈合；⑤提供營養(yǎng)物質(zhì)。從以上要求可得出要測定敷料的吸水率、保水率、透水汽性能及抑菌性能。

1.6.1 吸水率和保水率的測定

室溫下，將一定質(zhì)量的敷料浸入去離子水中24 h，濾紙吸干表面水分稱其質(zhì)量為m1，濾紙包裹敷料放入離心機中離心10 min(10 000 r/min)，離心后稱重為m2，將敷料放入105 ℃烘箱中3 h，直至稱其質(zhì)量為恒重，記為m0。其吸水率qx、保水率qb按下式計算：

(1)

(2)

1.6.2 透水汽性能的測定

配置A液(8.3 g NaCl+0.277 g CaCl2+1 000 mL去離子水)，取20 mL A液于透濕杯中，將敷料切割成杯口大小，放置杯口并用螺栓固定，將透濕杯放于37 ℃烘箱中。在實驗開始前及24 h后稱取透濕杯質(zhì)量，減少的質(zhì)量為液體透過敷料散發(fā)到環(huán)境中的質(zhì)量。若透濕杯的內(nèi)直徑為D，24 h內(nèi)減少的質(zhì)量為W，敷料的透水汽性R按下式計算：

(3)

式中：R為敷料的透水汽性，g/(m2·d)；W為24 h內(nèi)減少的質(zhì)量，g；D為透濕杯的內(nèi)直徑，m。

1.6.3 抑菌性能測定

將凍干敷料材料浸入PBS緩沖液中(0.2 g/mL)，37 ℃恒溫浸提24 h。以此為原液，分別得到0.2、0.1、0.05、0.025 g/mL的浸提液，分別研究對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及綠膿桿菌的抑菌性。

1.7 糖尿病模型評價

每周記錄大鼠體重，測量血糖值并計算臟器系數(shù)。對比注射STZ前后大鼠體重、血糖值及臟器系數(shù)的變化。

1.8 創(chuàng)面愈合評價

觀察術(shù)后各時間點傷口愈合情況，記錄創(chuàng)面愈合時間。用拍照法記錄創(chuàng)面面積，計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率/%=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

各組實驗數(shù)據(jù)均用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，所得數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗組間差異的顯著性用單因數(shù)方差分析進行檢驗，p<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸分析結(jié)果檢測

由表1分析結(jié)果顯示，絲素蛋白中含有18種氨基酸，其中絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸質(zhì)量分數(shù)較高，易被人體吸收利用，可為傷口處組織提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進傷口的愈合。

表1 絲素蛋白氨基酸組成分析結(jié)果

2.2 生物活性玻璃的XRD分析

如圖1所示，生物活性玻璃呈現(xiàn)出寬闊、彌散、尖銳的衍射峰，說明是非晶態(tài)或無定形態(tài)無機固體顆粒。其中Si-O-Si、P-O-P、Si-O-P鍵的鍵角均在一定范圍內(nèi)變動，不具有固定的鍵角和晶格間距，使得非晶態(tài)物質(zhì)具有短程有序、長程無序的結(jié)構(gòu)，它們是以非晶態(tài)為主要特征。

圖1 生物活性玻璃的XRD圖譜Fig.1 X-ray diffraction map of bioactive glass

2.3 敷料的性能

2.3.1 敷料的吸水率和保水率

隨著敷料中殼聚糖比例的增加，敷料的吸水率和保水率均增加，說明殼聚糖具有較好的吸水性能和保水性能，可有效吸收傷口滲出液，并能維持傷口處濕潤，避免傷口干燥，有利于傷口的愈合。

2.3.2 敷料的透水汽性能

理想的敷料應(yīng)能夠?qū)谕杆士刂圃谝欢ǚ秶鷥?nèi)[19]：正常皮膚為204 g/(m2·d)，受傷皮膚為279～5 238 g/(m2·d)，推薦的醫(yī)用敷料的透水汽率為2 500 g/(m2·d)。隨著殼聚糖比例的增加，制備的難愈合傷口敷料的透水汽率減少。由表2可知，在m(CS)︰m(PVA)為4︰6時的透水汽率最接近醫(yī)用敷料推薦值。

表2 抑菌促愈合傷口敷料的物理性能

2.3.3 敷料的抑菌性

圖2 敷料浸提液的抑菌性Fig.2 Antibacterial property of leaching solution of wound dressing

2.4 注射STZ前后大鼠體重、血糖值的變化

圖3(a)(b)為注射STZ前后大鼠的體重值變化情況。從圖3(a)可以看出，在注射STZ之前，實驗組和對照組的大鼠體重均呈現(xiàn)穩(wěn)步上升趨勢。從圖3(b)可看出，實驗組大鼠體重值呈下降趨勢，而對照組大鼠體重持續(xù)上升。在注射STZ 2周內(nèi)體重減少(p<0.05)，但在2周后體重明顯下降(p<0.01)，可能繼續(xù)喂食高糖高脂飼料使得大鼠糖尿病病情加重。圖3(c)(d)為注射STZ前后大鼠的血糖值變化情況。由圖3(c)可知，實驗組和對照組大鼠的血糖值均維持在正常水平。從圖3(d)可以看出，實驗組大鼠注射STZ后，血糖值急劇上升(p<0.01)，達到了糖尿病血糖水平，繼續(xù)喂食高糖高脂飼料，大鼠的血糖值亦會繼續(xù)上升。對照組大鼠血糖值一直穩(wěn)定在正常水平。

*表示p<0.05,**表示p<0.01 vs 對照組，w為周(即7 d)圖3 注射STZ前后SD大鼠的體重及血糖值Fig.3 Weight and blood glucose level of SD rats before and after STZ injection

2.5 注射STZ前后大鼠臟器系數(shù)的變化

圖4為注射STZ前后SD大鼠各臟器系數(shù)變化情況。從圖4(a)可以看出，高糖高脂組與對照組肝臟系數(shù)基本一致，注射STZ會對肝臟產(chǎn)生損傷。從圖4(b)可以看出，高糖高脂組與對照組腎臟系數(shù)基本一致，注射STZ會對腎臟產(chǎn)生損傷，腎臟系數(shù)呈上升趨勢(p<0.05)。從圖4(c)可以看出對照組大鼠與高糖高脂組大鼠脾臟系數(shù)基本一致，STZ對脾臟也有一定的影響(p<0.05)。從圖4(d)可以看出，高糖高脂喂食對胸腺損傷不明顯，注射STZ會對胸腺造成損傷(p<0.05)，大鼠胸腺明顯萎縮，體積減小。

*表示p<0.05 vs對照組, #表示p<0.05 vs 高糖高脂組，w為周(即7 d)對照組， 高糖高脂組， 高糖高脂+STZ組圖4 注射STZ前后SD大鼠臟器系數(shù)的變化Fig.4 Changes in organ coefficients of SD rats before and after STZ injection

2.6 大鼠創(chuàng)面愈合情況

通過對創(chuàng)面的肉眼觀察(圖5)可以看出，2 d時，海藻酸鈉敷料組傷口處有部分肉芽組織形成，抑菌促愈合敷料組傷口表面有一層白色物質(zhì)生成，生物活性玻璃粉末組也有部分白色物質(zhì)生成。4 d時，抑菌促愈合敷料組創(chuàng)面減小，生物活性玻璃粉末組創(chuàng)面也有減小，其他兩組均未發(fā)生明顯變化。8 d時，抑菌促愈合傷口敷料組創(chuàng)面明顯減小，肉芽組織充滿創(chuàng)面，創(chuàng)面顏色變淡，海藻酸鈉組亦形成肉芽組織，創(chuàng)面有所減小，生物活性玻璃粉末組創(chuàng)面也明顯減少，并有肉芽組織生成，空白對照組有部分肉芽組織生成。10 d時，抑菌促愈合敷料組新生上皮組織已大部分覆蓋創(chuàng)面，海藻酸鈉組創(chuàng)面明顯減小，生物活性玻璃粉末組創(chuàng)面愈合速度超過海藻酸鈉組，空白對照組創(chuàng)面減小不明顯。12 d時，抑菌促愈合敷料組新生上皮組織已完全覆蓋創(chuàng)面，傷口完全愈合，海藻酸鈉組創(chuàng)面減小但未完全愈合，生物活性玻璃粉末組亦未完全愈合，空白對照組有肉芽組織形成，創(chuàng)面有一定減小。

圖5 糖尿病大鼠術(shù)后各時間點創(chuàng)面愈合情況Fig.5 The wound healing of diabetic rats at different time points

從創(chuàng)面愈合時間(圖6)可以看出，抑菌促愈合敷料組平均愈合時間為(11.2±0.5)d，海藻酸鈉敷料組為(16.1±0.67)d，生物活性玻璃粉末組為(15±0.5)d，空白對照組為(20.5±1.2)d，且抑菌促愈合敷料組與空白對照組相比有顯著性差異(p<0.05)，抑菌促愈合敷料組愈合時間明顯短于海藻酸鈉敷料組、生物活性玻璃粉末組及空白對照組(p<0.05)。

從創(chuàng)面愈合率(圖7)來看，同一時相點抑菌促愈合敷料的愈合率明顯高于海藻酸鈉敷料組、生物活性玻璃粉末組和空白對照組(p<0.05)，愈合較快。

*表示p<0.05 vs 空白對照組, #表示p<0.05 vs 海藻酸鈉敷料組, ^表示p<0.05 vs 生物活性玻璃粉末組圖6 各組創(chuàng)面的愈合時間Fig.6 Healing time of wounds in each group

#表示p<0.05 vs 空白對照組, *表示p<0.05 vs 海藻酸鈉敷料組, ^表示p<0.05 vs 生物活性玻璃粉末組圖7 各組創(chuàng)面各時相點的創(chuàng)面愈合率Fig.7 Wound healing rate of each group at different time points

3 結(jié) 論

1)殼聚糖具有較強的吸水率和保水率，聚乙烯醇的透水汽性良好，在m(CS)︰m(PVA)為4︰6時透水汽率達到2 460 g/(m2·d)，最為接近醫(yī)用敷料的理想值2 500 g/(m2·d)，同時，吸水率和保水率分別達到了23.70%和8.10%，能夠吸收傷口滲液并傷口保持濕潤。

2)抑菌促愈合敷料具有較好的抑菌性，隨浸提液濃度的增加抑菌性增強。其中，抑菌性從大到小的順序為：大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，綠膿桿菌。

3)高糖高脂喂食SD大鼠4周后腹腔注射STZ能夠使大鼠血糖急劇升高，體重減少，出現(xiàn)“三多一少”的癥狀。大鼠的臟器系數(shù)也會發(fā)生變化，尤以胸腺系數(shù)變化最為明顯。

4)抑菌促愈合敷料能夠促進糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面的愈合，平均愈合時間為(11.2±0.5)d。愈合時間明顯少于市售海藻酸鈉敷料組、生物活性玻璃粉末組和空白對照組。

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Preparation of antibacterial dressing for diabetic wound and evaluation of its perfortmance of promoting healing

GAO Cengceng, WANG Fuping, LIANG Min, MENG Xin, CHEN Zhongmin

(Pharmaceutical and Biological Engineering Colleage, Chongqing University of Technology, Chongqing 400054, China)

It is hard for diabetic wounds to heal. For this problem, silk fibroin (SF), chitosan (CS), bioactive glass (BG) and polyvinyl alcohol (PVA) were used as raw materials, and repeated freezing-thawing method was employed to prepare antimicrobial wound healing dressing. Its performance was characterized by determining the water absorption, retention rate, water vapor permeability and antibacterial properties. In addition, the diabetic skin wound model of SD rats was established. The wound healing time and wound healing rate were studied, and the effect of the wound dressing on the healing of diabetic skin was discussed. The results show that the wound dressing could accelerate the wound healing and promote the growth of granulation tissue, compared with the commercially available alginate dressing, bioactive glass and medical gauze.

diabetes; wounds; antimicrobial wound dressing; silk fibroin; wound healing; performance evaluation

10.3969/j.issn.1001-7003.2017.03.003

2016-09-06;

2016-12-28

重慶市社會民生科技創(chuàng)新項目(cstc2016shmszx 0635)

TQ314.1

A

1001-7003(2017)03-0013-07 引用頁碼: 031103